Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

Summary

Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .

Abstract

Existem muitos estímulos biológicos que podem influenciar a diferenciação celular de comportamento e células-tronco. Abordagens de cultura celular geral dependem de fatores solúveis dentro o meio para controlar o comportamento de célula. No entanto, adições solúveis não podem imitar determinados motivos, tais como fatores de crescimento ligados a matriz de sinalização, sinalização celular e espaciais pistas bioquímicas, que são influências comuns em células. Além disso, as propriedades biofísicas da matriz, tais como a rigidez do substrato, desempenham importantes funções no destino da célula, que não é facilmente manipulado usando celular convencional, as práticas de cultivo. Neste método, descrevemos um protocolo simples para fornecer proteínas bioativas estampadas em hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) usando fotoquímica. Esta plataforma permite o controle independente de tacos de bioquímicos espaciais e rigidez do substrato. Estes hidrogel pode alcançar uma grande gama de valores de rigidez fisiologicamente relevantes. Além disso, as superfícies destes hidrogel podem ser photopatterned com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Esses métodos foram otimizados para manter a função da proteína após imobilização de superfície. Este é um protocolo versátil que pode ser aplicado a qualquer proteína ou peptídeo de interesse para criar uma variedade de padrões. Finalmente, células semeadas nas superfícies destes hidrogel bioativos podem ser monitoradas ao longo do tempo como eles respondem aos sinais espacialmente específicos.

Introduction

Existem muitos estímulos que influenciam o comportamento da célula. Geralmente, as técnicas de cultivo de célula típica dependem de fatores solúveis para eliciar respostas celulares; no entanto, existem limitações para esta abordagem. Esses métodos não são capazes de exibir com precisão todos os motivos de sinalização comumente encontrados in vivo. Tais mecanismos de sinalização incluem sequestrados e fatores de crescimento, sinalização celular, sinais bioquímicos espacialmente específicas. Além disso, a rigidez do substrato pode desempenhar um papel importante na diferenciação de comportamento e células-tronco de células e não é facilmente manipulado usando celular comum cultivo práticas^1,2. Abordagens de biomaterial para oferecer uma nova plataforma para começar a explorar esses mecanismos de sinalização. Em particular, o hidrogel é excelentes candidatos para ajuste de substrato rigidez^3,4, imobilização de proteínas e peptídeos^5,6e criando padrões específicos espacialmente^{7, 8}.

Hidrogel é comumente usados como andaimes em engenharia de tecidos devido a suas semelhanças bioquímicas e biofísicas com a matriz extracelular (ECM)^9,10. Polímeros naturais são opções comuns para andaimes, que são biocompatíveis e são encontrados em muitos tecidos do corpo. A limitação do uso de polímeros naturais como substratos é que faltam partes químicos facilmente manipulados para bioconjugation. Por outro lado, o hidrogel sintético, como tal como PEG, é excelentes plataformas para químicos alvo^11,12. Além disso, PEG hidrogel não eliciar uma resposta celular e, portanto, é usados como backbones de inertes para a criação de andaimes bioativos.

Para criar o hidrogel bioativos, tanto fotopolimerização e tiol-ene clique química reações são empregadas. Estes photoreactions requerem um fotoiniciador e uma fonte de luz UV. Quando Fotoiniciadores são introduzidas à luz UV, laços quebrar a radicais de formulário. Radicais de teses são necessários para iniciar a reação, mas podem afetar negativamente a proteína Bioatividade^12,13. Portanto, é fundamental otimizar o fotoiniciador e tempos de exposição UV para manter a bioatividade de proteína.

Neste método, o hidrogel é sintetizados através de acrilato-acrilato fotopolimerização de crescimento de cadeia. Monômeros de PEG-diacrylate (PEGDA) reagem uns com os outros para formar redes de polímero ramificado responsável pela estrutura do hidrogel. A concentração de monómeros PEGDA dentro da solução de precursor de gel controlará a rigidez do substrato. Devido o pequeno pore tamanho do hidrogel, proteínas de ECM como fibronectina podem ser facilmente incorporadas dentro o hidrogel para efeitos de fixação da célula. Finalmente, estes hidrogel pode ser superfície-estampados com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Aqui, não tenha reagidos acrilatos livre dentro do sistema de hidrogel reagirá com tióis livre localizados na proteína ou peptídeo quando exposto à luz UV. Depois que as proteínas ou peptídeos são imobilizados na superfície de hidrogel, o hidrogel pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas sem perder a bioatividade. Isto oferece conveniência, planejamento experimental flexíveis e a possibilidade de colaboração entre laboratórios. Em geral, esta plataforma permite biomecânica e espacial controle bioquímico, independente uns dos outros, pela oportunidade de influenciar o comportamento celular.

