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Um método de isolamento do romance grau clínico para rim humano Perivascular de células do estroma

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DOI:

10.3791/55841

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7 de agosto de 2017

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1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um método de isolamento e cultura de romance grau clínico para rim perivasculares células do estroma (kPSCs) com base na perfusão de órgão inteiro com enzimas digestivas e enriquecimento de NG2-célula. Com este método, é possível adquirir o número suficiente de células para terapia celular.

Resumo

Células estromais mesenquimais (MSCs) são tecidos homeostático e imune moduladora células que têm demonstrado efeitos benéficos em transplante e doenças renais. Células do estroma perivascular (EPS) compartilham características com medula óssea MSCs (bmMSCs). No entanto, eles também possuem, provavelmente devido a impressão local, propriedades de tecido-específica e desempenhar um papel na homeostase do tecido local. Essa especificidade de tecido pode resultar em reparação de tecidos específicos, também dentro do rim humano. Mostramos anteriormente que PSCs rim humano (kPSCs) têm melhorado o ferimento epitelial renal, Considerando que bmMSCs não tem esse potencial de cura. Além disso, kPSCs amenizar de lesão renal em vivo. Portanto, kPSCs constituem uma fonte interessante para terapia celular, especialmente para doenças renais e transplante renal. Aqui nós mostramos o método de isolamento e cultura detalhado para kPSCs de transplante-grau rins humanos com base na perfusão de todo órgão de enzimas digestivas, através da artéria renal e enriquecimento para o marcador perivascular NG2. Desta forma, as quantidades de células grandes podem ser obtidas que são apropriados para terapia celular.

Introdução

Células estromais mesenquimais (MSCs) são células do sistema imunológico moduladora que foram originalmente isoladas a partir da medula óssea. Eles são caracterizados por seu eixo em forma de morfologia, capacidade de se diferenciarem em gordura, osso e cartilagem e aderência de plástico. MSCs expressam os marcadores do estroma CD73, CD90, CD105 sendo negativo para os marcadores CD31 e CD451,2,3. MSCs são um candidato promissor para terapia celular, devido ao seu tecido homeostático e capacidades de imunomoduladores. bmMSCs, atualmente, estão sendo estudados em ensaios clínicos para várias doenças, incluindo doenças renais e transplante de rim, como comentado em outro lugar4.

Anteriormente foi mostrado que perivasculares células de vários órgãos sólidos diferentes, incluindo o tecido adiposo, placenta e músculo esquelético compartilham características com MSCs9. No entanto, estas células também apresentam funções específicas do tecido, que podem resultar em reparação de organotypic10. Células humanas perivascular miocárdica, por exemplo, estimularam angiogênico respostas após hipóxia e diferenciados em cardiomyocytes, enquanto perivascular de células isoladas de outros tecidos não mostrou esses potenciais11.

Perivascular de células do estroma também podem ser isoladas do rato12,13,14 e15,de rim humano16. Nós extensivamente caracterizada kPSCs e comparei estas para bmMSCs. Descobrimos que kPSCs, semelhantes ao bmMSCs, têm capacidades de imunossupressores e pode apoiar a formação do plexo vascular. Entretanto, há tecido específicas diferenças entre os tipos de célula, como kPSCs mostrou uma assinatura de expressão transcricional de organotypic, incluindo os fatores de transcrição nefrogênico, HoxD10 e HoxD11. kPSCs, em contraste com o bmMSCs, não sofrem transformação Miofibroblasto após estimulação com TGF-β e não foram capazes de se diferenciar em adipócitos. Além disso, o kPSCs acelerado integridade epitelial em um ensaio zero ferimento epitelial tubular renal, um fenômeno que não foi observado com bmMSCs. Esta ferida reforçada reparação foi mediada através da liberação de fator de crescimento do hepatócito. Além disso, kPSCs amenizada lesão renal em um modelo do rato do15. lesão renal aguda. Portanto, kPSCs parecem ter capacidades de reparação renal superior e são uma interessante fonte nova para a terapia celular em doenças renais.

