Novos métodos para estudar codificação gustativa

Summary

Apresentamos três novos métodos para estudar codificação gustativa . Usando um animal simples, a traça Manduca sexta ( Manduca ) , descrevemos um protocolo de dissecção, o uso de tetrodos extracelulares para registrar a atividade de múltiplos neurônios receptores gustativos e um sistema para fornecer e monitorar pulsos precisamente cronometrados de saborizantes.

Abstract

O sentido do gosto permite que os animais detectem produtos químicos no meio ambiente, dando origem a comportamentos críticos para a sobrevivência. Quando os neurônios do receptor Gustatory (GRNs) detectam moléculas de saborizante, codificam informações sobre a identidade e a concentração do saborizante como padrões de atividade elétrica que se propagam para os neurônios seguidores no cérebro. Esses padrões constituem representações internas do saborizante, que então permitem ao animal selecionar ações e formar memórias. O uso de modelos animais relativamente simples tem sido uma ferramenta poderosa para estudar princípios básicos na codificação sensorial. Aqui, propomos três novos métodos para estudar a codificação gustativa usando a traça Manduca sexta . Primeiro, apresentamos um procedimento de dissecção para exposição dos nervos maxilares e da zona subesofágica (SEZ), permitindo o registro da atividade de GRNs de seus axônios. Em segundo lugar, descrevemos o uso de eletrodos extracelulares para registrar a atividade de GRNs múltiplos, colocando teTrode fios diretamente no nervo maxilar. Em terceiro lugar, apresentamos um novo sistema para entrega e monitoramento, com alta precisão temporal, pulsos de diferentes saborizantes. Estes métodos permitem a caracterização de respostas neuronais in vivo directamente a partir de GRNs antes, durante e após a entrega dos saborizantes. Nós fornecemos exemplos de traços de tensão gravados em GRN múltiplos e apresentamos um exemplo de como uma técnica de classificação de espiga pode ser aplicada aos dados para identificar as respostas de neurônios individuais. Finalmente, para validar nossa abordagem de gravação, comparamos as gravações extracelulares obtidas de GRNs com tetrodos para gravações intracelulares obtidas com eletrodos de vidro afiados.

Introduction

Os sistemas gustativo e olfativo geram representações internas de produtos químicos no meio ambiente, dando origem a percepções de gostos e odores, respectivamente. Esses sentidos químicos são essenciais para provocar numerosos comportamentos críticos para a sobrevivência do organismo, que vão desde encontrar companheiros e refeições para evitar predadores e toxinas. O processo começa quando os agentes químicos ambientais interagem com receptores localizados nas membranas plasmáticas das células receptoras sensoriais; Essas células, diretamente ou através de interações com neurônios, transduzem informações sobre a identidade e concentração de produtos químicos em sinais elétricos. Estes sinais são então transmitidos para neurônios de ordem superior e para outras estruturas cerebrais. À medida que estes passos progridem, o sinal original sempre sofre mudanças que promovem a capacidade do organismo de detectar, discriminar, classificar, comparar e armazenar as informações sensoriais e selecionar uma ação apropriada. Entendendo como o sutiãNa transformação de informações sobre produtos químicos ambientais para executar melhor uma variedade de tarefas é uma questão básica na neurociência.

A codificação de Gustatory foi pensada para ser relativamente simples: uma visão extensa postula que cada molécula química que provoca um sabor (um "saborizante") pertence naturalmente a uma das aproximadamente cinco qualidades básicas de sabor ( ou seja , doce, amargo, azedo , Salgados e umami) ¹ . Nesta visão de "gosto básico", o trabalho do sistema gustativo é determinar qual desses gostos básicos está presente. Além disso, os mecanismos neurais subjacentes à representação básica do sabor no sistema nervoso não são claros e são pensados ​​para serem governados por uma "linha marcada" ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} ou um "padrão de fibra transversal" ^{7 ,} código ⁸ . Em um código de linha rotulado, cada célula sensorial e cada um de seus seguidores neurais respondem a uma única qualidade de sabor, formando um canal direto e independente para centros de processamento superiores no sistema nervoso central dedicado a esse gosto. Em contraste, em um código de padrão de fibra, cada célula sensorial pode responder a múltiplas características de sabor, de modo que a informação sobre o saborizante seja representada pela resposta geral da população de neurônios sensoriais. Se a informação gustativa é representada por gostos básicos, através de linhas rotuladas, ou através de algum outro mecanismo, não está claro e é o foco da investigação recente ^{3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . Nosso próprio trabalho recente sugere que o sistema gustativo usa um código de população spatiotemporal para gerarRepresentações de saborizantes individuais em vez de categorias básicas de gosto ¹⁰ .

Aqui, oferecemos 3 novas ferramentas para auxiliar no estudo da codificação gustativa. Primeiro, sugerimos o uso do hawkmoth Manduca sexta como um organismo modelo relativamente simples, possivel para o estudo eletrofisiológico do gosto e descrevendo um procedimento de dissecação. Em segundo lugar, sugerimos o uso de "tetrodes" extracelulares para registrar a atividade de GRNs individuais. E em terceiro lugar, sugerimos um novo aparelho para entregar e monitorar pulsos de saborizante precisamente cronometrados para o animal. Essas ferramentas foram adaptadas das técnicas que nosso laboratório usou para estudar o sistema olfativo.

