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Artigo de método

Modelo do rato da partição fígado associando e ligadura da veia porta para procedimento encenado Hepatectomy (ALPPS)

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DOI:

10.3791/55895

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14 de agosto de 2017

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Neste artigo

Resumo

Indução rápida hipertrofia hepática usando associando partição do fígado e ligadura da veia porta para um hepatectomy encenada (ALPPS) tem sido proposto para ressecção de tumores no fígado ressecável no limite. Este modelo pode elucidar os mecanismos envolvidos na hipertrofia rápida e permite testes de drogas que promovem ou bloqueiam a aceleração da regeneração.

Resumo

Dados clínicos recentes suportam uma abordagem cirúrgica agressiva para tumores primário e metastático no fígado. Para algumas indicações, como metástases hepáticas colo-rectal, a quantidade de tecido hepático deixados para trás após ressecção hepática tornou-se o principal fator limitante do resectability dos grandes ou múltiplos tumores no fígado. Uma quantidade mínima de tecido funcional é necessária para evitar a complicação grave da post-hepatectomy insuficiência hepática, que tem alta taxa de morbidade e mortalidade. Induzir o fígado crescimento do potencial remanescente antes da ressecção tornam-se mais estabeleceu em cirurgia do fígado, ou sob a forma de embolização da veia porta por radiologistas intervencionistas, ou na forma de ligadura de veia porta várias semanas antes da ressecção. Recentemente, foi demonstrado que a regeneração hepática é mais extensa e rápida, quando a transecção parenquimatosa é adicionada à ligadura da veia porta numa primeira fase e, em seguida, após apenas uma semana de espera, ressecção realizada numa segunda fase (partição associando com o fígado e ligadura da veia porta para encenada hepatectomy = ALPPS). ALPPS rapidamente se tornou popular em todo o mundo, mas tem sido criticado por sua mortalidade perioperatória alta. O mecanismo de crescimento acelerado e extenso induzido por este procedimento não tem sido bem compreendido. Modelos animais foram desenvolvidos para explorar os mecanismos fisiológicos e moleculares de regeneração hepática acelerada em ALPPS. Este protocolo apresenta um modelo do rato que permite a exploração mecanicista da regeneração acelerada.

Introdução

O tamanho do fígado remanescente limita a resectability de tumores no fígado. 1 em geral, quando inferior a 25% fígado tecido é deixado para trás, o paciente está em risco aumentado de morte por insuficiência hepática aguda devido à falta de função metabólica para o organismo inteiro ("pequeno demais para síndrome de tamanho"). 2 este post-hepatectomy insuficiência hepática é a complicação mais devastadora após ressecção hepática. Portanto os médicos tentaram induzir a regeneração hepática antes da ressecção do fígado manipulando o fluxo da veia portal. 3 verificou que, uma vez que a veia porta é obstruída, a parte restante com o fluxo da veia porta começa a crescer a um ritmo lento e, assim, pode aumentar até 60% no tamanho. Ligadura cirúrgica5 ou intervencionista veia porta 4 oclusão ambos foram clinicamente estabelecidos. 4 o aumento do volume e função do fígado é confiável, mas a taxa de crescimento do fígado após oclusão portal é apenas cerca de um quinto em comparação com o crescimento do fígado remanescente após hepatectomy parcial. 6

O tempo necessário para o fígado crescer é semanas a meses, mesmo que o fígado pode regenerar em uma taxa muito mais rápida após a ressecção. Como tal, o fígado é o único órgão que cresce voltar à função normal após a remoção de uma parte dela. 7 um novel procedimento induzindo a regeneração hepática em um ritmo semelhante como depois hepactectomy parcial foi desenvolvido por um grupo de cirurgiões quem descobriu que adicionando uma transecção entre o obscurecidas e a parte não-obstruída do fígado induz o fígado hipertrofia com a mesma taxa de crescimento, como após a ressecção hepática, mas antes da ressecção. 9 o procedimento inicia rápida hipertrofia de 80% dentro de um remanescente de semana fígado no futuro, o que permite a ressecção de tumores extensos, principalmente irressecável, fígados dentro de uma semana. O procedimento foi chamado "Associação ligadura da partição do fígado e da veia porta para encenada hepatectomy = ALPPS" e tornou-se rapidamente popular em todo o mundo. 10 vários relatórios de suporte para uma expansão da resectability de tumores no fígado ressecável no limite alcançado pela nova técnica,11 enquanto o complexo procedimento cirúrgico também foi criticado por sua taxa de complicação de alta. 12 , 13