Protocol

1. preparação de materiais para a síntese do Hydrogel

1. preparar soluções estoque de PEGDA lítio fenil-2.4.6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina em condições estéreis e com base em cálculos (tabela 1A).
   1. Pesar e dissolver compostos em tampão fosfato salino (PBS). Normalmente, manter PEGDA trabalhando as concentrações de solução entre 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Adicionar a solução de PEGDA através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
      Nota: Manter as soluções PEGDA cobertas com uma folha de embrulho para protegê-los da luz. Preparar uma solução fresca de PEGDA (recomendado) para cada experimento.
   2. Reconstituir fibronectina proteína em pó baseia o fabricante ' recomendação de s. Manter a solução estoque de fibronectina em 1 mg/mL, alíquota, em alíquotas de 60 a 100 µ l e armazená-los a-20 º C até o uso. Descongelar as alíquotas a 4 ° C por várias horas ou durante a noite antes de usar. Se o estoque de proteína não é fornecido já em condições estéreis, use um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
      Nota: Fibronectina é usada para ligação de celular. Outras proteínas de ECM podem ser substituídas.
   3. Pesar LAP para a solução e dissolvê-lo em PBS; uma concentração típica de estoque é 25 mg/mL. Proceda à sonicação, se houver algum problema com a dissolução. Passe a solução através de um filtro de 0,22 µm para a esterilização. Cobrir o colo com um embrulho de papel alumínio e mantê-lo em 4 ° C por até diversos meses.
      Nota: O colo é o fotoiniciador utilizado para a fotoquímica.
2. Preparar moldes de slide de vidro estéril para formação de hidrogel. Folha de
   1. autoclave um poliéster; uma é necessária para cada molde de gel. Embeba duas lâminas de vidro e três espaçadores de plástico (0,5 mm de espessura) para cada molde gel em etanol a 70% pelo menos 2h, mas geralmente deixe de molho durante a noite. Mergulhe cinco grampos da pasta para cada molde gel em etanol a 70% por 10 min antes de usar.
   2. Coloque as lâminas de vidro, espaçadores e clips de fichário para uma pequena folha autoclavada do capuz de cultura celular de deixe-os secar ao ar durante várias horas.
   3. Preparar moldes de hidrogel, colocando espaçadores de plástico ao redor da borda de uma lâmina de vidro. Coloque a segunda lâmina de vidro na parte superior. Fixar os espaçadores firmemente ao lado do outro com grampos da pasta, dois de cada lado longo e por cima.
      Nota: Se isto não está montado corretamente, a solução de gel vai vazar para fora.
   4. Superfície-esterilizar o molde com cultura celular capa UV luz durante 30 min antes de usar. No meio, virar o molde para expor as duas superfícies.

2. Modificando as proteínas com um tiol livre

1. preparar soluções estoque usando cálculos de folha de cálculo para conversão de amina em thiol em proteínas (tabela 1A).
   1. Tornar o amortecedor da reação, ajustar a PBS pH 8 e adicionar 5 mM EDTA. Amortecedor da reação pipeta em um filtro de 0,22 µm seringa para esterilização.
      Nota: EDTA é importante, pois protege tióis formando ligações de bissulfeto. Grupos tiol devem permanecer em sua forma reduzida para a reação ocorrer.
   Pesar 2-iminothiolane
   2. (Traut ' s reagente) e dissolvê-lo no buffer de reação para uma concentração de solução-mãe de 2 mg/mL (14 mM). Passe a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização. Armazenar a solução a 4 ° C por até diversos meses.
      Nota: 2-iminothiolane é a molécula que reage com aminas livre expostas ao solvente sobre as proteínas e converte-os em livre tióis.
   3. Reconstituir a proteína no amortecedor da reação em concentrações entre 0,1 e 1 mg/mL. A menos que previamente estéril, pipetar esta solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
      Nota: Esta proteína é o sinal de bioquímico que irá ser modelado para a superfície de hidrogel. Também, enquanto as concentrações de proteína podem variar, concentrações mais altas são ideais para padrões de proteína mais fortes.
2. Reagir a proteína com 2-iminothiolane pela mistura de ambas as soluções estoque; use tabela 1B para calcular a proporção do volume correto. Normalmente, usar uma razão molar de 8:1-2-iminothiolane a proteína.
   Nota: Para maiores proteínas ou mais diluir concentrações, use uma maior taxa de molar de 2-iminothiolane. Consulte o fabricante ' s protocolo ¹⁵.
3. Incubar a reação por 1h à temperatura ambiente. Usar uma rotação do desalting microcoluna para remover o produto da proteína thiolated de reagentes remanescentes, seguindo o fabricante ' s protocolo ¹⁶.
   Nota: O limite de exclusão de resina é KDa 5.
4. Uso Ellman ' s do ensaio para medir quantitativamente o número de tióis livre por proteína. Siga o fabricante ' protocolo de s para o ensaio ¹⁷.