Insetos como a mosca da fruta Drosophila melanogaster , o gafanhoto Schistocerca americana , bem como a maruca Manduca sexta, têm proporcionado por décadas recursos poderosos para entender princípios básicos sobre o nerSistema de você, incluindo a codificação sensorial ( por exemplo, olfação ¹³ ). Nos mamíferos, os receptores de gosto são células especializadas que se comunicam com os neurônios através de caminhos complexos do segundo mensageiro ^{1 , 14} . É mais simples em insetos: seus receptores de gosto são neurônios. Além disso, as vias de sabor de mamíferos perto da periferia são relativamente complexas, apresentando múltiplas rotas neurais paralelas, e componentes importantes são difíceis de acessar, contidos em pequenas estruturas ósseas ¹⁵ . As vias de sabor do inseto parecem ser mais simples. Em insetos, os GRNs estão contidos em estruturas especializadas conhecidas como sensilla, localizadas na antena, partes bucais, asas e pernas ^{16 , 17} . Os GRNs diretamente projetam para a zona subesofágica (SEZ), uma estrutura cujo papel foi considerado principalmente ¹⁷ gustativo e que contém segunda ordemNeurônios gustativos ¹⁰ . A partir daí, a informação viaja para o corpo para conduzir reflexos e para áreas superiores do cérebro para serem integradas, armazenadas e, em última instância, para dirigir as escolhas comportamentais ¹⁶ .

É necessário caracterizar as respostas do sabor periférico para entender como a informação do gosto é propagada e transformada de um ponto para outro através do sistema nervoso. O método mais utilizado para monitorar diretamente a atividade neural de GRN em insetos é a técnica de gravação de ponta ^{12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23} . Isso envolve a colocação de um eletrodo diretamente em um sensillum, muitos dos quais são relativamente fáceis de acessar. O saborizador está incluído no eletrodo, permitindo que um seja ativado e extMede as respostas neuronais nas GRNs de forma racélular no sensillum. Mas, como o saborizador está contido no eletrodo, não é possível medir a atividade do GRN antes que o saborizador seja entregue ou após a remoção, ou para trocar os saborizantes sem substituir o eletrodo ²⁰ . Outro método, a técnica de gravação "side-wall", também foi usado para registrar a atividade GRNs. Aqui, um eletrodo de gravação é inserido na base de um sabor sensorial ²⁴ , e os saborizantes são entregues através de um capilar de vidro separado na ponta do sensillum. Ambas as técnicas restringem a gravação de GRNs para um sensillum particular. Aqui, sugerimos uma nova técnica: gravação de axônios GRN selecionados aleatoriamente de sensilla diferente, enquanto distribuímos separadamente as seqüências de saborizantes para a probóscide. As gravações de Axon são conseguidas colocando eletrodos de vidro afiados ou feixes de eletrodos extracelulares (tetrodos) no nervo que carrega axônios deGRNs na probóscide ao SEZ ¹⁰ . Em Manduca , esses axônios atravessam o nervo maxilar, que é conhecido por ser puramente aferente, permitindo a gravação inequívoca de respostas sensoriais ²⁵ . Este método de gravação a partir de axônios, permite, durante mais de duas horas, medição estável de respostas GRN antes, durante e após uma série de apresentações de sabor.

Aqui, descrevemos um procedimento de dissecção para expor os nervos maxilares em conjunto com o SEZ, o que pode permitir que se grave simultaneamente as respostas de GRN e neurônios múltiplos no SEZ ¹⁰ . Nós também descrevemos o uso de gravações extracelulares de GRNs usando um tetrode de fio torcido personalizado de 4 canais que, quando combinado com um método de classificação por espiga, permite a análise de GRNs múltiplos (em nossas mãos, até seis) simultaneamente. Além disso, comparamos as gravações feitas com tetrodes com gravações feitas com células intracelulares afiadasEletrodos. Finalmente, descrevemos um novo aparelho para fornecer estímulos de saborizante. Adaptado do equipamento usado por muitos pesquisadores para fornecer odorantes em estudos de olfação, nosso novo aparelho oferece vantagens para o estudo da gustação: melhorando o sistema de entrega multicanal anterior, como os desenvolvidos por Stürckow e colegas (ver referências ^{26 , 27} ), nosso aparelho alcança informações precisas Controle sobre o tempo da entrega do saborizante enquanto fornece uma leitura de tensão desse tempo; E permite a entrega rápida e sequencial de vários estímulos de saborizantes ¹⁰ . O aparelho baça a probóscide em um fluxo constante de água limpa em que podem ser entregues pulsos controlados de saborizante. Cada pulso saboroso passa sobre a probóscis e depois é lavado. Os saborizantes contêm uma pequena quantidade de coloração insípida, permitindo que um sensor de cor monitore, com cronometragem precisa, a passagem do tastant ovE a probóscide.

Protocol

Cuidado: as balanças finas e em pó lançadas pela Manduca podem ser alergênicas, pelo que recomenda-se o uso de luvas de segurança de laboratório e uma máscara facial.

1. Dissecção de Manduca sexta para Revelar os Nervos Maxilares e a SEZ

1. Escolha uma traça apropriada de ambos os sexos com base nas seguintes características: três dias após a eclosão com aparência geral saudável (as asas devem ser totalmente estendidas e as probóscis e as antenas devem estar intactas).
   1. Coloque a traça individualmente em uma taça de plástico para transporte.
2. Insira a traça em um tubo de polipropileno.
   Atenção: Recomendamos que você execute esta etapa em uma chaminé para evitar que as escamas em pó da mariposa se espalhem.
   1. O tubo deve ser um pouco mais longo que o corpo da traça ( Figura 1A ). O tubo pode ser feito cortando um tubo de polipropileno de 15 mL.
   2. Empurre a mariposa até que a cabeça fique exposta e insira papel de gesso embrulhado na outra extremidade do tubo para ajudar a manter a mariposa imobilizada ( Figura 1A ).