A fim de ser capaz de usar kPSCs para fins de terapia celular, kPSCs deve ser isolado de forma clínica grau com grau clínico enzimas e protocolos. Além disso, para ser capaz de tratar vários pacientes com kPSCs de 1 doador, número suficiente de células deve ser obtido. Aqui nós mostramos em detalhes, o procedimento de isolamento clínico da classe de kPSCs de rins de transplante de todo ano, produzindo um número suficiente de células a ser usado para terapia celular clínica.

Protocolo

O comitê de ética médica local e o conselho consultivo de ética do consórcio europeu (STELLAR) aprovaram a pesquisa e a coleta de rins de grau de transplante humano descartados principalmente por razões cirúrgicas. O consentimento da pesquisa foi dado para todos os rins.

1. Preparações para cultura celular

  1. Prepare um pool de lisados de plaquetas.
    1. Armazenar as plaquetas vencidas por menos de 2 d em -80 °C até o uso (por no máximo 1 ano).
      NOTA: As plaquetas foram originalmente provenientes de um fornecedor comercial. Foram obtidos excedentes hospitalares distribuídos pelo banco de sangue local.
    2. Descongelar as plaquetas de, pelo menos, 5 dadores (de preferência 10) O/N a 4 °C.
    3. Agrupe as plaquetas em um frasco grande e estéril, transfira para tubos de centrífuga cônicos e gire para baixo por 10 min a 1.960 x g a 4 ° C.
      NOTA: O volume de plaquetas depende do número de doadores e da quantidade de material excedente hospitalar por doador.
    4. Pipete o sobrenadante para bolsas de sangue (50 mL / bolsa) através do cilindro de uma seringa de 50 mL. Conservar a -80 °C.
  2. Preparação do meio de cultura celular.
    1. Descongelar um saco de lisados de plaquetas em banho-maria a 37 °C.
    2. Adicione 1 L (ou seja, 2 frascos) de Meio Essencial Mínimo - modificação alfa (alphaMEM), 5 mL de glutamina 200 mM e 20 mL de penicilina (5.000 U / mL) / estreptomicina (5.000 μg / mL) (caneta / estreptococos) ao saco.
    3. Incubar durante 3 h a 37 °C.
    4. Agite o saco para remoção de gelificação batendo suavemente no saco quando o saco estiver apoiado em uma superfície plana.
    5. Filtre o meio lisado de plaquetas a 5% puxando os lisados através do filtro do sistema de transfusão com uma seringa estéril de 50 mL.
    6. Alíquota do meio em tubos de 50 mL e armazenar em -80 °C até o uso.
      NOTA: Cada novo lote de lisados de plaquetas é testado em cultura de células e comparado ao lote anterior por células de interesse em crescimento (bmMSCs ou kPSCs) para confluência em ambos os lotes. Em número de células e viabilidade, as kPSCs ou bmMCs cultivadas no novo lote não devem diferir mais de 10%, e a expressão dos marcadores de CD73, CD90, CD105 e CD31, CD34 e CD45, conforme analisada por citometria de fluxo, não deve diferir. Os métodos de cultura celular são descritos na secção 6 do protocolo (Cultura de kPSC).

