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Artigo de método

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

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DOI:

10.3791/55881

⸱

9 de setembro de 2017

 ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Information Center, Sabanci University, 3EFSUN, Center of Excellence for Functional Surfaces and Interfaces for Nano Diagnostics, Sabanci University

Neste artigo

Resumo

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.

Resumo

Interações da proteína-proteína são importantes para cascatas de sinalização celular de compreensão e identificação via novela componentes e dinâmica da proteína. A maioria dos celulares atividades exigem interações físicas entre proteínas. Para analisar e mapear essas interações, foram desenvolvidas várias técnicas experimentais como ferramentas de Bioinformática. Autofagia é um celular, mecanismo que permite que as células lidar com estressores diferentes, incluindo hipoxia, produtos químicos e nutriente privação de reciclagem. Para entender melhor a sinalização de eventos relacionados a autofagia e descobrir novos fatores que regulam a complexos de proteínas em autofagia, realizamos telas de interação da proteína-proteína. Validação destes resultados de rastreio requer o uso de técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência. Neste sistema, interações específicas relacionadas a autofagia da proteína-proteína que descobrimos foram testadas em Neuro2A (N2A) e HEK293T linhas de celulares. Detalhes dos procedimentos técnicos utilizados são explicadas neste documento visualizado experimento.

Introdução

Macroautophagy (autofagia, neste documento) é um mecanismo de estresse celular que se caracteriza por sequestro de citoplasma em massa, proteínas e organelas em vesículas de membrana dupla chamadas vesículas autophagic. Através da fusão da camada externa da membrana dupla, vesículas autophagic e sua carga são entregues aos lisossomos e degradado nele1. Autofagia ocorre em níveis basais baixos em todos os tipos de células e em todos os organismos, realizando funções homeostáticas como degradação proteica e volume de negócios das organelas (por exemplo, as mitocôndrias). Sob condições que levaram ao estresse celular, tais como a fome, a autofagia é rapidamente upregulated e permite que a célula manter os níveis de energia e metabolismo básico1,2,3.

Cerca de 30 genes de autofagia foram clonados de levedura e seus produtos de proteína foram mostrados a desempenhar um papel em várias etapas do processo de autophagic, incluindo a nucleação de vesículas, a expansão, a fusão de vesículas atrasado endosome/lisossomo, e degradação de carga 4 , 5. Orthologs da maioria destes genes têm sido identificados e estudos em vários organismos confirmaram a preservação de suas funções celulares6. Estudos na última década que mostraram vários autofagia relacionados com complexos de proteínas e interações da proteína-proteína existem e que eles governam vias de autofagia de forma intrincada e controlada. Interseções, backups, feedback e feedforward mecanismos existem, e eles permitem que a célula coordenar autofagia com outros eventos relacionados (tais como biogênese lisossoma secreção vesicular, CDDP triagem e transporte7, etc.) Em uma tela de imparcial fermento-dois híbrido usando a proteína de autofagia ATG5 como uma isca, (ATG5 é uma proteína de autofagia chave envolvidos no sistema de conjugação de E2, como que medeia LC3 lipidation de fome induzida autofagia), nós identificamos Receptor ativado C-quinase 1 (RACK1; GNB2L1) como um forte interactor e um componente de autofagia romance8. Importante, a tela mostrou que a interação ATG5-RACK1 era indispensável para indução de autofagia por indutores de autofagia clássica (ou seja, à fome e mTOR inibição).

Métodos baseados em imunofluorescência são comumente usados para monitorar as interações da proteína-proteína. Estas técnicas são principalmente à base de anticorpos e ajudam a visualizar as interações e confirmar suas localizações celulares. Nesta técnica, fluorescente tag anticorpos conjugados que são específicos para as proteínas de interesse são geralmente usadas para a coloração específica. Cada proteína pode ser rotulada com anticorpos acoplados a corantes fluorescentes diferentes. Usando anticorpos específicos de proteínas, uma sobreposição no sinal quando imagens são mescladas indica a localização co das proteínas sob microscopia confocal. A técnica é aplicável para as células ou tecidos mesmo. Técnicas de imunofluorescência fornecem pistas sobre a dinâmica de interação e ajudam a identificar o tamanho e a distribuição de complexos de proteínas, enquanto o rastreamento de alterações gerais na morfologia celular sob diferentes condições de9. Imunoprecipitação é outra técnica comumente usada de anticorpo-baseado que permite a análise de interações entre proteínas10de dado. Usando esta técnica, as proteínas de interesse são isoladas de células ou tecidos extrai usando anticorpos específicos, originando a precipitação de proteínas em um complexo ou em contacto com uma proteína de interesse. Co-imunoprecipitação, onde a proteína e sua co interactor são detectados, revela não só a interação entre as duas proteínas, mas pode medir a sua força de interação sob circunstâncias diferentes11.