Retire o cabelo da cabeça exposta da traça (ventral e dorsal) soprando ar pressurizado sobre ele.

1. Um jato de ar pode ser feito conectando uma seringa (1 mL com uma agulha, ID em torno de 1,4 mm, com ponta afiada removida) para uma fonte de ar pressurizada.
   Nota: Depois de remover o cabelo, todas as etapas a seguir podem ser realizadas fora da exaustão.

Uma vez que a maioria dos cabelos foram removidos, coloque o tubo em uma câmara de espera com a parte dorsal da cabeça voltada para cima, conforme mostrado na Figura 1B .

1. Em uma placa de Petri, use argila de modelagem para construir uma base triangular com cerca de 7 cm, 2,5 cm de altura ( Figura 1B ).

Figura 1 : Preparação da Câmara de Dissecção para Manduca . ( A ) Uma traça é retida num tubo. A cabeça está exposta em uma extremidade, enquanto a outra extremidade está conectada com papel de seda. ( B ) Uma câmara de dissecção feita a partir de uma placa de Petri e argila de modelagem é mostrada. A parte dorsal da cabeça está voltada para cima. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

5. Proteja as antenas e as probóscis.
   1. Prepare 3 pequenos tubos cortando uma ponta de pipeta (pontas amarelas, 1-200 μL) com uma lâmina de barbear em 3 peças de cerca de 0,5 cm de comprimento. O diâmetro interno deve ser grande o suficiente para que a antena e a probóscide possam caber confortavelmente.
   2. Prepare um gancho porDobrando um fio (22 AWG, com cerca de 7 cm de comprimento). Estenda a probóscide da traça e, em seguida, insira-a em um dos pequenos tubos, puxando-o com o fio até que o tubo atinja a parte proximal da probóscis.
   3. Proteja o pequeno tubo com cera de batik firme (usando, por exemplo, um cera elétrica dental para derreter e direcionar a cera) para a parte dorsal da cápsula principal da traça ( Figura 2A à esquerda).
   4. Coloque cada antena em um tubo e prenda os tubos com cera de batik como mostrado na Figura 2A (esquerda). Tenha cuidado para evitar danificar as antenas com a cera quente.
6. Estabilize o cérebro contra o movimento cortando os músculos que cobrem a superfície anterior do cérebro ( isto é, músculo compressor bucal).
   1. Sob o microscópio de dissecação, use tesoura de microdissecção ou um mini-machado formado a partir de uma lâmina de barbear colada em um palito de dente para abrir a cápsula de cabeça por makCom um pequeno corte logo abaixo da probóscide ( Figura 2A , inserção superior esquerda).
   2. Use tesoura de microdissecção para cortar o músculo compressor bucal (para ilustrações veja a referência ²⁵ ). Como o músculo não é facilmente visível, o seguinte teste comportamental é recomendado para confirmar que foi cortado.
   3. Diluir sacarose em água destilada para se obter uma solução de 1 M.
   4. Use uma pipeta para fornecer cerca de 200 μL de solução de sacarose aos 2/3 distal da probóscide e observe a probóscide por 5 min. Se o músculo foi corretamente cortado, o inseto não deve ser capaz de estender ou mover a probóscide.
   5. Aplique uma camada de cera batik derretida para selar a abertura na cápsula principal.
7. Volte o inseto para que o lado ventral da cápsula principal esteja agora voltado para cima.
8. Para perfurar a solução salina durante e após o procedimento de dissecação, construir um copo de cera em torno do lado ventral da cabeça UsinO cera elétrica: sob um microscópio de dissecação, comece a construir o copo aplicando a primeira fila de cera na frente da cabeça, movendo-se para trás. Mantenha os tubos de probóscis e antenas dentro do copo ( Figura 2A à direita).
   1. Continue a construir o copo para fora e para cima até atingir o nível dos olhos.
9. Use fórceps para tomar um dos dois palitos labiais, então coloque-o no lado e assegure-o no copo de cera adicionando mais cera derretida. Faça o mesmo com o outro palp maxilar ( Figura 2A à direita).
10. Selar quaisquer aberturas no copo de cera e nos tubos.
    Nota: Nesta etapa, o epoxi é usado porque ajuda a selar facilmente as lacunas na cera e nos tubos e evita qualquer dano causado pelo calor às antenas e probóscis.
    1. Use um palito de dente para misturar o epóxi binário em um prato de mistura de plástico. Manter o prato de mistura.
    2. Use o palito para aplicar uma finaCamada de epóxi para o exterior e dentro do copo ( Figura 2B ).
    3. Preencha o espaço vazio nos tubos que contenham probóscis e antenas com epóxi e preencha a parte do tubo de polipropileno que envolve o pescoço com suficiente epóxi para mantê-lo firmemente no lugar ( Figura 2B ).
    4. Deixe o epóxi secar por aproximadamente 20 min. Para verificar isso, teste o epóxi restante no prato de mistura de plástico para garantir que ele seja sólido e não mais pegajoso.
    5. Encha o copo de cera com solução salina fisiológica Manduca ²⁸ e espere alguns minutos para garantir que não haja vazamentos. Se um vazamento for visível, tente selá-lo aplicando mais cera quente e / ou epóxi.

