Artigo de método

Citometria de Fluxo de Imagem Microfluídica por Microscopia Óptica de Tempo-estiramento com detecção assimétrica (ATOM)

DOI:

10.3791/55840

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28 de junho de 2017

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1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a implementação de um sistema de microscopia óptica de estiramento de tempo de detecção assimétrica para imagens de célula única em fluxo microfluídico ultra-rápido e suas aplicações em citometria de fluxo de imagem.

Resumo

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Escalar o número de parâmetros mensuráveis, que permite análises de dados multidimensionais e, portanto, resultados estatísticos de maior confiança, tem sido a principal tendência no desenvolvimento avançado de citometria de fluxo. Notavelmente, adicionar recursos de imagem de alta resolução permite a complexa análise morfológica de estruturas celulares / sub-celulares. Isso não é possível com citometros de fluxo padrão. No entanto, é valioso para o avanço do conhecimento das funções celulares e pode beneficiar a pesquisa de ciências da vida, diagnósticos clínicos e monitoramento ambiental. A incorporação de capacidades de imagem na citometria de fluxo compromete o rendimento do ensaio, principalmente devido às limitações de velocidade e sensibilidade nas tecnologias da câmera. Para superar essa velocidade ou desafio de produção enfrentando a citometria de fluxo de imagem, preservando a qualidade da imagem, demonstrou-se que o microscópio óptico de estiramento de tempo de detecção assimétrica (ATOM) possibilita a imagem de célula única de alto contrasteCom resolução sub-celular, a uma taxa de transferência de imagens de até 100.000 células / s. Com base no conceito de imagem da imagem de estiramento temporal convencional, que se baseia na codificação e recuperação de imagens totalmente ópticas através do uso de pulsos de laser de banda larga ultra-rápidos, o ATOM avança ainda mais o desempenho da imagem, aumentando o contraste da imagem de células não marcadas / não coradas. Isso é conseguido ao acessar a informação de gradiente de fase das células, que é codificada espectralmente em pulsos de banda larga de disparo único. Por isso, ATOM é particularmente vantajosa em medidas de alto rendimento de morfologia e textura de célula única, indicativa de tipos de células, estados e funções par. Em última análise, isso pode se tornar uma poderosa plataforma de citometria de fluxo de imagem para a fenotipagem biofísica de células, complementando o atual teste celular baseado em marcador bioquímico de última geração. Este trabalho descreve um protocolo para estabelecer os módulos-chave de um sistema ATOM (do frontend óptico para dados pBackend de rocessamento e visualização), bem como o fluxo de trabalho de citometria de fluxo de imagem baseada em ATOM, utilizando células humanas e microalgas como exemplos.

Introdução

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A imagem óptica apresenta uma ferramenta poderosa e um ensaio baseado em células para (quase) não invasivamente visualizar a distribuição espacial detalhada de muitos componentes celulares / subcelulares, descobrindo assim uma multiplicidade de assinaturas morfológicas, biofísicas e biomoleculares das células. No entanto, esta capacidade de extrair informações de alto conteúdo de células únicas geralmente foi comprometida quando uma enorme e heterogênea população de células teve que ser investigada. Isso marca um trade-off comum em ensaios baseados em células entre a taxa de transferência e o conteúdo. Um exemplo notável é que a adição de capacidade de imagem para a ....

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Protocolo

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1. Preparação da amostra

  1. Preparação da amostra (células aderentes, células MCF-7)
    1. Retire o prato de cultura celular da incubadora e drene o meio de cultura.
    2. Enxágüe as células num prato com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio de cultura excessivo.
    3. Adicionar 3 mL de uma solução de tripsina 0,25% ao prato de cultura (diâmetro de 100 mm) e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 de 37 ° C e 5% durante 4 min.
      NOTA: A tripsina dissolve a proteína adesiva das células para que elas se separem do prato de cultura.
    4. Verifique se todas as células se separaram do prato de....

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Resultados

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Este trabalho ilustra duas demonstrações de imagens de célula única por ATOM: uma com células de mamífero (células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e células de câncer de mama (MCF-7)) e outra com fitoplâncton s (Scenedesmus e Chlamydomonas). O primeiro experimento foi motivado pelo interesse crescente pela biópsia líquida pela detecção, enumeração e caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) no sangue 23 . A capacidade .......

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Discussão

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Existem vários detalhes técnicos que exigem atenção especial durante a configuração do sistema ATOM. Em primeiro lugar, é essencial notar que a iluminação assimétrica / oblíqua codificada especificamente pode introduzir componentes residuais de gradiente de fase ( ou seja, o efeito de sombreamento) no contraste de absorção e influenciar o aumento do contraste de gradiente de fase em ATOM. Portanto, esse efeito de iluminação oblíqua deve ser minimizado. Em segundo lugar, deve-se enfatizar que o esquema de multip.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Sr. P. Yeung pela preparação do MCF-7 para nós. Este trabalho foi parcialmente apoiado por subsídios do Conselho de Bolsas de Pesquisa da Região Administrativa Especial de Hong Kong, China (Projeto nº 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 e HKU 720112E), o Programa de Apoio à Inovação e Tecnologia (ITS / 090/14 ), E o Fundo de Desenvolvimento Universitário da HKU.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Objetivas de Fisiologia de Fluorita Nikon Plan 40XLenteobjetiva Nikon MRF07420(Obj2)
Objetiva de fluorita plana Olympus, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40XLente objetiva OlympusRMS40X-PF(Obj1)
Lentes plano-convexas N-BK7ThorlabsLA1145-CPara retransmissão de chuveiro espectral
Pacote de colimação de fibra FC/APCThorlabsF220APC-1064Para a saída e coleta de pulsos de laser
Divisor de feixe de películaThorlabsBP145B3Para fazer réplica de feixe
Espelho de prata protegidoThorlabsPF10-03-P01Para refletir luz
800-1650nm 12GHz monomodo DC-acoplado NIR Fotorreceptor Newport1544-BPara converter luz em sinal elétrico
Infiniium Osciloscópiode alto desempenhoAgilentDSOX91604APara salvar os sinais elétricos convertidos em luz
HI1060 fibra ópticaCorningHI1060Fibra óptica para estiramento de tempo
AMPLIFICADOR DE FIBRA DOPADA COM ITÉRBIOKeopsysKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAAmplificador óptico em linha
Gradeholográfica Wasatch Photonics020305-6Grade
Infundir / Retirar Seringa BombasHarvard ApparatusPHD 2000Bomba de seringa para carregamento de amostras em canais microfluídicos

Referências

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  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic ph....

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