Este protocolo descreve em técnicas de chave de detalhe que foram usadas para confirmar e caracterizar a interação ATG5-RACK1 e RACK1-LC3. O foco é sobre as técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação, com ênfase de passos críticos e armadilhas para pesquisa de autofagia, bem como sugestões de resolução de problemas.

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Protocolo

1. imunofluorescência

  1. HEK293T manter rim embrionário humano células em meio de glicose alta DMEM, e pilhas de neuroblasto N2A do rato em DMEM baixa média de glicose, em um 5% CO 2-umidificada incubadora a 37 ° C. Complementar os meios de cultura com soro bovino fetal 10% inactivadas pelo calor (FBS), antibióticos (50 U/mL penicilina, estreptomicina 50 de µ g/mL) e L-glutamina (2mm).
  2. Separar as células usando a tripsina 0,25%. Primeiro remova a mídia de cultura celular e depois lavar as células com 10 mL estéril fosfato salino (PBS) e incube com 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min. inativar tripsina, adicionando 2 mL de meio de DMEM.
  3. Lavar a placa bem pipetando. Remover 10 µ l de solução de célula e misturá-lo com 10 µ l de trypan azul. Contar o número de células vivas, usando um hemocytometer.
  4. Ambos HEK293T e N2A é linhas de células aderentes, no entanto, as células HEK293T desanexar da placa facilmente. Portanto, se trabalhar com linha de celular HEK293T, casaco do coverslides com estéril filtrados 0,01% poli-L-lisina antes da semeadura das células.
    1. Lugar coverslides estéril em uma placa de Petri de 10 cm. Adicione a quantidade apropriada de solução de poli-L-lisina sobre cada coverslide. Incubar a coverslides com solução de poli-L-lisina durante 10 min.
    2. Remover a solução de poli-L-lysine.
      Nota: Poli-L-lisina é re-utilizável; é opcional coletar e reutilizá-la para novas experiências. Desde que a poli-L-lisina é tóxico, esperar até que todos da solução sobre o coverslides completamente evapora e recuperar o poli-L-lisina.
    3. Lavar o coverslides com PBS estéril.
  5. Adicionar 1 mL de DMEM em cada poço de uma placa de 12. Coloque um coverslide em cada poço.
  6. Semente 20.000 células/poço, gota a gota, agitando a placa ao mesmo tempo para uma distribuição homogênea de células sobre o coverslides. Manter as células no CO 2 incubadora a 37 ° C e adicionar a droga para que o tempo de incubação no total não ultrapasse 48 h, ou seja, para 3h tratamento Torin, adicionar a droga na semeadura de post 45 h. Estudos de interação de
    1. para RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina e fome foram usados como indutores de autofagia. As células foram incubadas com 1 Torin para 3h (concentração final nM 250); com rapamicina para 16 h (concentração final nM 200); e com Earle ' s Balanced Salt solução (EBSS) por 2h para células de fome.
      Nota: Incubação em DMEM com 10% FBS foi usado como a condição de controle.
  7. Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia sobre a coverslides e lave-os com 1 mL de PBS.
  8. Para consertar as células, Incube as celulas com 1 mL gelo frio estéril filtrada 4% paraformaldeído (PFA) em 1X PBS (pH 7,4), por 20 min em temperatura ambiente sem qualquer agitação.
    Desde que o PFA é sensível à luz, manter (importante) a placa no escuro durante o período de incubação; pode ajudar a cobrir o prato com papel alumínio. Além disso, PFA é tóxico, portanto, trabalhar sob uma coifa ao reparar as células.
    Nota: Tenha em mente que a fixação passo em experimentos de imunofluorescência deve ser otimizada, como os anticorpos específicos podem funcionar melhor usando agentes de fixação diferentes e condições.
  9. Depois de 20 min de incubação de PFA, primeiro remova a solução PFA no coverslides e depois lavar cada amostra 3 vezes com 1 mL de PBS filtrado estéril. At esta etapa, (importante) lavar os poços, um por um, para não deixá-los secar. Evitar a secagem desde que irá interferir com reações subsequentes das células, alterar a morfologia da célula e aumentar os sinais inespecíficos.
