Artigo de método
Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.
A eletroporação in utero é uma abordagem rápida e poderosa para estudar o processo de migração radial no córtex cerebral do desenvolvimento de embriões de ratos. Ele ajudou a descrever os diferentes passos da migração radial e caracterizar os mecanismos moleculares que controlam esse processo. Para analisar de forma direta e dinâmica os neurônios migratórios, eles devem ser rastreados ao longo do tempo. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que combina in utero eletroporação com cultura de fatias organotípicas e imagens confocais temporizadas, o que permite um exame direto e análise dinâmica de neurônios corticais de migração radial. Além disso, é possível caracterizar detalhadamente neurônios migratórios, como velocidade de migração, perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação radial. O método pode ser facilmente adaptado para realizar análises funcionais de genes de interesse em neurônios corticais de migração radial por perda e ganho de função, bem como experiências de resgate. Espaço de tempoA imagem dos neurônios migratórios é uma técnica de última geração que, uma vez estabelecida, é uma ferramenta potente para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral em modelos de ratos de transtornos de migração neuronal.
O neocórtex é o principal site de funções cognitivas, emocionais e sensório-motoras. É composto de seis camadas horizontais orientadas em paralelo à superfície do cérebro. Durante o desenvolvimento, as células progenitoras na parede lateral do telencefalo dorsal dão origem a neurônios de projeção que migram radialmente para a superfície do pial e adquirem uma identidade neuronal específica do tipo de camada. Depois de serem geradas nas zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ), esses neurônios se tornam transitoriamente multipolar e diminuem sua migração. Após uma curta permanência na zona intermediária (IZ), eles mudam para uma morfologia bipolar, se prende ....
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Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de Assistência Ambiental Animal (Regierungspräsidium Tübingen) e executados de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal e a Diretiva da UE 2010/63 / UE.
1. Em Utero Electroporation
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Anteriormente, mostrámos que a eliminação genética de BCL11A por electroporação em útero prejudica a migração radial da camada superior de neurónios de projecção final-nascido 10. A eletroporação de um vector de plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP eliminou eficientemente Bcl11a em cérebros Bcl11a flox / flox condicionais 11 . Quando analisamos os céreos eletroporados E14.5 três dias.......
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A migração radial é um processo chave no desenvolvimento do neocórtex. As mutações em genes que afetam diferentes etapas deste processo podem causar malformações corticais graves, incluindo hepatite lissencefálica e heterotopia de matéria branca 1 , 2 . Recentemente, mostramos que Bcl11a, que é expressa em jovens neurônios de projeção cortical migratória, desempenha um papel na migração radial. Utilizamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratór.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Agradecemos Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer por uma excelente assistência técnica, bem como por Victor Tarabykin para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| Placa de 6 poços | Corning | 351146 | |
| Placa de 12 poços | Corning | 351143 | |
| sutura cirúrgica não absorvível | Ethicon | K890H | 3/8 círculo, 13 mm, ponta cônica |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrilhado, comprimento: 12 cm |
| tesoura fina | Fine Science Tools | 14063-09 | inclinado para o lado, comprimento: 9 cm |
| Suporte de Agulha Mathieu | Ferramentas | 12510-14 | carboneto de tungstênio, comprimento: pinça |
| de ponta fina | Ferramentas de Ciência Fina | 11370-40 | reta, 11 cm |
| Vannas Tü bingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | inclinado para cima, 9,5 cm |
| pinça de anel | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2,2 mm, comprimento: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030081 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| soro de cavalo | Gibco | ||
| BME | Gibco | 41010026 | |
| capilares de vidro borossilicato | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm |
| sistema de anestesia | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| câmara de anestesia | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| recipiente de filtro fluosorber | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| micrótomo de lâmina vibratória | |||
| Microscópio estéreo de fluorescência | Leica | M205 FA | |
| microscópio confocal de varredura a laser | Leica | TCS SP5II | |
| detector híbrido | Leica | HyD | |
| objetiva, 40x/0,60 NA | Sistema | Leica 11506201 | |
| Imaging Services | Cube, Brick & Inserção | ||
| Millipore | PICM0RG50 | ||
| microgrinder | Narishige | EG-45 | usa ângulo de 38° para chanfrar |
| o microinjetor | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofeno | Pfizer Saúde Animal | NDC 61106-8507 | Molde de emdedding Rimadyl |
| Polysciences | 18986-1 | ||
| kit maxi de plasmídeo livre de endotoxinas | Qiagen | 12362 | |
| verde rápido | Sigma | F7252 | |
| laminina | Sigma | L2020 | |
| poli-L-lisina | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glicose | Sigma | G6152 | |
| cloreto de cálcio | Sigma | C7902 | |
| sulfato de magensium | Sigma | M2643 | |
| bicarbonato de sódio | Sigma | S6297 | |
| eletroporador de onda quadrada | Sonidel | CUY21EDIT | |
| pinças com elétrodos de disco de platina de 5 mm | Sonidel | CUY650P5 | |
| extrator de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | |
| filamento de caixa | Sutter Instrument | FB255B | 2,5 mm x 2,5 mm |
| VWR | 231-0191 | de 185 mm x 5 mm | |
| , 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
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