Indução de diferenciação celular e imagens de células Vibrio parahaemolyticus Células Swimmer e Swarmer

Summary

Este protocolo permite a microscopia de célula única do nadador Vibrio parahaemolyticus diferencialmente diferenciado e células swarmer. O m�odo produz uma popula�o de c�ulas swarmer facilmente dispon�eis para a an�ise de uma �ica c�ula e abrange a prepara�o de culturas de c�ulas, indu�o de diferencia�o de swarmer, prepara�o de amostra e an�ise de imagem.

Abstract

A capacidade de estudar a localização intracelular de proteínas é essencial para a compreensão de muitos processos celulares. Por sua vez, isto requer a capacidade de obter células únicas para microscopia de fluorescência, o que pode ser particularmente desafiador quando imagens de células que existem dentro de comunidades bacterianas. Por exemplo, o agente patogénico humano Vibrio parahaemolyticus existe como células de nadador em forma de bastão curto em condições líquidas que, ao contacto com a superfície, se diferenciam numa subpopulação de células swarmer altamente alongadas, especializadas para crescimento em superfícies sólidas. Este artigo apresenta um método para realizar a análise de microscopia de fluorescência de célula única de V. parahaemolyticus em seus dois estados diferenciais. Este protocolo induz com muita reprodutibilidade a diferenciação de V. parahaemolyticus num ciclo de vida de células mais swarmer e facilita a sua proliferação sobre superfícies sólidas. O método produz flares de células de swarmer diferenciadas que se estendem de tEle borda do enxame-colônia. Notavelmente, na própria ponta do enxame-flares, swarmer células existem em uma única camada de células, o que permite a sua fácil transferência para um microscópio slide e posterior fluorescência microscopia imagiologia de células únicas. Além disso, é apresentado o fluxo de trabalho de análise de imagem para a representação demográfica de sociedades bacterianas. Como prova de princípio, é descrita a análise da localização intracelular de matrizes de sinalização de quimiotaxia em nadadores e células swarmer de V. parahaemolyticus.

Introduction

As bactérias experimentam constantemente mudanças em seu ambiente externo e desenvolveram várias técnicas para mudar e adaptar seu comportamento de acordo. Um desses mecanismos envolve a diferenciação em diferentes tipos de células que melhor complementam o ambiente alterado. A diferenciação muitas vezes envolve grandes mudanças na regulação do ciclo celular, morfologia celular e organização espaciotemporal das células. Um organismo que pode sofrer diferenciação é Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertence às Vibrionaceae , que é uma família de proteobactérias que habitualmente habitam água fresca ou salgada. Vibrionaceae são amplamente distribuídos no ambiente e incluem várias espécies que causam infecções do trato intestinal em seres humanos, incluindo também Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus é um organismo dimórfico e é capaz de se diferenciar em dois tipos de células distintas como resposta para acomodar mudançasMeio externo. Em ambientes aquosos, existe como uma célula de nadador em forma de bastão com um único flagelo polar posicionado no antigo pólo da célula. No contato superficial, a diferenciação em uma célula swarmer é acionada. A diferenciação celular de Swarmer envolve duas alterações principais: a morfogénese das células mais vivas através da inibição da divisão celular e a indução de um segundo sistema de flagelos. Isto resulta na formação de uma célula swarmer em forma de bastão peritricos e altamente alongada, que pode continuar o estilo de vida do swarmer, onde os eventos de divisão resultam em células de progenitor swarmer, ou alternativamente diferenciar de volta para as células nadadoras.