  10. Quando a lavagem for concluída, mantenha as amostras em 1 mL de PBS na Ice.
  11. Preparar a solução de bloqueio: PBS com saponina de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% 0,1%.
  12. Cobrir uma placa de 6 com película de parafina. Certifique-se de que a placa inferior é suave após o revestimento de película de parafina. Rotular a placa 6.
  13. Usando uma pinça, o coverslides de transferência das placas 12-poços para as placas de 6-poços cobertos com a película de parafina.
  14. Descartar a PBS na coverslides e adicionar 100 µ l de solução para cada coverslide para permeabilização de bloqueio. Incubar as amostras no gelo por 30 min.
  15. Preparar o anticorpo primário em solução de bloqueio. Antes das experiências, otimizar as diluições de anticorpo para definir as melhores concentrações de trabalho para a coloração.
    Nota: por exemplo, LC3 anticorpo é usado com uma diluição de 1: 100 em solução de bloqueio.
  16. Após a incubação de 30 min, descartar a solução de bloqueio e lavar as amostras delicadamente com 1 mL de PBS uma vez.
    17. Adicione 100 µ l de solução de anticorpo primário para cada coverslide de
  17. . Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h, um agitador.
    Nota: O tempo de incubação com o anticorpo primário deve ser otimizado. Dependendo o anticorpo, uma incubação overnight a 4 ° C pode ser preferível. É melhor incubar um agitador suavemente (100 rotações/min) para distribuir igualmente o anticorpo sobre o coverslides.
  18. Após a incubação com o anticorpo primário, lavar as amostras individualmente, 3 vezes com 1 mL de PBS.
  19. 1: 500 preparar anticorpo secundário no bloqueio de solução (otimizações de diluições do anticorpo secundário podem ser necessárias). Aqui, anti-coelho IgG Alexa Fluor 568 utilizou-se como um anticorpo secundário de anti-coelho.
    1. Incubar as amostras com a 100 µ l de solução anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente em um shaker. Uma vez que os anticorpos secundários fluoróforo-etiquetados são sensíveis à luz, (importante) manter a solução no escuro. Colocar as amostras no escuro durante e após a incubação do anticorpo secundário.
  20. Após a incubação do anticorpo secundário, lavar a placa 3 vezes com PBS.
    Nota: Baed em experiência, alguns anticorpos têm sinais de fundo elevado que não podem ser eliminados pela PBS lava. Se lidar com tal um anticorpo, depois passo 1.21, manter as amostras em PBS a 4 ° C, durante 6 h pode ajudar.
    1. Se necessário, manchar as células com um corante de ligação a DNA, tais como a Hoechst, para marcar os núcleos.
  21. Para manchar mais do que uma proteína, aplicar o mesmo procedimento a partir da etapa 1.16 para a segunda proteína.
    1. Certifique-se que não há nenhuma reatividade de espécies entre os anticorpos ao realizar a coloração com mais de um anticorpo (por exemplo, uso do mouse e coelho anticorpos).
      Nota: Aqui, RACK1 está manchada como a segunda proteína usando anti-RACK1 anticorpos primários e os secundários anticorpos IgG Alexa Fluor 488 anti-rato usando as mesmas concentrações acima mencionadas.
  22. Preparar a solução de montagem: 50% glicerol em 1X PBS. Filtrar com um filtro de 22 µm.
  23. Limpe as lâminas com etanol utilizando um cotão e adicionar solução de montagem 10 µ l de cada slide. Usando uma pinça, coloque o coverslides em cada dropso que o lado com as células está em contato direto com o meio de montagem. Descartar a solução de montagem excesso suavemente usando toalhetes fiapos.
  24. Selar o coverslides com um esmalte transparente. Primeiro, estabilizar o coverslides adicionando gotas de esmalte nas 4 bordas e depois selá-los completamente.
  25. Analisar as amostras sob um microscópio confocal ou fluorescente logo que possível, desde que o sinal fluorescente pode descorar depois de algumas horas.
< classe p = "SaritaE_TITLE "> 2. Imunoprecipitação