O desenvolvimento de um roedor e também grandes modelos animais de lenta e rápida hipertrofia tem sido tentados desde a publicação do ALPPS em 2012 para permitir uma melhor caracterização histológica e a compreensão dos mecanismos e para testar os efeitos de drogas sobre o taxas de crescimento diferente de tecido do fígado em animais. O primeiro modelo animal desenvolvido foi um modelo do rato. Neste modelo, hipertrofia rápida após a transecção parenquimatosa entre o direito e a parte esquerda do lobo mediano acelerado regeneração do lobo bem mediano. 14 um modelo diferente foi introduzido mais tarde no mouse. Neste modelo o lóbulo lateral esquerdo foi ressecado e os ramos da veia porta para cada lóbulo do fígado exceto o lóbulo mediano esquerdo foram amarrados. 15 entretanto, grandes modelos animais de ALPPS em suínos foram descritos também. 16

Para o estudo dos mecanismos fisiológicos, como alterações de fluxo e pressão na veia porta, perfusão e oxigenação do tecido do fígado, o modelo de rato é superior ao modelo de ALPPS em camundongos. Outra vantagem do rato sobre o modelo murino é que no modelo de rato, não há nenhuma necessidade para uma ressecção do lóbulo lateral esquerdo,15 que possam contaminar os efeitos da ressecção hepática com aqueles de ALPPS. O modelo de rato em contraste não reduz o fígado massa celular. Um modelo de porco usa o lóbulo direito posterior do lóbulo crescente, mas o fígado de porco é altamente lobulado. Portanto, é difícil criar um avião de transecção na ponte de tecido já fina entre o posterior direito e o lobo anterior direita. Em contraste, o lóbulo mediano em ratos consistem de duas partes que são fornecidas separadamente por uma veia porta cada e um avião transecção parenquimatosa pode ser facilmente criado entre os dois usando técnicas microcirúrgicos. A disponibilidade de computador pequeno animal tomografia computadorizada (TC) e/ou ressonância magnética (MRI) permite a quantificação muito exata do crescimento volumétrico entre ligadura da veia porta sozinha e ligadura da veia porta e a transecção adicionada, que é importante para a validação de qualquer modelo de rápida hipertrofia hepática.

O protocolo aqui apresentado descreve a técnica cirúrgica e procedimentos usados para validação volumétrica e Caracterização fisiológica do modelo de lenta e rápida hipertrofia após ligadura da veia porta e ligadura da veia porta com transecção, respectivamente, em ratos.

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Protocolo

Todos os experimentos neste protocolo foram aprovados pelas autoridades veterinárias do Cantão de Zurique, Suíça (número 60/2014). Além disso, todas as etapas experimentais foram realizadas em estrita conformidade com as orientações em experiências com animais pelas diretrizes da Federação de Europeu laboratório Animal ciência associações (FELASA) e o suíço Academia de ciências médicas (SAMS) .

1. criação de animais, sala de operação de equipamentos e instrumentos, anestesia

