Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em Drosophila

Summary

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Abstract

O estabelecimento de circuitos neuromusculares funcionais depende de conexões precisas entre desenvolvimento de axônios motores e músculos alvo. Os neurônios motores estendem os cones de crescimento para navegar por caminhos específicos, respondendo a uma grande quantidade de pistas de orientação axônica que emanam do ambiente extracelular circundante. O reconhecimento do alvo do cone de crescimento também desempenha um papel crítico na especificidade neuromuscular. Este trabalho apresenta um protocolo de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. Este protocolo inclui algumas etapas importantes, incluindo um procedimento de genotipagem, para classificar os embriões mutantes desejados; Um procedimento de imunomarquação, para marcar embriões com anticorpo fasciclin II (FasII); E um procedimento de dissecação, para gerar preparações em filetes a partir de embriões fixos. As projeções do axônio do motor e os padrões musculares na periferia são muito melhor visualizados em preparações planas de embriões em filetes do que em whEmbriões de montagem clara. Portanto, a preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo, e também pode ser aplicado tanto às telas genéticas de perda de função como de ganho de função .

Introduction

As conexões precisas e seletivas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento embrionário são essenciais para a locomoção normal em larvas de Drosophila . O padrão embrionário de 30 fibras musculares em cada um dos hemisegmentos abdominais A2-A7 é estabelecido pelo estágio 16 ¹ . Os 36 neurônios motores que são gerados no nervo ventral prolongam seus axônios na periferia para inervar os músculos alvo específicos ² . A identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo podem ser visualizados por imuno-histoquímica com um anticorpo (anticorpo monoclonal de mouse 1D4)

Protocol

1. Preparação

1. Preparar 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com solução de t-octilfenoxipoletoxietanol (PBT) adicionando 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5 mL de t-octilfenoxipoletoxietanol (ver Tabela de Materiais) a 500 mL de PBS 1X E mexendo durante pelo menos 30 min. Armazenar a 4 ° C. Use quando relativamente fresco e guarde a solução em uma garrafa limpa.
2. Faça 10 mL de paraformaldeído a 4% adicionando 2,5 mL de solução de paraformaldeído em estoque a 16% e 1 mL de PBS 10x a 6,5 ​​mL de água desionizada. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana.
   CUIDADO: Evite o contato da pele com a solução de paraforma....

Results

As conexões precisas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento neural dependem da repulsão axônica-axônica seletiva e do reconhecimento de alvo em pontos de escolha específicos ⁴ . Em Drosophila , a repulsão seletiva entre axônios motores é em parte regulada pela ação combinada de semaforinas de classe 1 e 2 (Semas), incluindo Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b ^{8 , 14 ,}

Discussion

Os detalhes dos defeitos de orientação do axônio do motor são mais rápidos e com melhor precisão pela preparação em filetes de embriões corados com DAB do que por microscopia confocal de varredura laser de marcadores fluorescentes. Portanto, a preparação em fileira de embriões corados fixos e 1D4 é mais adequada para a caracterização funcional de moléculas de orientação. Quatro principais classes de dicas de orientação, incluindo netrins, Slits, semaforas (Semas) e ephrins, e seus receptores cognatos têm papéis evolutiv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyetoxyethanol
16% Solução de paraformaldeído	Ted Pella	18505
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S5886
Cloreto	de potássio Sigma-Aldrich	P5405
Fosfato de Sódio Dibásico	Sigma-Aldrich	30435
Fosfato de Sódio Monobásico	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrato	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosídeo galactopiranosídeo)
Dimetil Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado	Sigma-Aldrich	P9387
Hexacianoferrato de potássio (III)	Sigma-Aldrich	244023
Peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidina Tetracloridrato	Sigma-Aldrich	D5905
Ágar	US Biológico	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Prato de Cultura (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	Este é usado para fazer uma gaiola de copo de plástico para coleta de embriões.
Levedura	Société Industrielle Lesaffre	Saf Levedura Instantânea Algodão Vermelho
Cotonete (Algodão de Ponta Única de Madeira PK100)	VWR	14220-263
Tubo Eppendorf (1,5 ml)	Sarstedt	#72.690
Alvejante	The Clorox Company	Clorox
Heptano	Sigma-Aldrich	246654
Metanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Estudos de desenvolvimento de anticorpos anti-fasciculínio II	Banco de hibridoma	1D4 anti-fasciclina II
anticorpo anti-rato-HRP de cabra	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F (ab ') < sub > 2< / sub> Fragmento de cabra anti-mouse IgG + IgM (H + L) < br / > (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glicerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Seringa	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Agulha de Tungstênio	Ted Pella	#27-11	ø 0,13 mm / 6,1 m (ø. 005"/20 pés)
Nutator (Mini twister)	KO coreano da ciência	. VS-96TWS	Alternativamente, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)