Artigo de método

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

DOI:

10.3791/55910

⸱

10 de junho de 2017

 ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry, Beijing Forestry University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aplicação da imagem de Raman para planta de biomassa está aumentando porque pode oferecer informações espaciais e de composição sobre soluções aquosas. A análise geralmente não requer preparação extensiva de amostras; As informações estruturais e químicas podem ser obtidas sem rotulagem. No entanto, cada imagem Raman contém milhares de espectros; Isso levanta dificuldades ao extrair informações ocultas, especialmente para componentes com estruturas químicas semelhantes. Este trabalho apresenta uma análise multivariada para resolver esta questão. O protocolo estabelece um método geral para visualizar os principais componentes, incluindo lignina, celulose e hemicelulose dentro da parede celular da planta. Neste protocolo, são descritos os procedimentos para preparação de amostras, aquisição espectral e processamento de dados. É altamente dependente da habilidade do operador na preparação da amostra e análise de dados. Ao usar essa abordagem, uma investigação Raman pode ser realizada por um usuário não especialista para adquirirDados de qualidade h e resultados significativos para análise de parede celular vegetal.

Introdução

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A biomassa vegetal é o recurso renovável mais abundante na Terra; é composta principalmente de lignina, celulose e hemicelulose; e é considerada uma fonte atraente de bioenergia e produtos químicos de base biológica1. Infelizmente, pode resistir à degradação e conferir estabilidade hidrolítica ou robustez estrutural à parede celular da planta. Essa resistência é atribuível à área de superfície acessível, tamanho de partícula de biomassa, grau de polimerização, cristalinidade da celulose e lignina protetora2. Uma compreensão abrangente da natureza estrutural e química da parede celular vegetal é, portanto, significativa do ponto de vista da biologia e química vegetal, bem como da utilização comercial. As análises de química úmida comumente usadas, como cromatografia, espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear, fornecem apenas dados de composição médios da amostra medida. Além disso, esses métodos são invasivos e destroem a estrutura original do tecido vegetal3.

A técnica de imagem Raman é uma ferramenta poderosa para a visualização não destrutiva de informações químicas espacialmente resolvidas4. Ele usa uma luz laser para causar espalhamento inelástico com um fóton e depende de mudanças na polarizabilidade decorrentes das vibrações moleculares. Nesse caso, a água causa um fraco espalhamento Raman, o que torna essa abordagem adequada para investigações in situ de amostras biológicas5. A aplicação da técnica de imagem Raman à parede celular vegetal pode elucidar a estrutura e composição das paredes celulares vegetais em seu estado nativo, com a resolução na escala da célula única e até mesmo das camadas da parede celular6. Uma análise típica de imagem Raman da parede celular de uma planta geralmente consiste em três etapas: 1) preparação da amostra, 2) aquisição espectral e 3) processamento de dados.

Embora uma das principais vantagens da imagem Raman seja a capacidade de obter espectros livres de rótulos e não destrutivos com preparação mínima de amostras, o corte físico da amostra ainda é necessário para expor a superfície de interesse. Este processo deve ser realizado com cuidado para obter uma superfície plana, uma vez que a técnica depende da manutenção do foco óptico7. A aquisição espectral requer um equilíbrio entre qualidade de imagem e tempos de aquisição extensos8. O processamento de dados visa extrair efetivamente as informações químicas dos dados de imagem, especialmente para os componentes com estruturas químicas semelhantes, como celulose e hemicelulose. Devido à forte sobreposição espectral, os espectros exatos são difíceis de discernir. Nesse caso, a análise multivariada é uma abordagem direta para descobrir efetivamente as informações estruturais e químicas ocultas9. Este trabalho apresenta um protocolo geral que descreve o uso de imagens Raman para visualizar os principais componentes das paredes celulares vegetais, incluindo lignina, celulose e hemicelulose.