  1. desanexar e contagem das células como descritas nos passos 1.2 e 1.3.
  2. De se trabalhar com células HEK293T, sementes 4 milhões de células para cada condição em placas de Petri 15 cm. Se trabalhar com células N2A, sementes de 5 milhões de células em placas de Petri 15 cm. Incubar as células numa incubadora de CO 2 a 37 ° C até o final do experimento.
  3. Tratar as células com as drogas relevantes ou condições por um prazo definido para que o tempo de incubação total das células não exceda 48 h.
    Nota: Para os testes de imunoprecipitação, neste estudo, as células foram tratadas por 3h com Torin 1 (250 nM), 16 h com rapamicina (200 nM) e 2 h com EBSS. DMEM com 10% FBS foi adicionado às células, como o controle.
  4. Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia e as células da colheita. Desde HEK293T células desprender facilmente do prato, lavar a placa com gelo frio PBS pode ser adequado para a colheita. No entanto, as células N2A são mais resistentes ao desprendimento; Raspe a célula para ajudar a colher as células.
    1. Recolher todas as pilhas em tubos microcentrifuga.
  5. Amostras de centrífuga a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C. descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de PBS por re-suspenso em pipetando.
  6. Repita a etapa de centrifugação, mas para a maior velocidade de centrifugação a 4 ° C, durante 15 min. descartar o sobrenadante.
  7. Buffer de ensaio de imuno-precipitação de rádio (RIPA) preparar antes de começar o experimento.
    Nota: Existem 3 tipos de amortecedor de RIPA; escolha de acordo com a intensidade de interação das proteínas sendo investigado (ver fórmulas abaixo).
    1. Se houver uma interação da proteína-proteína forte, escolha o amortecedor de RIPA regular.
    2. Se a interação é fraca, escolha suave RIPA ou mais suave RIPA.
      Nota: As receitas desses buffers são nas etapas a seguir. Todos os buffers que são usados em testes de imunoprecipitação devem ser complementados com inibidores de protease.
      1. Preparar o amortecedor de RIPA regular usando 1% NP-40, 150 mM NaCl, Deoxycholate do sódio de 0,5% e 0,1% sulfato dodecyl de sódio em 50 mM Tris de pH 8.
      2. Preparar suave RIPA Buffer usando Deoxycholate do 1% NP-40, 150 mM NaCl e 0,25% de sódio em 50 mM Tris de pH 7.5.
      3. Preparar o amortecedor de RIPA mais suave usando 1% Triton X 100, 137 mM de NaCl, 1% de glicerol e 1mm ortovanadato de sódio em 50 mM Tris de pH 7,4.
  8. Depois de escolher o amortecedor RIPA apropriado, complementar o buffer com inibidores de protease (RIPA +). Em seguida, lisar as células com 3x o volume do centrifugado em RIPA +.
  9. Vortex a suspensão por 15 s. mantê-lo no gelo por 5 min. repetir o vórtice e confeiteiro 5 vezes e então Centrifugar as amostras a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  10. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga e centrífuga para remover os resíduos de célula remanescente. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
  11. Diluir a proteína lysates 01:50 e prepara uma placa de 96 poços com espaço em branco e padrões. Diluir as amostras.
    1. Amostras de mistura com Bradford solução 01:20. Incube por 15 min no escuro.
    2. Medir a densidade óptica em comprimento de onda de 595 nm. Calcular a concentração de proteína usando valores de absorvância para cada amostra.
  12. o dia antes da colheita das células, casal mais grânulos de proteínas com anticorpos que são específicos para a proteína de interesse.
    1. Cortar a borda de uma ponta de 200 µ l com uma tesoura e use 25 µ l de chorume o talão para cada condição.
    2. Lave os grânulos de uma vez com 1 mL de PBS, uma vez com 1 mL de tampão RIPA e uma vez com 1 mL RIPA +. Realizar as etapas de lavagem a 3.300 x g, 4 ° C, durante 1 min.
    3. Após a última lavagem, adicione 300 µ l de RIPA + sobre as contas e adicione 1,5 µ g anticorpo é específico para a proteína a ser puxado para baixo.