Figura 2 : Preparando Manduca </ Em> para Dissecção. ( A ) As antenas e as probóscis são protegidas dentro de pequenos tubos feitos de pontas de pipeta cortadas em três peças de cerca de 0,5 cm de comprimento. (Painel esquerdo, imagem grande) Os tubos são protegidos com cera batik derretida aplicada em torno da parte dorsal da cabeça. (Painel esquerdo, inserção) Para remover o músculo compressor bucal, o lado dorsal da cápsula principal é aberto fazendo um pequeno corte como indicado pela linha pontilhada na imagem grande. (Painel direito) Um copo de cera é construído em torno do lado ventral da cabeça como um reservatório de solução salina perfundida durante o procedimento de dissecação e experiências de gravação. ( B ) O epoxi é utilizado para selar os intervalos entre a base do copo de cera e a parte dorsal da cabeça (painel esquerdo) e entre a cera e os tubos que contêm as antenas e probóscis, incluindo as aberturas dos tubos (painel direito ). Clique aqui tO veja uma versão maior dessa figura.

11. Sob o microscópio de dissecação, use tesoura de microdissecção para cortar os palpos labiais.
12. Use uma tesoura de microdissecção ou um mini-machado para abrir o lado ventral da cápsula da cabeça fazendo quatro cortes: dois cortes ao longo da cutícula que circunda cada olho de trás para a frente, um corte na cutícula na parte de trás da cabeça, E um corte na cutícula na frente da cabeça perto da probóscide ( Figura 3A ).
13. Retire delicadamente a cutícula usando fórceps de micro-dissecção para expor o cérebro.
14. Ao usar duas pinças de micro-dissecção afiadas remova lentamente e cuidadosamente o tecido adiposo e a traquéia que cobre o SEZ. Evite qualquer dano ao cérebro ou aos nervos (por exemplo, nervo maxilar, nervo óptico, conectivo cervical). Enxágüe o cérebro substituindo freqüentemente a solução salina e ajuste a luz com freqüência para melhorar a visibilidade. Nota: Esta pode ser a parte mais crítica do diSsection; É fácil danificar inadvertidamente o nervo maxilar, puxando-o ou esmagando-o.
    Nota: Neste ponto, a SEZ e os nervos maxilares devem ser claramente visíveis ( Figura 3B- 3C ). No entanto, o cérebro e os nervos maxilares são cobertos por uma bainha fina.
15. Para remover a bainha, substitua a solução salina no copo de cera com colagenase / dispase a 10% (p / v) dissolvida em solução salina e deixe-a no lugar por 5 min. Então, depois de enxaguar o cérebro várias vezes com solução salina, remova suavemente a bainha com pinças de microdissecção super finas puxando a bainha da SEZ através dos nervos maxilares.
16. Comece a perfurar o copo de cera com solução salina fresca. Coloque o tubo de uma linha de gotejamento salino no copo de cera e fixe-o lá com cera derretida.

FIGUre 3 : Manduca Dissection Procedure. ( A ) Os palpos labiais removidos, a cápsula principal é aberta fazendo quatro cortes como indicado pela linha pontilhada. ( B ) Uma imagem ampliada do cérebro após a abertura da cápsula da cabeça e a remoção do tecido adiposo e da traqueia, permitindo a visualização dos nervos maxilares (MxNs) e da zona subesofágica (SEZ, termo referente à área do cérebro sob a esôfago). Os nervos maxilares carregam axônios de neurônios receptores gustativos (GRNs) no probóscis para o SEZ. ( C ) Um esquema de um cérebro Manduca . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

2. Sistema de entrega Tastant

1. O sistema de entrega de sabor é composto por quatro elementos principais: a fonte de água, o coletor de sabor, o sensor de cor e o site que contém oProbóscis, todos conectados a um tubo de plástico rígido ( Figura 4A- 4B ). Para construir este sistema, siga as etapas mostradas na Figura 4B . Use um tubo de plástico rígido com cerca de 6 cm de comprimento (ID 0,3 cm).
2. Use um ferro de solda para fazer um pequeno orifício no tubo onde a probóscide será colocada ( Figura 4A- B ).
3. Para garantir que as proboscências de diferentes animais sejam sempre colocadas no mesmo local, prenda material de triagem de plástico (malha, tamanho do orifício de cerca de 0,1 cm) no tubo ( Figura 4A- B ). Com uma lâmina de barbear ou uma ferramenta rotativa corte o tubo rígido a cerca de 5 mm acima do orifício de probóscis. Coloque a malha entre os dois pedaços de tubo. Proteja a malha e reconecte os tubos aplicando epoxi na parte externa dos tubos. Deixe o epóxi secar por aproximadamente 20 min.
4. Para entrega de saborizante use um pressurizadoSistema de perfusão com tantos tubos de sabor como necessário, unidos a um colector (ver abaixo). Use o ferro de soldar para fazer um pequeno orifício no tubo rígido a cerca de 1 cm acima da malha. Insira o tubo de saída do sistema de perfusão (ID 0,86 mm) no tubo rígido e assegure-o ali, aplicando epoxi ( Figura 4A- 4B ).
5. Use uma bomba peristáltica para fornecer um fluxo constante (~ 40 mL / min) de água destilada. Conecte-o com tubo de silicone ao tubo rígido ( Figura 4A- 4C ). Conecte o outro lado do tubo rígido a outro tubo de silício para direcionar a saída para um recipiente de lixo grande ( Figura 4A- 4C ).
6. Para entregar o saborizante, injete ar comprimido no colector do sistema de perfusão. Isso pode ser conseguido, por exemplo, usando uma bomba pneumática (10 psi) controlada por uma entrada de pulso de tensão temporizada para injetar ar comprimido no manifol D tubo contendo o saborizante desejado. Um pulso 1s ejeta cerca de 0,5 mL de saborizante.