  1. Manter ratos Wistar machos, com um peso de 250-300 g em gaiolas ventiladas condições normais isentos de agentes patogénicos em um ciclo claro/escuro de 12/12 h. Dê animais livre acesso à comida e água a uma temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C.
  2. Induzir a anestesia em uma caixa, onde o isoflurano é liberado com 5% de vol para 30 s (figura 1A), seguido por uma concentração de isoflurano de 3% vol., até que o animal está sob anestesia profunda. Confirme o nível da anestesia com o reflexo de dedo-pinch.
  3. Proporcionar analgesia usando por via subcutânea aplicada buprenorfina (0,01 mg/kg), durante a intervenção cirúrgica, seguida de 0,02 mg/kg cada 12 h na fase do pós-operatório por 48 h.
  4. Transferir o animal para o local de trabalho, onde eles espontaneamente estão exposto a uma mistura de gás de 1,0-2,5 vol % isoflurano em oxigênio para respirar (fluxo: 600 mL/min).
  5. Feche os olhos do animal e usar uma pomada para proteger os olhos. Injetar soro fisiológico 5 mL por via subcutânea, metade de cada lado do abdômen, seguido de atropina de 0,1 mg.
  6. Realizar uma cirurgia usando um microscópio cirúrgico em um quarto de microcirurgia.
  7. Manter o animal sob anestesia volátil, usando uma máscara de ventilação, consistindo de uma membrana de látex (figura 1B), através do qual o focinho do rato é empurrado. Fixe as extremidades com fita adesiva (figura 1B).
  8. Dispor os instrumentos cirúrgicos de forma estéril em uma tabela lateral: soro fisiológico e Betadine embebido esponjas (Figura 2A), abdominais parede retractores (Figura 2B), assim como as suturas 3-0 para a retração da parede abdominal e xifoide, tesouras, Adson fórceps, bem um microfórceps dicas em linha reta e curvas e pré-cortado, gravatas de seda 6-0 para o procedimento da ligadura (Figura 2).
  9. Use um microfórceps bipolar não-colagem por transecção do parênquima hepático. Feche a parede abdominal e pele com suturas de seda 3-0 com agulhas de SH-1 e 5-0 Maxon (Figura 2D). Use uma pinça bipolar para hemostasia.

2. início da cirurgia

  1. Raspe o abdômen do animal com um aparador de cabelo animal pequeno de xifoide para os órgãos genitais com uma lateral da área de 2 cm da linha média. Remova completamente o cabelo.
  2. Desinfecte esta área 3 vezes com betadine embebido esponjas.
  3. Realizar uma incisão com um bisturi para a pele e em seguida, use uma tesoura cirúrgica para abrir o abdômen.
  4. Retrai o direito e a parede abdominal esquerda e xifoide com suturas de seda 3-0 (Figura 3A).
  5. Retrai o estômago, cólon e intestino do ligamento hepatoduodenal do rato com retractores fio pequeno self-made (Figura 3B).

3. a veia porta ligadura (LPC)

  1. Acessar a veia porta e seus ramos lateral retração do estômago e do intestino delgado (Figura 3B).
  2. Disse a veia porta sem rodeios por pegar o peritônio com o microfórceps e lentamente descascar-medialmente.
  3. Dissecar os ramos da veia porta para fora (Figura 3) na seguinte sequência: ramo (1) bem posterior, (2) deixou o ramo mediano lateral e esquerdo juntos e (3) caudado filial.
    1. Primeiro, retire o peritônio com movimentos pequenos, não muito enérgicos para evitar rasgar os pequenos ramos arteriais que os lóbulos do fígado que executam diretamente sob a cobertura peritoneal.
    2. Uma vez que a veia porta principal é desnudada, cercar os ramos com lento empurrando para a frente e espalhando os movimentos e, em seguida, puxe um pedaço de 1 cm de seda 6-0 amarrem em torno da filial respectiva veia porta e ligam-lo.
  4. Ligam o ramo lobo bem posterior. (Figura 3) A dificuldade técnica do ramo direito posterior consiste no fato de que a artéria para o lóbulo direito posterior cruza o ramo de veia portal bem posterior.
    1. Puxe a artéria cranialmente juntamente com o peritônio para expor o ramo de veia portal certa com o microfórceps curvo.
    2. Ligate ramo lóbulo direito posterior com o pré-cortado, gravata de seda 6-0. O lóbulo direito posterior transforma visivelmente pálido, uma vez que a veia porta é ligada.
    3. Evite empurrar contra resistência durante os cercando para evitar rasgar a artéria ou a veia porta. Em caso de sangramento, aplique pressão pelo menos um minuto com um cotonete estéril e então reavaliar. Se o sangramento não parar, sacrifica o animal.
  5. Ligate a lateral esquerda (LLL) e lóbulo mediano esquerdo (LML) ramos. Estes ramos tem um tronco comum. (Figura 3). O ramo lobo mediano esquerdo surge a partir da veia portal dentro do parênquima do LLL.
    1. Ligate a veia porta, levando a ambos da La Leche League e também o amor meu ramo vida juntos usando o Pre-corte gravata de seda 6-0.
    2. Evitar danos às artérias levando a LLL e amo minha vida, correndo dentro da camada peritoneal. Enquanto o peritônio é descascado volta cuidadosamente, eles ficam intactos. O LLL e amor minha vida transformar visivelmente pálido quando os ramos são ligados.
  6. Ligate ramo lobo caudado (Figura 3). A veia porta, levando a pouco separados lobos caudados em ratos decola da veia portal principal, distal e medialmente para a decolagem do ramo lobo direito da veia portal principal (não estritamente inferiormente como em seres humanos ou animais maiores).
    1. Dissecá-lo para fora e cercá-lo, levantando o peritônio plus ducto biliar e artérias da veia portal principal.
    2. Cercar o ramo caudado veia porta com um microfórceps curvo, vindo de lateralmente. Os dois lobos caudados empalidecer visivelmente, uma vez que o ramo lobo caudado é ligado com seda 6-0.
  7. Amarrando a estes três ramos da veia porta leva a exclusiva veia porta perfusão do lobo bem mediana (RML), que é visível por uma linha de demarcação distintas entre o lobo médio direito e esquerdo.