2. Preparações para a colheita de células

  1. Preparação de soluções.
    1. Prepare o meio simples adicionando 10 mL de caneta / estreptococo a 500 mL (1 frasco) do Meio Essencial Mínimo (DMEM) -F12 de Dulbecco.
    2. Prepare o meio de lavagem adicionando 50 mL de soro humano normal (NHS) e 10 mL de caneta / estreptococo a 1 frasco de DMEM-F12.
    3. Prepare o tampão de estoque enzimático adicionando 2,9 mL de ácido 1 M 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 1,2 mL de NaHCO3 2,5% [p / v] e 160 μL de CaCl2 (1 M) a 160 mL de solução da Universidade de Wisconsin.
    4. Prepare a solução de colagenase adicionando lentamente 20 mL de tampão de estoque de enzima ao frasco de colagenase de grau GMP contendo >2.000 U / frasco de colagenase. Dissolver a 4 °C durante cerca de 40 min. Agite suavemente várias vezes durante o período de dissolução.
    5. Prepare o meio de congelamento adicionando 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) a 45 mL de NHS.
  2. Preparação da bandeja de perfusão (Figura 1A).
    1. Limpe a cabine de fluxo e cubra com cortinas cirúrgicas. Aqueça um banho-maria a aproximadamente 40 - 45 ° C para aquecer a bandeja de perfusão a 37 ° C. Coloque aventais cirúrgicos e luvas cirúrgicas.
    2. Conecte uma bandeja de perfusão esterilizada ao banho-maria para pré-aquecer a bandeja de perfusão com água morna. Certifique-se de que não há ar na bandeja de perfusão, começando com a bandeja de perfusão na posição vertical. Se necessário, adicione mais água ao banho-maria para evitar a infusão de ar na bandeja de perfusão.
    3. Coloque o tubo LS25 na bomba. Deixe as duas extremidades estéreis do tubo no gabinete de fluxo. Coloque uma pinça de Kocher em uma extremidade do tubo e deixe descansar no fundo da bandeja de perfusão. Coloque uma gaze estéril em cima do tubo para evitar obstrução. Conecte um conector Luer na outra extremidade do tubo.
    4. Adicione aproximadamente 100 mL de meio puro na bandeja de perfusão e comece a lavar o tubo a uma velocidade de bomba de 100 mL / min.

3. Isolamento de células renais

  1. Preparação do rim.
    1. Remova o rim das bolsas duplas estéreis e coloque-o na bandeja de perfusão estéril (Figura 1B). Remova o tecido adiposo perirrenal e a cápsula renal com tesoura e lacrimejamento suave (Figura 1C) e identifique a artéria renal no remendo aórtico conforme mostrado em Figura 1D.
    2. Canule a artéria renal com o espigão acessório, fixe com um tie-rip esterilizado e prenda à extremidade do tubo da bomba com o conector Luer enquanto a bomba estiver ligada. Se os tubos não estiverem completamente cheios, primeiro adicione mais meio à bandeja e lave os tubos iniciando a bomba (Figura 1E - F). Lave o rim com meio simples através da bomba com um fluxo de 100 mL / min.
  2. Tratamento com colagenase e isolamento de células renais.
    1. Adicione colagenase (20 mL, >2.000 U) e DNase (2,5 mL, 1 mg / mL) à bandeja de perfusão ( Figura 1G). Vire o rim de vez em quando suavemente com a mão. Espere até que o rim fique mole e o líquido de perfusão se torne menos transparente (aproximadamente 30 - 40 min).
    2. Massageie suavemente o rim (Figura 1H) até obter uma suspensão celular (Figura 1I). Remova o material não digerido e o pico na artéria renal.
  3. Lavagem e coleta de células renais.
    1. Adicione 50 mL do NHS à suspensão celular. Drene a suspensão celular da bandeja de perfusão colocando a bomba em fluxo baixo e colocando o tubo primeiro conectado ao rim acima dos tubos de 50 mL (Figura 1J).
    2. Centrifugar a 300 x g durante 7 min a 4 °C e remover o sobrenadante. Lave os pellets com meio de lavagem contendo 10% de NHS e centrifugue novamente a 300 x g por 7 min. Repita a lavagem mais uma vez. Meça o volume dos grânulos celulares e adicione um volume igual de meio de cultura celular.
    3. Criopreserve as células daqui adicionando meio de congelamento 1:1 à suspensão celular e armazene em frascos criogênicos de acordo com os protocolos padrão, ou continue a cultivar as células (seção 4).
      NOTA: A suspensão celular contém aglomerados celulares e requer etapas extras para obter células únicas, o que resulta em um aumento na morte celular. Portanto, as células são mantidas em suspensão e não são contadas nesta fase.