3. Preparação e Monitoramento de Tastant

1. Diluir saborizante em água destilada até a concentração desejada. Esteja ciente de que o saborizante será mais diluído pela corrente de água. Medimos a concentração final atingindo a probóscide como 77% da concentração inicial (ver referências ^{10 , 29} ).
2. Adicione um corante alimentar artificial a cada solução de saborizante para permitir a determinação do tempo preciso com o qual o saborizante passa sobre a probóscide. Descobrimos que o corante verde (ver Lista de Materiais ) a 0,05% p / v não ativa o Manduca GRNs.
3. Use um sensor de cor (veja a Tabela 1) para detectar a coloração alimentar nas soluções de saborizantes. Use um ferro de soldar para fazer um orifício adjacente à malha e 0,5 cm abaixo do tubo de saída do sistema de perfusão ( S = "xfig"> Figura 4A -4B). Conecte o sensor ao tubo rígido e assegure-o aplicando epoxy no exterior.
   1. Registre a saída de tensão do sensor de cor como sinal analógico juntamente com sinais fisiológicos (ver seção 4). O sinal de tensão do sensor de cor pode ser amplificado usando um amplificador DC conectado ao sensor ( Figura 4A ).
4. Certifique-se de que o sensor de cores está funcionando fornecendo o saborizante e registrando a saída de tensão do sensor. O sinal induzido pelo corante deve exceder o nível de ruído.
   1. Ajuste a taxa de fluxo de água constante para tornar o sinal o mais próximo possível do quadrado.
      Nota: Ao entregar vários saborizantes em sequência, observe que o primeiro teste com um novo saboroso consistirá em uma mistura do saborizante novo e anterior. Por esse motivo, não analisamos esses primeiros ensaios.

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Figura 4 : Sistema de entrega Tastant. ( A ) Um esquema do aparelho utilizado para fornecer e monitorar pulsos cronometrados de saborizantes para a probóscide do animal. Os principais componentes do sistema são indicados com números vermelhos. Um fluxo constante de água destilada é mantido através da probóscide por uma bomba peristáltica conectada com tubo de silicone ao tubo de plástico rígido (1) onde a probóscide deve ser colocada (6). Os tactores que contêm uma pequena quantidade de corante sem sabor são entregues usando um sistema de perfusão pressurizado de 16 canais. Os reservatórios que contêm os saborizantes estão conectados a um colector (2) que está ligado ao tubo rígido, acima do orifício onde a probóscide deve ser colocada (5). O ar comprimido de uma bomba pneumática é injetado no sistema de perfusão para fornecer rapidamente um saborizante, com o tempo controlado por software personalizado. UMAO sensor de cores (3) é usado para monitorar a entrega do saborizante. O sensor está conectado ao tubo rígido adjacente ao probóscis e abaixo da saída do sistema de perfusão de sabor. O sinal de tensão do sensor de cor é amplificado por um amplificador DC. O traçado vermelho na inserção adjacente ao amplificador ilustra um sinal de cor gravado usando o software de aquisição de dados personalizado; O aumento rápido e a diminuição no sinal refletem a chegada e lavagem do saborizante, respectivamente. A probóscide da traça é colocada em um orifício (5) localizado logo abaixo do sensor de cor. Uma malha (4) é colocada acima do orifício para garantir que as proboscências de diferentes animais estão sempre posicionadas no mesmo local. O outro lado do tubo rígido é conectado a outro tubo de silício para direcionar a saída para um recipiente de resíduos (7). ( B ) Imagem que mostra os principais elementos do sistema de entrega de saborizado conectado ao tubo de plástico rígido, que são indicados pelos números vermelhos como mostrado no painel A: a águaA fonte (6), a tubulação de saída do coletor de saborizantes (2), o sensor de cor (3), a malha (4) e o orifício onde a probóscide deve ser inserida (5), todos conectados a um tubo de plástico rígido (1) . ( C ) A colocação da preparação Manduca na configuração é mostrada. O distal t2 / 3 da probóscide da traça é introduzido no orifício (5) no tubo de plástico rígido (1). A probóscide é segura no lugar com cera dentária e epóxi como mostrado pela inserção. A entrada de água para o tubo rígido e a sua saída para um recipiente de resíduos são indicadas pelos números 6 e 7, respectivamente. O número 2 indica o tubo de saída do coletor de saborizantes. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

4. Gravação extracelular de tetrodos para monitorar a atividade evocada por tastant de GRNs

1. Coloque a preparação da traça em uma plataforma sob um estereomicroscópio em uma vibraçãoTabela isolante ( Figura 4C ).
2. Coloque os dois terços distais da probóscide da traça no tubo rígido do sistema de distribuição de saborizante ( Figura 2B ). Para fazer isso, estenda a probóscide da traça e depois insira-a no orifício do tubo rígido empurrando-a suavemente com a ajuda da pinça de curativo. Selar a probóscide no lugar com cera dental macia e depois uma camada de epóxi para evitar vazamentos ( Figura 4C , entrada).
3. Conecte a linha de perfusão salina à cápsula da cabeça e ajuste o fluxo de perfusão para uma taxa constante de cerca de 0,04 L / h.
4. Mergulhe um eletrodo de terra ( ou seja, um fio de prata clorado) no banho de solução salina ( Figura 5A ).
5. Use um tetrodo de fio torcido feito sob medida construído seguindo o procedimento de fabricação descrito em ³⁰ (4 fios de eletrodos são sugeridos para conseguir unidades bem isoladas e para caber emo nervo). Antes do experimento, eletrodo o eletrodo seguindo os passos descritos em ³⁰ .
6. Use um micromanipulador manual para posicionar o tetrodo perto do nervo maxilar. Avance o tetrodo até que comece a entrar no nervo ( Figura 5 ).
7. Aguarde pelo menos 10 minutos depois de colocar o tetrodo para permitir que ele se estabilize dentro do nervo antes da gravação.
8. Amplifique o sinal (3000x) e use um filtro passa-banda configurado entre 0,3-6 kHz. Adquira o sinal a uma taxa de amostragem de 40 kHz usando o software de aquisição de dados.
9. Depois de terminar o experimento, coloque a preparação da traça no congelador.