4. a veia porta ligadura com transecção (PVL + T)

  1. Executar a transecção ao longo da linha de demarcação entre RML e amo a minha vida depois de LPC (Figura 3D).
  2. Use uma pinça de prata bipolar não-furando com uma ponta muito fina e neurocirúrgica para precauterize o tecido hepático, criando uma faixa de cauterização de 1 mm ao longo da linha de demarcação.
  3. Use a tesoura para corte cuidadosamente o tecido precauterized. É bastante difícil de avaliar correctamente a profundidade da transecção. O objetivo é aproximar a cava quanto possível, que corre intrahepatically em ratos. Lesão de veia cava é acompanhado de extensa hemorragia, que geralmente pode não ser parada.
  4. Em caso de lesão, aplique uma pressão suave usando um cotonete de algodão, mas se o sangramento não parar dentro de 3-4 min, sacrificar o animal. Geralmente, as tentativas de reparar a veia cava usando suturas foram infrutíferas. Ratos são muito sensíveis ao ar embolia, que pode ocorrer na ocasião e levar à parada cardíaca.

5. intra-operatória medição da pressão da veia porta e fluxo de Volume

  1. Avalie a pressão da veia porta por canulação direta com uma agulha G30 conectada a um monitor de pressão (Figura 4A).
  2. Uso a sonda de fluxo de volume de 2mm colocada lateralmente ligado ao dispositivo de fluxo por medição directa do fluxo volumétrico portal mais 2 min (Figura 4B). Só gravar dados com qualidade estável de medição conforme indicado no display da máquina.
  3. Avaliar a pressão e o fluxo da veia porta separadamente após o grupo das etapas que definem o procedimento respectivo, ou seja, a subordinação de três ramos da veia porta ou o amarrando fora os três ramos da veia porta plus realizando a transecção parenquimatosa entre o amor e a RML minha vida.

6. últimos passos da cirurgia

  1. Certifique-se de que o intestino está colocado corretamente na cavidade abdominal antes de fechar.
  2. Feche o peritônio e a parede abdominal com suturas de seda 3-0 com agulhas de SH-1.
  3. Finalmente a sutura da pele usando Maxon 5-0.
  4. Desinfecte a pele novamente.
  5. Aplica novamente soro fisiológico 5 mL por via subcutânea para o tecido subcutâneo lateral no abdômen.

7. fígada volumetria em ratos utilizando pequeno Animal CT

  1. 24 h antes da primeira imagem latente de CT injetar 200 μL do agente de contraste na veia da cauda através de um cateter intravenoso G26.
  2. Use um micro CT para digitalizar os ratos. Coloque o animal em uma caixa de acrílico para induzir anestesia geral (Primeiro lave com 5% de vol por 30 s, seguido por uma concentração de isoflurano de 2-3% vol., até que o animal é anestesiado e mantê-lo em toda a varredura através de um sistema de tubulação). Para qualidade de imagem ideal, sincronize a tomografia computadorizada com a respiração do animal.
  3. Exportar a imagem digital e comunicações em arquivos de medicina (DICOM) e analisá-los usando o domínio público de imagem plataforma OsiriX 8.0. Use a ferramenta "polígono fechado" para desenhar as bordas de lóbulo baseadas o radiodensitiy do contraste de nanopartículas no fígado e usar a região de menu de interesse (ROI) para calcular volumes parciais de fígado (ver Figura 2A em Schadde et al . 17.)
  4. No modelo padrão, permitir que o fígado a crescer durante 3 dias e obter diariamente Tomografias computadorizadas para avaliar o aumento de volume.