4. Cultura de células renais brutas

  1. Adicionar aproximadamente 1 ml da suspensão celular a 24 ml de lisados de plaquetas a 5% de alfaMEM (meio de cultura celular) num balão de cultura celular T175 (Figura 1K) e cultura a 37 °C, 5% CO2. Remova o meio e os detritos celulares após 2 dias das células aderentes e atualize o meio com 25 mL de meio de cultura celular.
  2. Atualize o meio de cultura duas vezes por semana, removendo metade do meio (12,5 mL) e adicionando meio fresco (12,5 mL) usando técnicas assépticas.
  3. Cultura até confluente (geralmente 5 - 7 d) (Figura 1L). Remover o meio, lavar duas vezes com PBS e tripsinizar as células adicionando 5 ml de tripsina a cada balão T175 durante 5 min a 37 °C. Lavar em meio de cultura e centrifugar a 490 x g durante 5 min e remover o sobrenadante.

5. Enriquecimento Celular para NG2 por Separação Magnética de Células (Figura 1M)

  1. Prepare o tampão de separação de células de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Ressuspenda os kPSCs tripsinizados em tampão de separação de células de 10 mL. Centrifugue a 490 x g durante 5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em tampão de separação celular de 300 μl.
  3. Adicione 100 μL de reagênico bloqueador de FcR / 5 x 107 células, adicione 100 μL de grânulos antimelanoma (NG2) por 5 x 107 células e incube por 30 min a 4 ° C. Separe a fração positiva para NG2 de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione 10 mL de meio e centrifugue as células por 5 min a 490 x g.
  4. Conte as células usando uma câmara de contagem Bürker de acordo com o protocolo do fabricante. Semear as células em um frasco de cultura (aproximadamente 4 x 103 células/cm2) e incubar.
    NOTA: Semeie as células nas seguintes concentrações: < 250.000 em um frasco T25, 250.000 - 500.000 em um frasco T75 e 700.000 - 800.000 em um frasco T175. Após o enriquecimento da célula magnética, uma fração positiva de aproximadamente 1 - 2% é isolada. No entanto, como esta etapa é o enriquecimento celular e não a classificação celular, outros tipos de células estarão presentes na cultura (Figura 1N). Após várias passagens (geralmente em torno de 4 - 5), apenas uma população homogênea de kPSC está presente (Figura 1P).