Figura 5 : Gravação de Tetrode de GRNs. ( A , imagem grande) Um micromanipulador é usado para pLace o tetrodo do fio torcido no nervo maxilar (MxN) para registrar a atividade dos GRNs. Um eletrodo de terra de prata de cloreto é colocado no banho de solução salina como mostrado. ( A , inserção) Uma imagem ampliada do cérebro que mostra o tetrodo no nervo maxilar. A zona subesofágica (SEZ) também é indicada. ( B ) Um esquema de um cérebro Manduca orientado como em A. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Results

A atividade dos GRNs pode ser registrada usando um eletrodo de tetrodo extracelular antes, durante e após a entrega do sabor ( Figura 6A e 6C ). A Figura 6A (painéis médio e inferior) mostra os traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) registrados por cada um dos quatro fios colocados no nervo maxilar, onde são observados sinais de diferentes amplitudes que refletem potenciais de ação (setas). Um pulso de 1 s de saborizante (sacarose 1 M) foi administrado 2s após o início da experiência; O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor ( Figura 6A , painel superior). Os picos induzidos por saborizantes que podem ser observados em cada um dos quatro canais ( Figura 6A , painel central). Os GRNs podem ser identificados e distinguidos dos mechanosensores (nenhum mostrado aqui) quando eles respondem a alguns provadores e não aos outros

Para identificar e isolar respostas de neurônios únicos das gravações de tetrodos, realizamos classificação de espiga fora de linha usando um conjunto de funções personalizadas com base em métodos ^{32 , 33 de} Pouzat e Kleinfeld (esses métodos são descritos nessas citações: ^{10 , 29} ). A Figura 6B mostra um exemplo de classificação por espiga aplicado aos dados mostrados na Figura 6A , em que foram encontradas três unidades bem isoladas.

As tramas de escala da Figura 6C representam as respostas das três unidades isoladas na Figura 6B a seis saborizantes diferentes (sacarose 1 M, maltose e NaCl, 100 mM de cafeína e 10 mM de berberina e lobelina) entregues em sequência (4 testesS / tastant são mostrados). Conforme mostrado na Figura 6C , os GRNs registrados têm níveis diferentes de atividade de linha de base, variando de silencioso (GRN 1) a baixo ou moderado (GRN 2 e 3). Após o início do sabor, os GRNs mostram diversos padrões de atividade e exibem seletividade diferente para os saborizantes. Por exemplo, o GRN 1 respondeu apenas a sacarose, enquanto o GRN 2 respondeu a maltose e NaCl com explosão de espigas e a lobelina com pico apenas no início do estímulo. Além disso, algumas respostas são bloqueadas no momento do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 1 à sacarose), enquanto que outras respostas superam a duração do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 3 à berberina) ou contêm componentes excitadores e inibitórios ( por exemplo, Figura 7 Respostas de GRN 2 ao NaCl e à sacarose). Para mais informações sobre as diversas sensibilidades e padrões de atividade dos GRN, veja a referência ¹⁰ .

Figura 7 ). Os traços de tensão na caixa verde no Painel A foram registrados intracelularmente a partir do GRN 1 durante 5 testes consecutivos de apresentação de sacarose e as mesmas respostas são mostradas como parcelas de quadros no painel B. (Observe que esse tipo de resposta corresponde ao obtido com tetrodos e Mostrado na Figura 6C .) GRN 2, gravado com eletrodos intracelulares afiados, mostra um padrão de resposta mais amplo.