Vários fatores têm sido relatados para induzir ou influenciar a diferenciação de swarmer. O estímulo primário parece ser conduzido por mechanosensing onde V. parahaemolyticus usa o flagelo polar como um sensor tátil que detecta a inibição da rotação em contato de superfície, mas vários outros fatores estão envolvidos comoPoço ¹ . No laboratório, a rotação do flagelo polar pode ser artificialmente inibida pela adição de fenamil, que bloqueia a rotação flagelar accionada pelo canal de sódio, induzindo assim a diferenciação do swarmer ² . Além disso, em um estudo anterior, Vibrio alginolyticus foi induzido a enxamear em meio sólido quando as células foram propagadas em meio de crescimento em uma placa de Petri selada com fita de plástico transparente. O papel de filtro saturado com alcali impediu o enxameamento nestas condições, sugerindo assim que um ou mais ácidos voláteis poderiam estar envolvidos na indução do enxame. Assim, vedar a placa de Petri com fita plástica permitiu provavelmente a acumulação de ácidos voláteis, formados como subprodutos do metabolismo celular, dentro do espaço da cabeça da placa. O mesmo efeito foi conseguido quando H ₂ O ₂ foi adicionado ao meio de crescimento em placas de Petri não seladas de modo a produzir artificialmente ácidos voláteis por hidrólise de componentes de meios 3 ^{, 4 , 5} . No entanto, a identidade de tais ácidos voláteis permanece desconhecida. Além disso, tem sido demonstrado que a disponibilidade excessiva de cálcio ⁶ e limitação de ferro ⁷ aumenta a diferenciação e proliferação de swarmer sobre superfícies sólidas. As células podem ser privadas de ferro por adição do composto 2,2'-Bipyridyl ao meio de crescimento, que tem sido mostrado para influenciar a diferenciação swarmer [ ^8] . Os factores conhecidos para regular a diferenciação são agora implementados na concepção de um protocolo que induz reprodutivamente a diferenciação de V. parahaemolyticus em células swarmer e a sua proliferação em superfícies sólidas de agar.

A diferenciação de V. parahaemolyticus envolve grandes alterações na regulação da divisão celular, morfologia celular e posicionamento de máquinas macromoleculares como flagellA e aparelhos de quimiotaxia - processos que requerem a localização específica de proteínas de acordo com o ciclo celular. Assim, a capacidade de estudar a localização intracelular de tais proteínas é essencial para a compreensão dos processos celulares acima mencionados. Para realizar tais estudos, a microscopia de fluorescência em células individuais é necessária. Isto pode ser particularmente desafiador quando imagens de células que existem dentro de populações bacterianas densas, como é o caso de células swarmer. Tem havido tentativas de induzir a diferenciação de swarmer em meios líquidos, que poderiam potencialmente gerar células individuais para estudos de microscopia. E embora a nível transcricional estas células tenham induzido parcialmente o programa de diferenciação de swarmer, não sofrem as mesmas alterações morfológicas distintas que as células swarmer totalmente diferenciadas crescidas em meio sólido ⁸ . Este trabalho oferece um protocolo robusto e reprodutível de um método para induzir ceLl em uma superfície de ágar. O protocolo produz uma população de células swarmer facilmente acessíveis prontamente disponíveis para microscopia de célula única e análise subsequente. Além disso, o protocolo permite estudos de localização de proteínas fluorescentemente marcadas em ambos os tipos de células nadadoras e swarmer (seções 1, 2, 3, 4). Além disso, o protocolo descreve o fluxo de trabalho subseqüente sobre como processar e analisar os dados gerados a partir de experiências de microscopia de fluorescência, o que permite a análise demográfica de sociedades bacterianas (seção 5).

Protocol

1. Preparação de células V. parahaemolyticus electro-competentes e electroporação de ADN plasmídico em células nadadoras

NOTA: A seguinte secção do protocolo permite a preparação de células electro-competentes e a subsequente electroporação de ADN plasmídico em células nadadoras. Este passo é importante se as proteínas fluorescentes estiverem sendo ectopicamente expressas a partir de um plasmídeo.