6. Cultura de kPSCs

  1. Atualize o meio duas vezes por semana, removendo metade do meio e substitua-o por meio de cultura recém-descongelado (Figura 1N).
    NOTA: Os kPSCs tendem a ser mais viáveis e proliferativos quando apenas metade do meio é atualizado.
  2. Passagem de kPSCs.
    NOTA: Passe os kPSCs em 90 - 100% de confluência, ou quando estruturas 3D aparecerem (ver Figura 1O), ou quando não houver crescimento celular por mais de uma semana. Os dois últimos, em particular, podem ocorrer nas primeiras passagens após o enriquecimento celular. Nesse caso, após a passagem, as células geralmente começam a crescer novamente em cultura de monocamada (Figura 1P).
    1. Remova o meio das células confluentes de 90 a 100% (guarde o meio para uso posterior). Lavar o balão duas vezes com PBS (1 ml em T25, 5 ml em T75, 10 ml em T175). Adicionar tripsina (0,5 ml em T25, 2 ml em T75, 5 ml em T175) e incubar durante 5 min a 37 °C. Adicionar o meio antigo ao balão e ressuspender suavemente.
    2. Transfira para um tubo de 15 ou 50 mL (dependendo do volume) e centrifugue a 490 x g por 5 min. Conte as células viáveis e a placa <250.000 em um T25, 250.000 - 500.000 em um T75 ou 700.000 - 800.000 em um T175 (aproximadamente 4 x 103 células / cm2).
  3. Teste os kPSCs na passagem 5 ou 6 (por exemplo, ensaio de risco, seção 7).
    NOTA: Caracterize as células propagadas por citometria de fluxo usando protocolos padrão. A expressão dos marcadores de NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC deve ser positiva e CD31, CD34, CD45 e HLA-DR devem ser negativos. Teste para micoplasma, bactérias e fungos no meio de cultura de acordo com os protocolos padrão do laboratório de microbiologia clínica. Teste os kPSCs funcionalmente em um ensaio de arranhão de ferida epitelial renal. Os experimentos são geralmente realizados com populações homogêneas de kPSC estéreis, confirmadas por citometria de fluxo, com capacidade de cicatrização de feridas entre as passagens 6-8.
  4. Criopreservar os kPSCs adicionando 0,5 mL de meio de criopreservação a 0,5 mL de suspensão celular (2 milhões de células por mL de meio de cultura) usando protocolos padrão.
    NOTA: Após o descongelamento, semeie os kPSCs em uma densidade mais alta (106 células em um T175).

7. Teste funcional de kPSCs: ensaio de arranhões de feridas epiteliais renais

  1. Cultive os kPSCs em uma placa de 6 poços a uma densidade de 200.000 células/poço em meio de cultura de 2 mL. Após 48 h de cultura a 37 °C, 5% de CO2, coletar o sobrenadante. Este é o meio condicionado.
  2. Semeie o HK-2 (células epiteliais tubulares proximais)17 em 2 mL de meio de células epiteliais tubulares proximais (PTEC) consistindo em uma proporção de 1:1 de DMEM-F12 suplementado com insulina (5 mg/mL), transferrina (5 mg/mL), selênio (5 ng/mL), hidrocortisona (36 ng/mL), triiodotironina (40 pg/mL), fator de crescimento epidérmico (10 ng/mL) e caneta/estreptococo, em uma densidade de 500.000 células por poço em uma placa de cultura de células de 6 poços.
  3. Cultura por 48 h a 37 °C, 5% CO2. Remova o meio de cultura de células dos HK-2s e crie uma ferida de arranhão na monocamada de HK-2s fazendo um arranhão com a ponta de uma pipeta amarela de cima para baixo do poço. Lave os HK-2s com PBS e adicione o meio condicionado dos kPSCs ou meio de controle. Marque na parte inferior da placa a área a ser fotografada.
    NOTA: Os HK-2s devem ser confluentes. Imagem de duas áreas por poço.
  4. Fotografe o arranhão em 4, 8, 12 e 24 h na mesma posição marcada com um microscópio de campo claro invertido.
  5. Meça a área de risco na Imagem J usando a ferramenta de seleção de polígonos para determinar a porcentagem de fechamento.

Resultados

O método de isolamento de kPSCs de grau clínico está resumido na Figura 1. Células de rim bruto são isoladas humano transplante de rins de grau por perfusão de colagenase. A suspensão resultante é cultivada até confluente em 5% plaquetas lisados. Em seguida, a fração de células estromais perivascular é isolada com base na expressão de NG2.

kPSCs são plásticas aderentes células fusiformes(Figura 2)e são positivos para os marcadores de marcadores do estroma CD73, CD90, CD105 e perivascular NG2, PDGFR-B e CD146, enquanto negativo para CD31 e CD34, CD45, HLA-DR (Figura 2B). Normalmente, uma população homogénea de kPSCs pode ser alcangada na passagem 4 e kPSCs chegar a senescência em torno de passagem 9-10 (Figura 2C). Portanto, aconselhamos a realizar experimentos entre passagem 5-8.