3. Formação de hidrogel

1. criar a solução de precursor de gel com base nos valores calculados da tabela 1. Misture o PEGDA, fibronectina e volumes de colo. Adicionar a solução vigorosamente para garantir uma solução homogénea, mas evitar a criação de bolhas. Manter a solução protegida da luz.
2. Adicionar o precursor de solução de gel cuidadosamente entre as lâminas de dois vidro do gel de molde. Normalmente, adicione um volume entre 800 e 1.000 µ l para o molde. Expor a solução de gel no molde à luz UV (comprimento de onda: 365 nm, potência: 3-4 mW/cm ²) para 1-2 min formar o hidrogel.
   Nota: Não exponha o hidrogel à prolongada luz UV, como que vai limitar a proteína de superfície padronização capacidades.
3. Tire os grampos da pasta e remover suavemente a lâmina de vidro superior aplicando-se em frente à pressão para os espaçadores de dois lado.
4. Use um soco biópsia apropriadamente dimensionados para cortar as amostras de hidrogel. Um soco hidrogel múltiplos do retângulo para servir como repetições e amostras de controlo de gel de.

4. Medições de rigidez de hidrogel

soco de biópsia

1. soco para fora hidrogel com 8 mm de diâmetro para um rheometer placa paralela de 8 mm. Carregar um hidrogel de amostra para o rheometer (consulte a Tabela de materiais).
2. Inferior a geometria da placa paralela que é de 8 mm de diâmetro até fazer contato com a superfície do gel. Manter uma distância de 0,5 mm para uma amostra de 0,5 mm de espessura de hidrogel.
3. Executar varreduras de tempo por 5 min à estirpe de 0,1%, 0,1 Hz de frequência e 37 ° C. média a G ' valores entre cada varredura de tempo. Executar o hidrogel independente para repetições de cada composição.
   Nota: A G ' valores devem ser estáveis em pontos de tempo; Se eles não são, por cento Coe e varreduras de frequência devem ser realizadas para selecionar o apropriado valores ¹⁴.

5. Padronização de proteína

1. preparar o padrão desejado para a Fotomáscara usando um programa de desenho (CAD) auxiliado por computador. Imprima a Fotomáscara em uma folha transparente usando uma impressora de alta resolução. Embeba a Fotomáscara em etanol a 70% por 10 min antes de usar. Permitir a Fotomáscara para o ar seco em uma capa de cultura celular antes do uso.
2. Adicionar a solução de proteína thiolated preparada na etapa 2 para a superfície do hidrogel de patrocínio de superfície. Pipetar 1-2 µ l/cm ² de thiolated solução de proteína para a superfície de cada gel recortada.
   Nota: É importante minimizar o volume de proteína; Adicione apenas o suficiente para cobrir uniformemente toda a superfície da amostra hidrogel.
3. Coloque cuidadosamente a Fotomáscara sobre a superfície do hidrogel. Não permita que as bolhas de ar entre a Fotomáscara e a superfície de hidrogel. Pressione suavemente para baixo a máscara para remover quaisquer bolhas que se formam.
4. Expor o hidrogel para uma segunda rodada de luz UV (comprimento de onda: 365 nm, potência: 3-4 mW/cm ²) para 30-60 s.
   Nota: É importante para o padrão de exposição a suficiente luz UV para criar um padrão forte sem causar a perda da função da proteína.
5. Lavar o hidrogel com PBS para remover espécies não tenha reagidos e coloque cada hidrogel dentro a placa bem. Tenha cuidado ao colocar o gel em cada poço; Certifique-se que a superfície padronizada é cara acima. Lave os géis em PBS a 4 ° C; géis são estáveis pelo menos duas semanas em 4 ° C.

6. Preparando o hidrogel para a propagação da célula

1. incubar os géis em meio basal por 5-10 min a 37 ° C, antes da semeadura. Para a veia umbilical humano em células endoteliais (HX), use EGM-2 meio sem fatores de crescimento. Minimizar o volume de meio adicionado a cada um para impedir hidrogel flutuante. Para uma placa de 48, usar um volume de 250 µ l de meio.
2. Spin para baixo a placa no x 300 g por 3 min garantir que o hidrogel está localizados no fundo do poço e não está flutuando. Faça isso imediatamente antes da semeadura de celular.