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Resultados

A ligadura da veia porta de dois procedimentos cirúrgicos diferentes (LPC) e LPC com resultado de transecção (PVL + T) na cinética de crescimento distintamente diferentes. PVL induz aumento de volume moderado dentro de 3 dias, enquanto que no LPC + T um lobo bem mediano muito maior (RML) pode ser visto (Figura 5). Isto pode ser verificado por volumetria diária. O volume da RML aproximadamente dobra dentro de 3 dias no LPC, enquanto que triplica em PVL + T.

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Discussão

Este protocolo apresenta um modelo animal de ALPPS com sua rápida hipertrofia induzida pelo LPC + T, que aproximadamente dobra o aumento de volume dentro de 3 dias em relação ao LPC sozinho. 17 o lobo hepático direito médio é usado como um lobo de modelo para o crescimento do fígado porque o lobo médio hepático é uma massa parenquimatosa contígua fornecida por duas veias portal separadas para sua esquerda e a sua direita, como mostrado na Figura 1 , em uma reserva tra...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores têm sem agradecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Isoflurano, garrafas de 250 mLAttane, Piramal, Mumbai, ÍndiaLDNI 22098Equipamento veterinário padrão
Vaporizador de isofluorano Tec-3Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, ILnão está mais disponívelEquipamento veterinário padrão 
Buprenorfina (Temgesic)Indivior, Baar, Suíça7680419310353
pomada de vitamina ABausch& Lomp, Zug, Suíça7680223980247com número GTIN
0,5 mg/mLSintetica SA, Mendrisio, Suíça7680565330045Microscópio de microcirurgia com número GTIN
Olympus, Tóquio, JapãoSZX10Equipamento veterinário padrão
BetadineMundipharma, Basileia, Suíça7680342821377Esponjas com número GTIN
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, AlemanhaNK83.1Mini-esponjas
Afastadores de Parede AbdominalN/AN/AFeito por si mesmo a partir de clipes de papel e cotonetes
3-0 seda Ethicon, Sommerville, NJK872HTesoura cirúrgica padrão
 Instrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL503371Adson microcirúrgica padrão
Instrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL501244-GMicropinças microcirúrgicas padrão
de pontas finasInstrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL501976As pontas precisam ser polidas regularmente
Micropinças de pontas finas curvasInstrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL504513Essencial para contornar os ramos da veia porta 
6-0 LOOK seda trançada pretaSurgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA SP114Carretel, pré-cortado antes do procedimento
2-0 suturas de sedaEthicon, Sommerville, NJK833Suturas maxon cirúrgicas
padrão 5-0Covidien, Dublin, Irlanda6608-21
Micropinças bipolaresSutter, Freiburg, Alemanha780148SGSEssencial para transecção parenquimatosa
Q-tips smallCarl Roth GmbH, Karlsruhe, AlemanhaEH11.1Pontas cirúrgicas padrão
Q-tips bigCarl Roth GmbH, Karlsruhe, AlemanhaXL54.1Agulha cirúrgica padrão
G30 Terumo, Tóquio, JapãoNN-3013R Equipamento de anestesia padrão
Sonda de fluxo volumétrico de 2 mm Transonic Systems, Ithaca, NYMA-2PSA menor sonda disponível para medidor de fluxo HAT-311
Medidor de fluxo transônico TransonicSystems, Ithaca, NYHAT-311 Medidor de fluxo transsônico QCUm dos  medidores de fluxo de primeira geração para cirurgia
ExiTron nano 12,000 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha130-095-698 Meio decontraste nanomoloecular que opacifica o fígado e o baço
Cateter intravenoso G26Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ391349Equipamento de anestesia padrão
Quantum FX MicroCT Perkin Elmer, Waltham, MAN / ATomografia computadorizada padrão para pequenos animais no instituto de fisiologia da Universidade de Z & uuml; rico
OsiriX 8.0Pixmeo Sarl, Genebra, SuíçaN/ASoftware de domínio público : www.pixmeo.com
com número GTIN Sulfato de atropina Pinça cirúrgicas padrão

Referências

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