Para avaliar a capacidade funcional da kPSCs isolada, realizamos um em vitro rim epiteliais ferido zero ensaio sobre cada novo lote de kPSCs, como mostramos anteriormente que o meio condicionado de kPSCs pode acelerar epiteliais cicatrização neste ensaio zero15. O meio condicionado kPSC feito pelo cultivo kPSCs por 48 h em alphaMEM 5% plaquetas lysates e recolher o sobrenadante. Em seguida, o rim humano imortalizado túbulo proximal células epiteliais (HK-2)17 são cultivadas até confluente e então feita uma ferida zero. Então ou o meio condicionado de médio kPSCs ou controle é adicionado aos poços e mede-se a velocidade de cicatrização de feridas. Quando o meio condicionado de kPSCs é adicionado, a ferida fecha significativamente mais rápido (Figura 2D).

figure-results-1
Figura 1 : Clínica grau isolamento método de humano kPSCs. Transplante de rins de grau são canulados e pintados com colagenase através da artéria renal (A - G) e a suspensão de células resultante é lavada e também criopreservadas ou colocado em cultura (H - K). Depois que as células alcançar confluência (L), NG2 célula enriquecimento é executada (M). As células são trypsinized quando eles também são confluentes, pararam de se proliferando ou quando estruturas 3D aparecem (N - P). Os critérios de liberação de kPSCs são a esterilidade, expressão do marcador e a capacidade de melhorar a cicatrização da ferida epitelial tubular (Q). Seta: artéria renal. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: kPSCs caracterização de humano. Um) kPSCs são células aderentes fusiformes, plásticas. B) kPSCs são positivos para marcadores mesenquimais CD73, CD90, CD105, perivascular marcadores NG2, PDGFR-β e CD146, enquanto negativo para CD31 e CD34 CD45. kPSCs expressar o MHC-classe eu (HLA-ABC), mas não a classe II (HLA-DR). C) características de crescimento de três diferentes kPSC doadores de citometria de fluxo confirmaram homogênea NG2 populações positivas (na passagem 4). kPSCs chegar a senescência em torno de 9-10 de passagem. D) kPSCs são capazes de aumentar a reparação epitelial de rim em um ensaio de risco de ferimento. Imagens representativas de controle médio e médio kPSC condicionado em t = 0, 4, 8 e 12 h são mostrados. Barra de escala na) = 200 µm, em D) = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Perivasculares células têm sido isoladas de muitos diferentes sólidos órgãos, incluindo o rim9,15,16, cartilagem, gordura e pâncreas humanos. A maioria dos métodos, no entanto, são baseados em pequenas amostras de tecido, que são dissecados e posteriormente tratadas com enzimas digestivas. Além disso, isso geralmente não é executado com produtos grau clínico. Isto faz estas estratégias menos adequados para tradução clínica direta onde grandes quantidades de células de grau clínico são necessárias.

Aqui nós mostramos um método de isolamento de novela de kPSCs humana para órgãos inteiros, com base na perfusão com grau clínico enzimas e materiais. O protocolo é uma adaptação do protocolo de isolamento clínico ilhotas de Langerhans atualmente em uso para aplicação clínica em nosso centro de18.

Este é o primeiro método de grau clínico onde grandes quantidades de kPSCs podem ser alcançadas. A variabilidade no rendimento de célula é largamente dependente de doador. No entanto, quando o rendimento de célula que atualmente obtemos de uma fração da suspensão celular bruto de três diferentes doadores é extrapolado, em teoria, poderia ser alcançado um rendimento médio de 2,7 x 1012 kPSCs por doador. Como terapia MSC normalmente consiste de 2 infusões de célula com 1-2 x 106 células/kg corpo peso4, esses números de celular são suficientes para tratamento alogênico de vários pacientes.