    4. Incubar os tubos a noite a 4 ° C, em rotacao (20 rotações/min).
      Nota: Aqui, ATG5 era immunoprecipitated usando anticorpos específicos anti-ATG5.
  13. Após a incubação overnight de grânulos com o anticorpo, lave os grânulos de uma vez com PBS, uma vez com a RIPA e uma vez com RIPA + conforme descrito na etapa 2.12.2.
  14. Adicionar 2 mg de proteína lisada em grânulos para cada condição e completa o volume total de 300 µ l com RIPA + tubo de buffer /. Incubar os tubos durante a noite em um rotador a 4 ° C.
  15. Após a incubação, lave os grânulos como descritos anteriormente (etapa 2.12.2).
    1. Após a última lavagem, use a ponta da pipeta menor para remover todo o sobrenadante sem tocar os grânulos.
    2. Adicionar 10 µ l de 3 x tintura de carregamento: 6% SDS, 30% de glicerol, 16% β-Mercaptoetanol e azul de bromofenol 0,1% em 1M Tris-HCl pH 6,8.
  16. Preparar os controles de entrada usando o mínimo de 100 µ g proteína lisada para cada condição. Equalizar os volumes de amostra usando a água e adicionar o volume apropriado de 3x carregando tintura.
  17. Amostras de ferver a 95 ° C por 10 min.
    Nota: Normalmente quando ferver as amostras, as tampas dos tubos podem abrir espontaneamente e amostras são perdidas. Evitar isto mantendo as tampas fechadas com um bloqueador específico cap.
  18. Spin para baixo as amostras e carga em geles de SDS-PAGE para separar as proteínas de acordo com seus tamanhos usando protocolos padrão.
    Nota: Neste estudo sobre RACK1 e ATG5, as amostras foram executadas através de géis de poliacrilamida 12% em 80 V por 30 min e depois em 120 V para aproximadamente 90 min. No entanto, por mais pequenas proteínas tais como LC3, usar géis de poliacrilamida de 15% é mais adequado.
  19. Após o gel executando completo, transferir as proteínas para nitrocelulose ou membranas PVDF usando qualquer um dos métodos transferência molhada ou semi-seca. Em seguida, bloquear as membranas de incubação no leite desnatado de 5% em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) à temperatura ambiente para membranas de 1 h. lavagem 3 vezes com PBST 5 min.
  20. Incuba as membranas com anticorpos primários em concentrações de trabalho por 1h à temperatura ambiente. Para diluições de anticorpo primário, use BSA contendo soluções vermelhas (5% BSA Cohn V fração, 0,02% de azida de sódio em PBST, pH 7,5; adicionar vermelho de fenol adicionado como um marcador de pH) para permitir a reutilização de anticorpos.
    Nota: por exemplo, dilua ATG5 anticorpo x 2.000 na solução de vermelho.
    1. No final do tempo de incubação, lavar as membranas 3 vezes com PBST.
  21. Incubar as membranas com anticorpos secundarios conjugados a HRP que foram preparadas em solução de leite desnatado de 5% (aqui, anti-IgG de coelho no 1:10.000 foi usado). Em seguida, lave as membranas 3 x com PBST 5 min.
  22. Fazem a solução ECL: 25mm luminol, ácido cumarínico 9mm, 3 x 10 -4% H 2 O 2 em pH 70 mM Tris-HCl 8,8. Usar o fresco H 2 O 2 para cada experimento.
    Nota: A reação começa após H 2 < /sub > O 2 adição e continua por aproximadamente 20 min.
    1. Incubar as membranas e raio-x filmes por 20 min em ECL. Desenvolver e corrigi-los em uma sala escura.
  23. Para verificar a co-imunoprecipitação de proteínas com close ou sobreposição de pesos moleculares, pode ser necessário retirar os anticorpos fora das membranas incubando as membranas a 60 ° C por 30 min no buffer de descascamento: (pH 25 mM Tris-HCl 2 e 1% SDS).
  24. 2.20 a 2.23 repita os passos para verificar se há co-imunoprecipitação usando anticorpos diferentes. Por exemplo, após ATG5 de detecção e remoção das membranas, proteínas RACK1 foi testada sobre as membranas mesmas usando um anticorpo primário anti-RACK1 (1:1, 000) e anticorpos secundários (01:10, 000). Β-actina foi usado como o controle de carregamento; e sinal de IgG foi usado como o controle de carregamento para amostras de immunoprecipitated.

