Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Resumo

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Resumo

Os tamanhos enormes das famílias do receptor (OR) odorant mamíferos apresentam dificuldades para encontrar seus cognatos ligantes entre numerosos produtos químicos voláteis. Para eficiência e precisão deorphanize ORs, podemos combinar o uso de uma linha de celular heteróloga para expressar ORs mamíferos e um plasmídeo geneticamente modificado biosensor para medir a produção de acampamento a jusante de ativação OR em tempo real. Este ensaio pode ser usado para tela odorantes contra ORs e vice-versa. Interações de odorante-receptor positivo das telas podem ser posteriormente confirmadas por teste em relação a várias concentrações de odor, gerando curvas concentração-resposta. Aqui nós usamos este método para executar um rastreio do elevado-throughput de um composto odoríferos contra uma biblioteca de OR humano expressos nas células Hana3A e confirmou que o receptor está respondendo positivamente é o receptor cognato para o composto de interesse. Encontramos este método de deteção de alta produtividade para ser eficiente e confiável na avaliação da ativação OR e nossos dados fornecem um exemplo de seu uso potencial em estudos funcionais de OR.

Introdução

O sentido do olfato desempenha um papel importante na sobrevivência dos animais, como eles dependem de suas habilidades olfativas para obter alimentos, evitar predadores e perigo, distinguir a espécie e selecione companheiro^1,2. A realização dessas funções depende os receptors odorant (SRO), que individualmente são expressos na superfície ciliar dos neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizada no epitélio olfativo (OE). RUP constituem a maior família da superfamília de receptores (GPCR) G-proteína juntamente com aproximadamente 400 e 1200 diversas OR genes em humanos e rato, respectivamente

Protocolo

1. Culturing e manutenção de células Hana3A

1. manter as células em 10 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% soro bovino fetal (FBS), 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B em um 100-mm placa de cultura de células em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C com 5% de CO ₂. Com cada outra passagem, adicionar 1 puromicina µ g/mL para manter estável transfection de plasmídeos (ver introdução).
   Nota: Executar todas as etapas que envolvem a cultura de células em uma classe de segurança biológica II para garantir ambiente esterilizado.
2. Subcultura na proporção de 10-20% em 100mm pratos c....

Resultados

Muscona é o principal componente aromático de almíscar natural. Recentes estudos de OR5AN1 identificado como um receptor humano para muscona e outros compostos de almíscar macrociclos com base na homologia com o mouse ou, MOR215-1, clonado de glomérulos muscona-responsivos em comportar-se de ratos^37,38. Selecionando o repertório OR humano, nosso grupo e o grupo de Touhara também identificado OR5AN1 como um grande receptor para doi.......

Discussão

Medir com precisão a ativação de um Bo após exposição a um determinado odorant é o primeiro passo para decifrar a codificação da informação olfactiva. Os experimentos mostrado neste estudo representam que um exemplo de como um pode identificar, usando um em vitro sistema de expressão OR, RUP ágil entre o repertório OR humano para o produto químico odoríferos de interesse e posteriormente, caracterizando o receptor Farmacologia, utilizando diferentes concentrações do produto químico. Nossos resultados confirmam O.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anfotericina B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor reagente cAMP Promega		E1290
pGloSensor-20F plasmídeo cAMP	Promega	E1171
Células			disponíveis nos autores mediante solicitação
HBSS, sem cálcio ou magnésio	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
Plasmídeo			clonado em um vetor de expressão de mamíferos, como pCI
MEM, com EBSS e L-glutamina	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OU plasmídeos clonados	com uma etiqueta Rho em um vetor de expressão de mamíferos
PBS, sem cálcio ou magnésio	Cellgro	21-040-CV
Penicilina-estreptomicina	Hyclone	SV30010
Plasmid miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromicina	Sigma	P8833
Plasmídeo			clonado em um vetor de expressão de mamíferos, como pCI
Tripsina-EDTA	Hyclone	SH30236
tubo de PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
1,5 mL Tubo Eppendorf Eppendorf
15 mL 17 mm x 120 mm tubo cônico	BD Falcon	352096
pipetman multicanal de 8 poços e/ou 12 poços	Eppendorf
Placa de cultura de células brancas de fundo plano de 96 poços	Greiner	655098
placa de cultura de células de 100 mm x 20 mm	BD Falcon	353003
Classe II com fluxo
laminarIncubadora de cultura de células, com 5% de CO2
Centrífuga, com rotor de balde oscilante para tubos
Leitor de placas Infinite F200	Microscópio
com objetivas
Espectrofotômetro
Reservatórios de reagentes estéreis para distribuição
Papel toalha

Hana3A M3R como pCI RTP1S cônicos de 15 ml de contraste de fase Tecan x10 e x20multicanal estéril