Um passo crítico no processo de isolamento é a duração da digestão de colagenase. Quando o período de digestão é muito curto, grandes aglomerações de tecido continuará a ser, que será mais difícil para a cultura. Quando o período de perfusão é muito longo, pode ser observada morte celular aumentada. Portanto, quando o rim começa a se tornar macio e os fluidos menos transparentes, o rim deve ser massageado suavemente e o tratamento de colagenase deve ser interrompido.

Outro passo crítico é a cultura das células após enriquecimento de célula NG2. Às vezes após o enriquecimento de célula NG2, as células de perivascular não começam a proliferar, ou começar a crescer em estruturas 3D. Neste caso, quando as células são trypsinized e propagado novamente, as células geralmente vão começar a crescer na cultura de monocamada.

Como material de partida, rins de grau de transplante humano descartados principalmente por razões cirúrgicos foram usados. Estes são órgãos funcionais sem fibrose principal. Reconhecemos que essa poderia ser uma limitação, pois esta é uma doença relativamente rara e difícil de obter a fonte do órgão. Rins explantados podem ser outra fonte; no entanto, dependendo a razão da explantação rim, estes rins podem conter mais fibrose e, portanto, miofibroblastos e, portanto, os cuidados devem ser tomados desde myofibroblasts podem ser isoladas e cultivadas em vez de células perivasculares.

Como o kPSCs isolado com esse show de protocolo Propriedades organo-quar com rim epitelial ferida cura capacidades15, terapia celular, com kPSCs em doenças renais e transplante seria uma interessante aplicação futura. Para este efeito, existem várias estratégias de entrega de produtos de célula/célula. A primeira estratégia é a infusão IV de kPSCs, como usado atualmente nos estudos clínicos bmMSC. Outra aplicação interessante é o uso de kPSCs ou fatores kPSC-excretado na perfusão da máquina antes do transplante. Desta forma, a qualidade do rim explantado pode melhorar o que pode levar a função renal melhorou após transplante. Para ambas as estratégias, kPSCs são uma interessante fonte de novas células para explorar para fins clínicos.

Divulgações

D.G.L., M.A.E, e T.J.R. estão associados com um pedido de patente em relação esta pesquisa. Os outros autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) sob o número 305436 do contrato de concessão estelar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Baxter ensacaFenwalR4R-7004
Plaquetas humanasSanquinmaterial excedente hospitalar expirado por menos de 2 d é usado
lisadofeito sob medida
Garrafas estéreis descartáveisCorning09-761-11
Tubos de centrífuga PP de 500 mLCorning431123
a-MEM médioLonzaBE12-169F
glutamaxthermo fisher35050038
caneta/estreptococos de transfusão de 15070063Invitrogen
Codan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Soro Humano Normal (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7,5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWPonte para a vida32911
HeparinaLeo Pharma
colagenase NB1 grau GMPSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
campos cirúrgicos3M NederlandDH999969404
bomba de perfusãometrohmx007528300
cabeça de bombametrohmx077202600
bandejatubos
masterflex LS25MasterflexHV-96410-25
espigão de acessóriosGambro DASCO6038020
pulmozymeRoche
frascos de cultura 25 CM2GreinerBalão de
75 CM2Greiner658170
Balão de cultura 175 CM2Greiner661160
Tripsinasigmat4174
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR bloqueando o reagentemiltenyi130-059-901
anti grânulos do melanoma (NG2)miltenyi130-090-452
filtro da pilha 70 µ mCorning352350
LS colunasMiltenyi130-042-401
MACS ímãmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r R& Mouse Dmab 1263
IgG1 FITCBD 
mouse IgG1 PEBD 
mouse IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
cabra anti rato PEDakoR0480
azida sódicaMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (insulina, transferrina, selênio)SigmaI1884
hidrocortisonaSigmaH0135
triiodotironinaSigmaT5516
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)sigmaE9644
PTEC renal humano imortalizado (HK2)cortesia de M. Ryan, faculdade universitária de Dublin
de plaquetas Sistema de perfusão feitos sob medida cultura 690175 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Referências

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