Figura 6: Resultados representativos das gravações do nervo maxilar com Tetrodes extracelulares. ( A ) São mostrados traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) gravados por cada um dos quatro fios no nervo maxilar (painel central). Um pulso de saborizante de 1 s foi aplicado durante o período de tempo indicado pelo sombreamento vermelho no painel do meio. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor como indicado pelo traçado de tensão vermelha no painel superior e é indicado no painel do meio pela área sombreada vermelha. As linhas horizontais pontilhadas indicam +50 (superior), 0 (meio) e -50 (inferior) μV. É mostrado um alargamento dos traços de tensão bruta correspondentes à área dentro das linhas pontilhadas verticais (painel inferior). Exemplos de pontos são indicados pelas setas. ( B ) Um exemplo de classificação de espiga aplicado aos dados mostrados no painel A. As formas de onda registradas em cada um dos quatro fios extracelulares (1-4) sãoE identificado com três GRN diferentes (unidades 1-3) contribuindo para os sinais gravados. Eventos individuais (linhas finas coloridas) e a média (linha preta grossa) são mostradas para as três unidades. Uma série de critérios estatísticos devem ser considerados para identificar de forma confiável unidades independentes usando o método de classificação por espiga (ver referências ^{10 , 29} ). ( C ) Raster tramas representando as respostas das três unidades isoladas a uma seqüência de seis saborizantes diferentes (4 ensaios / saborizantes são mostrados). O período de tempo de entrega do saborizante (1 s) é indicado pela área sombreada vermelha. As concentrações de saborizantes foram 1M (sacarose, maltose, NaCl), 100 mM (cafeína) e 10 mM (berberina e lobelina). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Figura 7 : Gravação intracelular de Axões GRN. ( A , painel da caixa verde) Traços de tensão gravados a partir de um GRN com eletrodos intracelulares de vidro afiado (resistência de 80 - 120 MΩ) colocados no nervo maxilar, provocados por 5 estímulos consecutivos com sacarose 1 M (Suc). ( B ) Parcelas rásticas das respostas de dois GRNs, incluindo respostas mostradas no painel A (painel de caixa verde), a dois saborizantes diferentes entregues em sequência (cor de cor cinza 100 mM, cor de fonte negra de 1 M) gravados com eletrodos intracelulares de vidro afiado Colocado no nervo maxilar (7 ensaios / saborizante e 3 ensaios / água são mostrados). O tempo de entrega do Tastant é indicado pelas áreas sombreadas vermelhas em ambos os painéis. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor, conforme indicado pelos traços de tensão vermelha na parte inferior de cada painel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os métodos aqui descritos permitem gravações in vivo de um animal relativamente simples, Manduca sexta , para caracterizar a atividade de múltiplas GRN selecionadas aleatoriamente em longas durações (por mais de 2 h), antes, durante e após a entrega do sabor. Esses métodos também permitem a entrega rápida e sequencial de múltiplos estímulos de saborizantes com controle temporal preciso, vantagens que são úteis para o estudo de mecanismos neurais subjacentes à representação de saborizantes. Este protocolo tem sido usado para estudar como as respostas de GRNs a tastants são transformadas quando são transmitidas para seus neurônios alvo pós-sinápticos ( por exemplo, na SEZ) monitorando GRNs simultaneamente com interneurônios monossinticamente conectados ¹⁰ . Além disso, esses métodos podem ser adaptados às necessidades do experimentador, permitindo a execução de paradigmas complexos para estudar aspectos fundamentais da codificação gustativa.

Quando começarNos nossos estudos, um problema técnico que às vezes precisávamos solucionar era a incapacidade de detectar sinais de inclinação do nervo maxilar com os fios de tetrodos. Possíveis causas para isso são diversas, já que o protocolo de dissecação é desafiador, e é necessária alguma prática para obter uma boa preparação. Primeiro, durante a dissecção da traça, os nervos maxilares são fáceis de danificar, especialmente durante a remoção da bainha que envolve o tecido nervoso. Em segundo lugar, se a bainha não for removida completamente, os fios do tetrode podem não ter acesso ao nervo. Em ambos os casos, iniciar uma nova preparação geralmente é a maneira mais fácil de resolver esses problemas. Em terceiro lugar, pode haver um problema com os fios tetrodos. Isso pode ser verificado medindo a impedância dos fios que deve ser ~ 270 kΩ a 1kHz. Se o valor da impedância estiver acima de ~ 300 kΩ, eletrole os fios com ouro para obter a impedância desejada (ver referência ³⁰ ). Em quarto lugar, um equipamento pode estar desconectadoOu se comportando mal.

Outro possível problema é que os sinais de pico são gravados, mas o (s) neurônio (s) aparentemente não respondem aos provadores. Isso pode ser porque os neurônios registrados são insensíveis ao conjunto de saborizantes entregues. Além disso, é importante ter em mente que, além de axônios de GRNs, o nervo maxilar também carrega fibras mecanossensíveis. Assim, é possível gravar a partir de neurônios mecanossensores em vez de, ou além de, GRNs. No entanto, o sistema de entrega de saborizado foi concebido para proporcionar uma entrada mecânica constante ao longo do experimento, tornando improvável que as respostas a um saborizador sejam confundidas pelas respostas ao componente mecânico da sua entrega. Os neurônios que respondem a alguns, mas não a outros saborizantes, ou de maneiras diferentes a diferentes saborizantes, podem ser classificados de forma inequívoca como GRNs. Recomendamos o uso de saborizantes recentemente diluídos para evitar variações na concentração de sabor ou composição devido à degradação ou evaporação do compostoDo solvente. Também recomendamos limpar o sistema regularmente para evitar a contaminação da tubagem e / ou obstruções.

Outro possível problema técnico é uma relação sinal-ruído desvantagem. Este problema muitas vezes pode ser resolvido através da recarga ou ajuste da posição do eletrodo de terra do banho. Outras soluções podem exigir blindagem e minimizar o comprimento de cada conexão elétrica no aparelho.

Finalmente, é importante notar que a análise correta dos dados obtidos usando gravações de tetrode requer uma classificação cuidadosa dos espinhos. Descobrimos que os métodos totalmente automatizados geralmente são inadequados. Recomendamos familiarizar-se com a literatura de classificação de espiga antes de analisar dados de tetrodos ^{10 , 29 , 31 , 32 , 33} .