7. A semeadura em hidrogel de célula

1. uso padrão estéril pilha mamífera cultura para a propagação de células e experimental nos procedimentos. Remova HX de frascos de cultura de tecidos, usando protocolos de desprendimento de pilha padrão. Lave o prato de cultura de tecidos com PBS estéril e incubar com tripsina para 3-5 min a 37 ° C.
2. Saciar a suspensão de células trypsinized com solução de células em excesso médio ou tripsina neutralizador.
3. Spin para baixo a suspensão de eritrócitos na centrífuga a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter o centrifugado.
4. Resuspenda o pellet de células basais EGM-2 sem fatores de crescimento. Use um hemocytometer para a contagem celular.
Superfície de
5. Adicionar 75.000 células/cm ² para cada hidrogel pipetando lentamente para o centro de cada bem para não perturbar os géis. Coloque a placa bem em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C. Por vários dias, periodicamente, remover o prato para observação.

8. Avaliação da Bioatividade

1. cultura Escherichia coli durante a noite em suspensão no caldo LB em uma suspensão orbital a 37 ° C e 200 rpm. Spin para baixo a cultura de Escherichia coli, decantar e reconstituir o centrifugado em volume mínimo de PBS. Pesar a lisozima e reconstituir a 1 mg/mL da solução estoque.
2. Pipetar um volume pequeno (25 µ l) de solução-mãe de lisozima para tubos microcentrifuga. Adicionar níveis variados de fotoiniciador de colo (0-12 mM) e expor as amostras a 1min da luz UV. Em um grupo separado, adicionar a mesma quantidade de colo (2 mM) à solução de lisozima e expor amostras a diferentes tempos de luz UV (0-4 min). Incluem repetições para cada tratamento.
Solução de
3. Adicionar igual volume de concentrado de Escherichia coli para cada amostra de lisozima para uma concentração de proteína lisozima final de 0,5 mg/mL. Incubar as soluções mistas para 4 h à temperatura ambiente.
   Nota: Isso permite que tempo para lisozima funcional de lisar a parede celular bacteriana e liberar proteínas na solução.
4. Use não tratada lisozima incubada com e. coli para um controlo positivo; considere isto uma medição de bioativos de 100%. Use a solução de lisozima incubada com PBS sozinho como um controle negativo.
5. Spin para baixo as amostras para remover detritos celulares e manter o sobrenadante. Executar um ensaio de Bradford para quantificar a concentração total de proteína dentro do sobrenadante para medir a quantidade de lisado bacteriano.
6. Executar um ensaio de Bradford seguindo o fabricante ' s protocolo ¹⁸. Calcular a dobra mudança na concentração de proteína, comparada com o controle negativo.

Results

O protocolo para criar padrões de bioativos na superfície do PEG hidrogel é ilustrado na Figura 1. Uma folha de cálculo foi desenvolvida para calcular o volume e a concentração de cada solução estoque (quadro 1A). Proteínas para ser imobilizado na superfície do hidrogel são modificadas com 2-iminothiolane (Figura 1B). Esta reação é realizada usando os volumes da tabela 1B. A solu...

Discussion

Este protocolo fornece um método para criar padrões de proteína bioativos para aplicações biológicas. Existem várias modificações que podem ser feitas para se adaptar a este protocolo para experiências diferentes. Primeiro, requisitos de ligação de celular pode variar para diferentes tipos de células. Se acessório celular pobre para os géis é observado inicialmente, aumentando a concentração da proteína dentro da solução de precursor do ECM é aconselhada. Outras proteínas de ECM podem ser usadas em vez de fibronectina, i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diacrilato de PEG (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Também pode ser sintetizado ou comprado através de outros vendedores. Diferentes pesos moleculares podem ser usados.
Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP)			Sintetizado em laboratório
Fibronectina	Corning	356008	Outras proteínas de ligação celular podem ser usadas, como laminina, matrigel
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma	D8537-500ML
	Photomask FineLine Imaging	n/a	Impressões personalizadas em folhas transparentes com DPI de alta resolução.
Clipes de fichário	Vários fornecedores Fonte de
(365nm)	UVP	UVP-21	Outras fontes de luz UV podem ser usadas, é necessária a calibração da energia.
2-iminotiolano (Pierce Traut») s Reagente)	Thermo Sci.	26101
Ellman ' s Reagente: DTNB; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico)	Thermo Sci	22582
células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)	Lonza		entre 6-10
EGM-2 Mídia	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 sem fatores de crescimento foi usado em experimentos. Meio EGM-2 completo foi usado para manutenção celular
0,25% Tripsina EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizador de Tripsina	Life Tech	R-002-100
Centrífuga	Vários Vendedores
Hemocitômetro	Hausser Sci. Ácido
(EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22µ m filtro	Cell Treat	229743
1mL Seringa
Lâminas de Microscópio de Vidro	Fisher Sci.	Espaçadores de plástico 12-550C
	Vários Vendedores		0.5mm espessura
70% Etanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Colunas Microspin	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments