Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

Resumo

O presente método serve para identificar a isoforma específica inibidores da histona deacetilases (HDAC) em células HeLa pela análise de vários substratos UHPLC-MS. Este é um método livre de anticorpos desenvolvido para refletir a atividade HDAC1 e HDAC6 do vida ambiente celular, em contraste com o single-isoforma celular livre ensaios.

Resumo

A busca de novos inibidores de histona deacetilase (HDAC) é de crescente interesse na descoberta da droga. Isoform seletividade tem sido o centro das atenções desde a aprovação da romidepsin, uma classe eu HDAC inibidor para terapia do câncer e a investigação clínica de inibidores de HDAC6 específicos para mieloma múltiplo. O presente método é usado para determinar a atividade inibitória de compostos de teste em HDAC1 e HDAC6 nas células. A atividade isoform é medida usando a cromatografia líquida de ultraelevado-desempenho – análise de espectrometria de massa (UHPLC-MS) de substratos específicos incubados com as células HeLa tratadas e não tratadas. O método tem a vantagem de refletir a atividade HDAC endógena dentro do ambiente celular, em contraste com a bioquímicos celular livre ensaios realizados sobre isoformas isoladas. Além disso, porque é baseado na quantificação dos substratos sintéticos, o método não requer o reconhecimento de anticorpos endógenos proteínas acetilado. É facilmente adaptável para várias linhas de células e um processo automatizado. O método já provou útil em encontrar compostos HDAC6-seletiva em neuroblastos. Resultados representativos são mostrados aqui com a padrão HDAC inibidores tricostatina um (não-específica), MS275 (HDAC1-específico), e tubastatin um HDAC6 (específico) usando as células HeLa.

Introdução

Das HDACs pertencem a uma família de enzimas capazes de deacetylate histones dentro da estrutura da cromatina. Eles também têm outros substratos de proteína no citosol e localizam-se em vários compartimentos da célula. Um total de 18 HDAC isoformas foram identificados até agora e têm sido relacionados a vários mecanismos de célula, incluindo a regulação de factores de transcrição e expressão gênica, bem como sinalização celular e transporte^1,2,3,4,5,6,

Protocolo

1. cultura de pilha

Nota: As seguintes etapas são executadas em uma capa padrão de cultura de tecidos. Familiaridade com a técnica estéril é esperada.

1. Cultura de células HeLa a confluência de 80% em um frasco de cultura celular T75 em MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL).
   Nota: Célula cultura, tratamento e lise etapas são realizadas sob fluxo laminar, com passos de célula incubação a 37 ° C, realizado em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ em condições estéreis.
2. Lavar as células duas vezes com 5 mL de DPBS, Aspire o DPBS e adicione 1 mL do re....

Resultados

Para demonstrar a aplicação do método de identificação de inibidores não-seletivos e seletivos para HDAC1 (classe I) e HDAC6 (classe IIb), as células HeLa foram tratadas com compostos padrão conhecidos: tricostatina A (não-seletivo entre HDAC1 e HDAC6) tubastatin (HDAC6-seletivo inibidor)²⁰, MS275 (inibidor seletivo HDAC1)¹⁹e¹⁸. Usando o método presente (Figura 1), valores de IC₅₀

Discussão

Inibição de HDAC é um tema quente na descoberta de medicamentos, com foco atual em inibidores de HDAC6-seletivo para terapia de câncer²¹. Seletividade HDAC geralmente é avaliada por uma série de ensaios de alta produtividade, sem célula, que pretende determinar a potência inibitória no sentido individual HDAC isoformas²¹. No entanto, a seletividade de um inibidor deve ser adicionalmente confirmada em células vivas, avaliando o status de acetilação de substratos de proteína .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Sinônimo: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Tricostatina A	Sigma-Aldrich	T8552
Tuvastatina A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrila, grau HPLC	Fisher Scientific	10660131
Ácido fórmico, grau LC/MS	Fisher Scientific	10596814
H2O,	H2O destilado de grau
Células HeLa	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Dissociação celular reagente TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, grau de cultura celular	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Soro fetal bovino	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicilina-estreptomicina	Bioconcept	4-01F00-H
10x tampão RIPA	Abcam	ab156034
Comprimidos inibidores de protease SigmaFast	Sigma-Aldrich	S8820
estéreis, fundo plano, tratadas com cultura de tecidos Corning	VWR	29442-058
Placas de 96 poços, não estéreis, fundo em V Corning	VWR	29442-404	usado na etapa de centrifugação
Placa de 96 poços, fundo cônico, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatível com o sistema Acquity UHPLC
Frascos de cultura de células T75 Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Folha de selagem a quente destacável	Sistema Waters	186002789
Acquity UPLC	Centrífuga
Waters Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Software de integração: MassLynx V4.1	Waters		Número de catálogo não disponível
Seladora térmica combinada SP-0669/240	Waters		Número de catálogo não disponível
Quattro micro API Sistema Tandem Quadrupole	Waters		Número de catálogo não disponível

HPLC filtrado através de um sistema de purificação Milli-Q Placas de 96 poços ,