Alternativas à nossa dissecção profissionalTocol pode ser usado. Aqui, descrevemos uma dissecção através da parte ventral da cabeça da traça, proporcionando acesso aos nervos maxilares e SEZ, mas também é possível acessar essas estruturas por dissecação através do lado dorsal. Nós achamos que a preparação do lado dorsal não é otimizada para fazer gravações dessas estruturas gustativas devido à sua localização profunda, mas esta preparação oferece a vantagem de habilitar gravações de estruturas de ordem superior, como o corpo de cogumelo, uma área associada a multi Integração sensorial, aprendizagem associativa e processamento de memória ³⁴ . Nós nos concentramos no uso de eletrodos de tetrodos para gravar a partir do nervo maxilar, mas, como ilustramos, eletrodos afiados intracelulares padrão também podem ser usados ​​para este propósito. Além disso, ambas as técnicas podem ser combinadas para realizar gravações simultâneas de várias áreas do cérebro ¹⁰ . A literatura sobre neurociências oferece muitos exemplos de iModelos de nvertebrados que provaram ser ferramentas poderosas para revelar princípios fundamentais de processamento sensorial, como a codificação olfativa, que se aplicam tanto aos insetos quanto aos vertebrados ^{35 , 36 , 37 , 38 , 39} . Esperamos que nossos métodos conduzam a novas idéias fundamentais sobre a codificação gustativa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecção e Preparação de AmostraTubo de
Polipropileno, 15 mL Agulha Falcon	Fisher Scientific	14-959-53A
, Bisel Curto, 19 G x 1 - 1/2"	MONOJET	888200144	Para aplicar ar para remover os pelos da mariposa.
Modeladora Clay-Van Aken Plastalina	DickBlick	33268
Placa de Petri -100 x 15 mm	VWR International	89000-304
Ponta de pipeta (1 - 200 µ L)	USA Scientific	1111-0806
Lâmina de barbear	Techni Edge	TE05-071
22 AWG fio de conexão padrão	AlphaWire	1551	Para inserir a tromba na ponta da pippete.
Cera de cera batik	Jacquard	7946000
Encerador elétrico	Almore International	66000
Stereo Myscroscope	Leica	MZ75
Dumont #1 fórceps (grosso)	Instrumentos de Precisão Mundial	500335	Para remover gordura e tecido não nervoso.
Pinça de titânio Dumont #5 (fina)	World Precision Instruments	14096	Para remover gordura e tecido não nervoso.
Fórceps #5SF Dumont (superfino)	World Precision Instruments	500085	Para desembainhar o tecido nervoso.
Tesoura Vannas (fina)	World Precision Instruments	500086	Para remover a cutícula.
Colagenase / Spase	Sigma-Aldrich	11097113001
Epóxi	Permatex	84101
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo<	strong>Comentários
Sistema de Perfusão Salina
Conjunto de extensão com regulador de fluxo de taxa	B Braun Medical Inc.	V5200
IV conjunto de administração com local de injeção em Y	B Braun Medical Inc.	V1402
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Sistema de Entrega de Saborizantes
Tubulação de Nylon Translúcido Branco OD 1/4", ID 1/8"	Small Parts Inc.	B001JJT4SA	Tubo rígido que conecta os quatro elementos principais do sistema.
Ferro de solda	Circuit Specialists	ZD200BK
Ferramenta rotativa-Dremel	Dremel	4200
Malha de polipropileno, tamanho do furo (tamanho do furo 0.1 x 0.13 cm)	Rede Industrial	XN5170	Para garantir que as probóscides de diferentes animais sejam colocadas no mesmo local.
Sistema de perfusão pressurizado de 16 canais	Ferramentas de Biociência	PS-16H	Para entrega de sabor. Este sistema inclui válvulas de aperto, tubulação, coletor, cilindros de solução, controlador de válvula e acessórios de conexão.
Tubulação do polipropileno, identificação 0,034 ", identificação 0,050"	Becton, Dickinson & Co	427421	Tubo de saída do sistema de perfusão.
Instrumentos de	Precisão PicoPump World Pneumatic	SYS-PV820	Para controlar o canal de saída do sistema de perfusão.
Sistema de software de aquisição de dados, cartão DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4	National Instruments	LabVIEW 2011	Para controlar a bomba pico para entrega de saborizante e registrar os sinais do sensor de cor.
Bomba peristáltica Compulab 3 Manostat	Sigma	P1366	Para bombear água.
Tubulação de silicone, ID 1/16" OD 1/8"	Cole-Parmer	WU-95802-02	Para conectar a fonte de água à tubulação da bomba peristáltica e o tubo de saída da bomba ao tubo rígido do sistema de entrega.
Sensor de cor-sensor digital de fibra óptica	Keyence	FS-V31M	Para monitorar a entrega de sabores.
Unidade de fibra reflexiva com sensor de cor	Keyence	FU35-FZ	Para conectar o dispositivo sensor de cor.
Cera de periferia dentária	Henry-Schein Dental	6652151	Para fixar a tromba no tubo rígido.
		3,7 L	Para fornecer água ao sistema e recolher os resíduos de água.
Verde rápido FCF	Sigma	F7258
Pinça de curativo 25,5 cm	WPI	500364	Para introduzir probóscide de mariposa no orifício de tromba no tubo rígido.
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento de Eletrofisiologia
D.C. amplificador	Brown-Lee	440
Lâmpada	Schott	Schott Fostec Fonte de Luz DCR 2
Micromanipulador manual	Micromanipulador	Leica	Para inserir com precisão os tetrodos no cérebro do animal. O manipulador deve permitir movimentos finos e grosseiros nos eixos x, y e z.
Stereomicroscópio	Leica	MZ75
Mesa de isolamento de vibração (mesa de laboratório MICRO-g)	TMC	63-541
Osciloscópio	Tektronix
pré-amplificador de 16 canais e amplificador	Sistema de amplificador MA-800 de 16 canais	B.E.S 2013
Computador	Dell	optiplex 780	A seguir estão os requisitos mínimos recomendados. RAM: 3,32 GHz, 3 GB. Processador: Intel Core  2 Dupla. Placa gráfica: Intel GMA X4500 integrada.
Sistema de software de aquisição de dados, cartão DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4	National Instruments	LabVIEW 2011	Para controlar a bomba pico para entrega de saborizantes e registrar os sinais do sensor de cor e do eletrodo.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tastetants
KAc	Sigma-Aldrich	P5708
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
NaCl	Sigma-Aldrich	73575
Sacarose	Sigma-Aldrich	84097