1. Eliminar as células de V. parahaemolyticus a partir de uma pasta de glicerol a -80 ° C sobre uma placa de agar LB fresca contendo 100 ug / mL de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C.
2. No dia seguinte, inocular 200 mL de meio LB com uma única colónia de V. parahaemolyticus e incubá -la a 37 ° C em condições de agitação até se atingir uma _DO600 de 1,0. Geralmente leva 5-6 h de incubação para que a cultura celular alcance a densidade óptica desejada.
3. Imediatamente transferir as células para gelo e perfTodas as outras etapas em gelo e em centrífugas pré-arrefecidas a 4 ° C.
4. Colher as células a 4 ° C durante 10 min a 2000 x g.
5. Descartar o sobrenadante por decantação e re-suspender o sedimento celular em 25 mL de solução de sacarose 273 mM gelada (pH 7,4, tamponada com KOH).
6. Recolher as células novamente a 4 ° C durante 10 min a 2000 x g. Repita duas vezes adicionais.
7. Re-suspender o sedimento de células lavadas em 400 μL de solução de sacarose 273 mM gelada. Subsequentemente, adicionar o glicerol até uma concentração final de 15% vol / vol. As células estão agora prontas para electroporação, mas também podem ser congeladas em alíquotas de 70 μL a -80 ° C para utilização posterior.
8. Para a electroporação, misturar uma alíquota de 70 μL de células eletro-competentes com 100 - 1.000 ng de DNA plasmídico e transferir a mistura para uma cubeta de eletroporação gelada (0,2 cm de espaçamento entre eletrodos). Efectue a electroporação com as seguintes definições: 25 μF, 2400 V e 200 Ω.
9. Suspender oNa cubeta de electroporação em 600 μL de caldo LB, transferir para um tubo de 2 mL e incubar enquanto se agita a 37 ° C durante 3 h.
10. Girar as células a 2.000 xg durante 5 min e voltar a suspender o sedimento em 100 μL de caldo LB. Espalhar a suspensão de células em placas de agar LB selectivas contendo os antibióticos necessários e incubar a 37 ° C durante a noite.
11. No dia seguinte, verifique as placas para a formação de colônias. As colónias que crescem possuem o gene de resistência ao antibiótico correcto codificado no plasmídeo e podem agora ser utilizadas para experiências adicionais.

2. Indução da Diferenciação de Células Swarmer

NOTA: As etapas a seguir descrevem como induzir a diferenciação de V. parahaemolyticus em seu ciclo de vida celular swarmer e como estimular a proliferação em superfícies sólidas.

1. Suspender 4 g de Agar de Infusão de Coração (HI) em 100 mL de ddH ₂ O para preparar as placas em expansão.
2. Cuidadosamente ferver a solução de ágar HI no microondas e agitar o frasco de vez em quando até que o pó é dissolvido. Autoclave a 121 ° C durante 20 min.
3. Após autoclavagem, arrefecer o ágar HI para 60-65 ° C. Adicionar 2,2'-bipiridilo a uma concentração final de 50 uM (solução de reserva de 50 mM em etanol a 100%). Adicionar CaCl2 a uma concentração final de 4 mM (solução-mãe de 4 M em ddH ₂ O). Se necessário, adicionar antibióticos na solução para manter os plasmídeos.
   NOTA: Se estiver planejando usar um plasmídeo induzível, adicione o agente indutor à sua concentração final.
   PRECAUÇÃO: 2,2'-Bipiridilo: Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação). Use luvas e óculos de segurança ao manusear este produto químico.
4. Despeje 30 - 35 mL da solução de agar HI final numa placa de Petri redonda de 150 mm e deixe a ágar solidificar.
5. Logo antes de se detectar a cultura de células, seca-se a placa de ágar a 37 ° C durante pelo menos 10 minutos (ou até que qualquer resíduo líquido tenha disaPpeared, mas não mais) acima-direito com uma tampa aberta.
   NOTA: Os tempos de secagem dependem muito da incubadora utilizada e as placas fortemente secas não permitirão o enxameamento de V. parahaemolyticus . (Esta etapa é muito importante!) As placas devem ser usadas frescas e não devem ser mais velhas do que 2 - 3 h. As placas velhas estarão muito secas para estimular o enxameamento.
6. Inocular uma pequena quantidade de células da borda de uma única colônia em 5 mL de caldo LB. Incubar a cultura agitando a 37 ° C até OD ₆₀₀ = 0,8 é atingido, normalmente leva cerca de 2-3 horas. Depois disso, as c�ulas est� prontas para serem manchadas em placas de agar de enxame HI.
7. Spot 1 μL de cultura de células no centro de uma placa de agitação de agar HI ( Figura 1A ).
8. Deixe a mancha seca ( Figura 1B ).
9. Selo a placa com fita de plástico transparente e certifique-se que está firmemente anexado, caso contrário, pode desligar durante a noite de incubação ( Figura 1C ).
   NOTA: ÉMuito importante que o selo é perfeito. Evite a formação de bolhas de ar e dobras para a fita quando é aplicado.
10. Incubar a placa a 24 ° C durante a noite. Isto resultará na formação de uma colônia de enxames de V. parahaemolyticus com ardências que se estendem a partir da periferia da colónia de enxames ( Figura 2 ).

3. Preparação de V. parahaemolyticus Swarmer Cells for Fluorescence Microscopy

NOTA: O protocolo seguinte descreve como preparar lâminas de agarose de microscopia e a subsequente impressão de lamelas de pulverização sobre uma almofada de agarose para obter células de swarmer únicas para microscopia.

1. Para preparar lâminas de agarose para microscopia, adicione 1 g de agarose a 100 mL de uma solução de PBS a 20% vol / vol e 10% vol / vol. Ferva cuidadosamente a solução no microondas para dissolver a agarose e deixa-se arrefecer até 65-70 ° C enquanto se mistura com um agitador magnético.
2. Coloque umMagra slide microscópio em uma seção perfeitamente nível de um banco de trabalho. Cobrir ambas as extremidades do slide com duas camadas de fita de rotulagem laboratorial de uso geral, fixando o slide para o banco de trabalho. A distância entre os dois pedaços de fita deve ser de cerca de 3 cm.
   NOTA: As duas camadas de fita criam uma elevação muito pequena, que determinará a altura da almofada de agarose. É importante que o espaço de trabalho esteja nivelado para garantir que as células estarão no mesmo plano para análise de microscopia.
3. Pipetar ~ 250 μL da solução de agarose previamente preparada sobre a superfície de vidro não coberta.
4. Agora coloque um segundo slide microscópio na mesma orientação que o inferior um on-top e ligeiramente pressioná-lo para baixo, de modo que a agarose residual pode fluir para os lados.
5. Deixe a agarose solidificar 1-2 min e, em seguida, puxe lentamente o slide de vidro superior do fundo em um movimento horizontal.
6. Usando um bisturi, corte qualquer agarose residual que estejaLados da lâmina do microscópio e remova lentamente a fita das extremidades da lâmina do microscópio.
   NOTA: A lâmina de agarose está agora pronta e deve ser usada o mais rapidamente possível, uma vez que começará lentamente a secar.
7. Para realizar a microscopia em células de swarmer, corte um pedaço ~ 3 mm x 10 mm de ágar swarming da borda mais exterior de uma colônia de enxame ( Figura 1D ). É muito importante não quebrar o selo da fita da placa de enxameamento até imediatamente antes da transferência das células de swarmer para a lâmina do microscópio. Uma vez que a fita é removida, o enxameamento das células de V. parahaemolyticus inicia a diferenciação nas células do nadador.
   NOTA: Certifique-se de direcionar os cortes do lado de fora da borda da colônia de enxame para o interior da colônia ( Figura 1D ). Desta forma, você pode evitar a "contaminação do nadador" na borda da colônia de enxame.
8. Transferir o pedaço de agar enxame para um microscópio de agarose slide com as células voltadas para a agarose paD ( Figura 1E ). Isto imprime as células de enxame na almofada de agarose.
9. Depois de esperar ~ 30 s, remova cuidadosamente o pedaço de agar da almofada de agarose ( Figura 1F ).
10. Coloque uma lamela de vidro sobre a almofada de agarose onde as células foram impressas. As células estão agora prontas para microscopia.
    NOTA: É importante a imagem swarmer células imediatamente, desde swarmer células lentamente iniciar diferenciação para o nadador estado.