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Resultados

Na Figura 1 um exemplo de localização de co é mostrado o resultado obtido usando este protocolo. Uma figura do nosso papel recente é apresentada8. Aqui, proteína endógena RACK1 estava manchada de verde, enquanto LC3 endógena estava manchado de vermelho. Os pontos amarelos que são observados nas fotos mescladas indicam sites de sobreposição entre os sinais verdes e vermelhos. Assim, os pontos amarelos representam a localização co parcial destas duas proteínas.

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Discussão

As técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência são cruciais para o estudo das interações da proteína-proteína. Embora estas duas técnicas são comumente usadas e bem estabelecida, diversos critérios devem ser considerados para definir a qualidade das experiências ao usar estas técnicas.

Anticorpos primários, primeiros que são usados em testes devem ser específicos para as proteínas de interesse. Para garantir isso, use knockdowns shRNA ou células de nocaute para testar a especificidade d...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo científico e tecnológico pesquisa Conselho da Turquia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, da Universidade Sabanci. SEB e NMK são suportados por uma bolsa TUBITAK BIDEB 2211 para estudos de doutorado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Tripsina EDTA ABiological Industries BI03-050-1A
PBSGE HealthcareSH-30256.01
DMEM (glicose alta)Sigma 5671
DMEM (baixa glicose)Sigma5546
Trypan BlueSigmaT8154
HemocitômetroSigmaZ359629-1EA
cobre slidesJena BioscienceCSL-103
slidesIsolabI.075.02.005
Poly-L-LysineSigma P8920
TorinTocris4247
DMSOSigmaVWRSAD2650
EBSSBiological Industries BI02-010-1A
Paraformaldeído (PFA)Sigma15812-7
BSASigma  A4503
SaponinaSigma84510
LC3 AnticorpoSigmaL7543
Anti-Coelho IgG Alexa Fluor 568  InvitrogenA11011
RACK1 AnticorpoSanta Cruz Biotecnologia  sc-17754
Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488  InvitrogenA11001
NP-40ApplichemA16694.0250
Cloreto de SódioApplichemA9242.5000
Desoxicolato de sódioSigma30970
Dodecil sulfato de sódio (SDS)BiochemikaA2572
Trizma BaseSigmaT1503
Triton-X Applichem4975
Orthovanadato de sódioSigma450243
ATG5 AnticorpoSigmaA0856
GlicerolApplichemA4453
β-Mercaptoetanol ApplichemA1108.0250
Azul de bromofenol ApplichemA3640.0005
Leite desnatadoApplichemA0830
Tween 20SigmaP5927
Azida de SódioRiedel de Haen13412
Vermelho de fenol Sigma114537-5G
anti-coelho IgG, HRP conjugadoJackson Immuno. 
LuminolFluka9253
Ácido CuméricoSigmaC9008
Peróxido de hidrogênioMerckK35522500604
anti camundongo IgG, HRP conjugadoJackson Immuno.115035003
β-Actina AnticorpoSigma A5441
Soro normal de coelhoSanta Cruz Biotechnologysc-2027
RapamicinaSigma  R0395
Contas de Proteína A-AgaroseSanta Cruz Biotechnologysc-2001
soro fetal bovino Solução deS1810-500
Indústrias Biológicas 03-031-1B
L-glutaminaIndústrias BiológicasBI03-020-1B
Bradford SoluçãoSigma6916
Membrana de NitoceluloseGE HealthcareA10083108
Filmes de raios-XFujifilm47410 19289
Inibidor de proteaseSigmaP8340
1110305144 penicilina/estreptomicina Biowest

Referências

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