Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumo

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Resumo

O mapeamento genômico de interações proteína-DNA é crítico para a compreensão da regulação de genes, remodelação de cromatina e outros processos residente em cromatina. A reticulação de formaldeído seguida de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (X-ChIP-seq) tem sido usada para obter muitas informações valiosas sobre a biologia do genoma. No entanto, X-ChIP-seq tem limitações notáveis ​​ligadas à reticulação e sonicação. O ChIP nativo evita essas desvantagens ao omitir reticulação, mas muitas vezes resulta em uma recuperação fraca de proteínas ligadas à cromatina. Além disso, todos os métodos baseados em ChIP estão sujeitos a considerações de qualidade de anticorpos. Métodos enzimáticos para mapear interações proteína-DNA, que envolvem a fusão de uma proteína de interesse para uma enzima modificadora de DNA, também foram utilizados para mapear interações proteína-DNA. Recentemente, combinamos um desses métodos, clivagem endógena de cromatina (ChEC), com sequenciação de alto rendimento como ChEC-seq. ChEC-seq depende da fusão de uma cromatina-assocProteína de interesse para a nuclease microcócica (MNase) para gerar clivagem de DNA direcionada na presença de cálcio nas células vivas. O ChEC-seq não se baseia na imunoprecipitação e evita possíveis preocupações com reticulação, sonicação, solubilização da cromatina e qualidade de anticorpos, ao mesmo tempo que fornece mapeamento de alta resolução com sinal mínimo de fundo. Nós imaginamos que o ChEC-seq será uma contrapartida poderosa para o ChIP, proporcionando um meio independente para validar as descobertas do ChIP-seq e descobrir novas idéias sobre a regulação genômica.

Introdução

O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) ¹ , para contornar essas desvantagens.

Protocolo

1. Geração de cepas de fermento

1. Gerar uma cepa de fermento com o fator de interesse etiquetado com MNase.
   1. O PCR amplifica a cassete de marcação MNase do vetor desejado ( Tabela 1 ) usando a mistura de reação especificada ( Tabela 2 ) e condições de ciclagem ( Tabela 3 ). Misture 5 μL da reação de PCR e 1 μL de corante de carga de DNA 6X. Execute cada alíquota de PCR em um gel de agarose a 0,8% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de ~ 2,3 kb.
   2. Transforme a cassete de marcação amplificada para a tensão de escolha usando a transformação padrão de acetato ....

Resultados

No caso de um experimento de ChEC bem sucedido, a análise do DNA por eletroforese em gel de agarose revelará um aumento dependente do cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado por manchas e eventual digestão completa do DNA genômico. Em alguns casos, observa-se uma escala de bandas semelhante à observada com uma digestão MNase tradicional após a digestão prolongada. Este é o caso da análise ChEC do Reb1, um fator regulatório geral que liga as regiões com insufici.......

Discussão

Mostramos que o ChEC pode mapear diversas classes de proteínas de levedura na cromatina e antecipar que será amplamente aplicável a diferentes famílias de TFs e outros fatores de ligação à cromatina na levedura. O ChEC-seq é vantajoso porque não requer reticulação, solubilização da cromatina ou anticorpos. Assim, o ChEC evita artefactos potencialmente presentes no X-ChIP-seq, como o artefato ^{3 , 4} e o Chip nativo hiper-ChIPable, como os falsos negativos devido à.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
dNTPs	NEB	N0447
Q5 DNA polimerase de alta fidelidade	NEB	M0491L	Outras DNA polimerases de alta fidelidade, como Phusion, podem ser usadas para amplificação de.
Escada de DNA TrackIt 1 Kb Plus	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polimerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini coquetel de inibidor de protease sem EDTA	Sigma-Aldrich	11836170001	É importante que uma mistura de inibidores de protease sem EDTA seja usada, de modo a não inibir a clivagem da MNase por quelação de Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, EMD	Millipore	300410-250MG	Faça um estoque de 2% dissolvendo 20 mg de digitonina em 1 mL de DMSO com vórtice vigoroso.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Os grânulos semelhantes a ampures podem ser gerados usando um protocolo publicado (ref 24).
Rack magnético MagneSphere	Promega	Z5342

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