4. Preparação de V. parahaemolyticus Swimmer Células-culturas para Microscopia de Fluorescência

NOTA: Esta seção do protocolo descreve como preparar uma cultura de V. parahaemolyticus para realizar a microscopia de fluorescência no tipo de célula do nadador.

1. Inocular uma pequena quantidade de células da borda de uma única colônia em 5 mL de caldo LB. Incubar a cultura agitando a 37 ° C durante 1 h ou até um ligeiro crescimento das células torna-se visível.
2. EmEsta fase, se necessário, adiciona agente indutor para a expressão de proteínas de interesse. Neste exemplo, a L-arabinose foi adicionada a uma concentração final de 0,2% (p / vol) de modo a induzir a expressão de YFP-CheW9.
3. Incubar a cultura agitando durante mais 2 h a 37 ° C.
4. Siga os passos 3.1-3.7 para preparar lâminas de agarose de microscopia.
5. Spot 1 μL de cultura de células no centro da almofada de agarose e deixar o local incubar até que esteja seco.
6. Coloque uma lamela de vidro sobre a almofada de agarose onde as células foram manchadas. As células estão agora prontas para serem visualizadas sob o microscópio de fluorescência.

5. Análise de Imagem

Esta parte do protocolo descreve um fluxo de trabalho para a análise de imagem, particularmente como extrair dados de fluorescência de células únicas para análise demográfica.

1. Antes de iniciar a análise de imagem, certifique-se de que todas as imagens de microscopia são salvas no formato TIF de 16 bits.
2. Carregue o DIC (ou contraste de fase) e as imagens correspondentes do canal fluorescente no software.
3. Gere uma imagem de sobreposição de ambos os canais selecionando "Exibir / Sobreposição de imagens". Defina o número de imagens ("# Imagens:") para dois, e selecione a imagem DIC no primeiro canal ea imagem fluorescente no segundo canal.
4. Selecione a ferramenta "Multi-Line" da barra de ferramentas e marcar as células de um pólo para o outro através do meio da célula. Para obter uma lista de todas as linhas geradas (objetos de linha), abra "Measure / Region Measurements". Configure as medições da região para exibir apenas o rótulo da região, distância e intensidade média.
5. Calibre o tamanho de pixel em "Medir / Calibrar distâncias" para o tamanho de pixel que é específico para a configuração do microscópio e clique em "Aplicar a todas as imagens abertas".
6. Transfira todas as regiões (objetos de linha) para a imagem do canal fluorescente. Em "Regiões / TransfSelecione a imagem de origem (a imagem de sobreposição) e a imagem de destino (a imagem do canal fluorescente) Selecione "Todas as regiões" e pressione "OK".
   NOTA: Para poder re-produzir as linhas exatas (objetos de linha, regiões, ROI), abra "Regiões / Salvar Regiões" e salve as regiões.
7. Exporte todas as medições de região em uma planilha abrindo "Measure / Region Measurements" e pressionando "Open Log". Confirme para abrir e exportar os dados. Uma vez que a planilha é aberta em segundo plano, finalmente exportar os dados pressionando "F9: Log Data".
8. Para determinar a posição dos focos fluorescentes ao longo da célula, abra "Measure / Linescan". Defina "Linescan Width" como um valor para que toda a largura de uma célula seja coberta pela região que você criou anteriormente. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de varredura de linha e selecione "Mostrar dados de gráfico". Ao clicar com o botão esquerdo do mouse e arrastar o cursor do mouse ao longo daPonto de interesse, a janela "Graph Data" exibirá o pixel / distância correspondente entre os dois pontos. Selecione a linha azul destacada e copie o conteúdo.
   NOTA: O perfil de intensidade de varredura de linha inteira pode ser registrado em uma planilha pressionando "Log Data" na janela "Linescan". Os dados extraídos podem agora ser usados ​​para visualização em gráficos ou análise estatística adicional. Os padrões de localização ao longo do ciclo celular podem ser facilmente visualizados numa representação demográfica do comprimento da célula e das intensidades fluorescentes ao longo do corpo celular. Essas representações podem ser obtidas usando o mesmo ROI selecionado anteriormente. As etapas a seguir darão um exemplo de como gerar dados demográficos semelhantes aos mostrados nas Figuras 3C e 4C .
   1. Nas marcas de região de carregamento Fiji / ImageJ (.rgn) previamente criadas no software (passo 5.6) utilizando o "importador de ficheiros Metamorph nd & ROI"-benzóico. Alternativamente, as regiões de interesse (ROIs) das células a serem analisadas podem ser criadas diretamente em Fiji / ImageJ usando a ferramenta "Segmented Line" incorporada.
   2. Abra "Analyze / Tools / ROI manager" e marque todas as entradas da lista ativa ".
   3. Depois, clique em "More / Multi Plot" e selecione "List" na nova janela "Multi Plot". Clique em uma entrada de tabela, selecione e "copiar tudo". Em seguida, colar em uma nova planilha.
      NOTA: Certifique-se de que os dados da célula mais longa (duas colunas X e Y correspondentes com o maior número de linhas) é o último à direita na folha de cálculo.
   4. Salve a planilha como um "CSV (delimitado por vírgulas) (* .csv)".
   5. Baixe os scripts R a partir daqui "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ^10. Os scripts classificam as células por comprimento e normalizam os perfis de intensidade fluorescente de todas as células como uma média de fluorescenc de cada célulaE.
   6. Execute o script inteiro "cell profiles function.R" em R [versão 3.0.1; ¹¹ ].
   7. Edite o script "exemplo plots.R" na linha 30 de forma que o caminho do arquivo se refira à pasta onde o arquivo .csv gerado anteriormente é salvo. Além disso, altere o nome de arquivo "profile.csv" na linha 31 para o nome de arquivo escolhido para o arquivo .csv gerado na etapa 5.9.4. Em seguida, execute "exemplo plots.R" e siga a documentação de "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", bem como os comentários do arquivo de script para gerar análise demográfica.

Results

Indução de diferenciação e geração de colônias de enxames

A Figura 1 proporciona um esquema dos passos importantes envolvidos na produção de colónias em enxame de V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Uma cultura de nadador foi manchada em agar-enxerto e incubada a 24 ^o C, induzindo diferenciação e proliferação de swarmer sobre a superfície sólida de agar. Uma imagem representa...

Discussion

Este artigo relata um método para a obtenção de imagens por microscopia de células de V. parahaemolyticus swarmer, seguido por análises a jusante destinadas a resolver e quantificar a localização subcelular e outras características das proteínas marcadas com fluorescência estudadas. Apesar de existirem várias ferramentas para o processamento e análise de imagens em microscopia ^{14 , 15 , 16 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Componentes de mídia
LB médio	Roth	X968.3
Difco Agar, granulado	BD	214510	Para preparação de ágar LB com meio LB
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Agarose NEEO, ultra qualidade	Roth	2267.3	Para a preparação de almofadas de agarose de microscopia
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aditivos
L-arabinose	Roth	5118.3	Usado para induzir derivados pBAD
2,2'-Bipiridil	Sigma Aldrich	D216305-25G	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Cloreto de cálcio di-hidratado	Roth	5239.1	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Sal de ampicilina sódica	Roth	K029.3
Cloranfenicol	Roth	3886.3
Tampão PBS	-		Receita padrão para solução salina
D (+) Sacarose	Roth	4621.1	Para preparação de células eletrocompetentes
Glicerol	Roth	3783.5	Para preparação de células eletrocompetentes
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hardware
Placa de Petri 150 mm x 20 mm com cames	Sarstedt	82.1184.500	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Usado		para secar placas de enxame de ágar HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Usado para elctroporação de DNA de plasmídeo
strong>Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software
MetaMorph Offline (versão 7.7.5.0)	Dispositivos Moleculares-Usado		para análise de imagens de microscopia
Excel		Microsoft-Usado	para análise de dados de microscopia