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Protocolo

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1. Preparação da amostra

  1. Corte um pequeno bloco de tecido (cerca de 3 mm x 3 mm x 5 mm) da amostra da planta ( por exemplo, uma haste de álamo).
  2. Mergulhe o tecido em água desionizada fervente durante 30 min. Imediatamente transferi-lo para água desionizada à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este passo até o tecido escorrer no fundo do recipiente, indicando que o ar no tecido foi removido e que o tecido se amaciou.
    Nota: Para as amostras que afundam no fundo antes desta etapa, geralmente repita este ciclo 3-5 vezes.
  3. Prepare as alíquotas 20, 50, 70, 90% (v / v) de polietileno glicol (PEG) em água desionizada, bem como PEG puro e mantenha as soluções a 65 ° C.
  4. Incube o tecido em uma série de banhos graduados de PEG para deslocar a água e permitir que o PEG se infiltre.
    Nota: Tipicamente, PEG com um peso molecular de 2.000 (PEG2000) é usado para incorporação.
    1. Processar o tecido com gPEG radiado num forno de secagem da seguinte forma: (a) 20% de PEG durante 1 h, (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (c) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h e (E) 100% de PEG por 10 h.
  5. Pré-aqueça uma cassete a 65 ° C no forno. Despeje o PEG que contém o bloco na cassete e, em seguida, coloque o bloco de tecido em uma posição desejada usando pinças pré-aquecidas ou agulhas.
  6. Lixar lentamente a cassete e armazenar o tecido à TA até o uso.
  7. Disseca o bloco de PEG contendo o tecido alvo em um pequeno bloco (cerca de 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando uma lâmina afiada e montá-lo no microtomo.
  8. Corte seções finas do bloco PEG (tipicamente 3-10 μm).
  9. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes para remover o PEG do tecido.
  10. Mergulhe as secções com tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para remover os extrativos. Prepare o líquido de reação misturando 65 mL de água desionizada, 0,5 mL de ácido acético e 0,6 g de chlo de sódioRito em um copo. Adicione uma seção e 3 mL de líquido de reação a um frasco de 5 mL. Aperte o topo do frasco.
  11. Aqueça o frasco em banho-maria a 75 ° C durante 2 h para remover a lignina do tecido. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes.
  12. Transfira a seção não tratada / desligada para uma lâmina de microscópio de vidro. Desdobre a seção com cuidado usando escovas ou agulhas. Remova a água extra desionizada com papel de seda.
  13. Mergulhe a seção em D 2 O. Cubra a amostra com uma cobertura de vidro. Selar a tampa com esmalte para evitar a evaporação do D 2 O.

2. Aquisição espectral

  1. Abra o software de operação do instrumento do microscópio Raman confocal. Ligue o laser (comprimento de onda = 532 nm), foco na superfície do silício cristalino com um objetivo de microscópio 100X e clique no botão de calibração para calibrar o instrumento.
  2. Mude o instrumentoPara o modo microscópio óptico e acenda a lâmpada do microscópio. Monte o escorredor do microscópio no palco, com a tampa deslizante voltada para o objetivo.
  3. Veja a amostra com um objetivo de microscópio 20X e localize a área de interesse. Aplique óleo de imersão na lamínula e mude para o objetivo do microscópio de imersão (60X, abertura numérica NA = 1.35). Concentre-se na superfície da amostra.
  4. Mude o instrumento para o modo de teste Raman e desligue a lâmpada do microscópio.
  5. Escolha uma área de mapeamento usando uma ferramenta retangular. Altere o tamanho do passo para determinar o número de espectros obtidos.
    Nota: Esteja ciente do tamanho do passo (geralmente maior do que o diâmetro do ponto calculado pela abertura numérica do objetivo, teoricamente 1,22λ / NA). Tamanhos abaixo disso resultarão em oversampling.
  6. Defina os parâmetros espectrais ótimos para obter a melhor relação sinal-ruído (SNR) e qualidade espectral em um tempo de aquisição apropriado (geralmente <8 h), depeCom base na adequação da amostra. Em geral, insira os parâmetros de imagem no software do instrumento da seguinte forma: laser (532 nm), filtro (100%), furo (300), fenda (100), espectrômetro (1.840 cm -1 ), sulcos (1200t), objetivo ( Óleo 60X) e tempo de aquisição (2 s).
  7. Salve os dados espectrales antes do processamento de dados e converta-os em um formato universal ( por exemplo, arquivos TXT).

3. Análise de dados

  1. Carregue os dados espectrales (arquivos TXT) no software de análise de dados ( por exemplo, Matlab). Aplique uma técnica de redução de ruído no conjunto de dados para melhorar o SNR ( por exemplo, o algoritmo Savitzsky-Golay ou o algoritmo wavelet)
  2. Use amostras não tratadas para produzir imagens de lignina e polissacarídeos. Para a imagem de lignina, considere o pico espectral em torno de 1.600 cm -1 devido à vibração de alongamento simétrica do anel aromático. Para imagens de polissacarídeos (incluindo celulose e hemicelulose), use o pico espectral aRodada 2.889 cm -1 por causa dos trechos CH e CH 2 .
  3. Use amostras deslocadas para gerar imagens de celulose e hemicelulose. Execute a resolução da curva de auto-modelagem (SMCR) nos espectros adquiridos para discriminar os espectros de celulose e hemicelulose e para a imagem de suas distribuições.
  4. Execute análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento nos dados adquiridos para distinguir os espectros Raman de camadas de parede celular diferentes.

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Resultados

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A Figura 1 apresenta uma visão geral de um sistema típico de micro-Raman para a imagem de Raman de uma parede celular de planta. Por exemplo, os espectros de Raman originais do álamo ( Populus nigra L.) têm derivações e espigas de linha de base significativas ( Figura 2a ). Depois de executar o método de pré-processamento automático para o conjunto de dados de imagem Raman (APRI), esses dois contaminantes espectrales sã...

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Discussão

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A parede celular da planta é um composto que é organizado em várias camadas, incluindo o canto da célula (CC), a parede secundária (SW, com as camadas S1, S2 e S3) e a lamela intermediária composta (LMC, lamela média mais a primária adjacente Parede), o que dificulta a obtenção de uma superfície plana durante a preparação da amostra. Assim, as amostras de plantas, especialmente a grama, que tem uma estrutura mais complicada do que a madeira, muitas vezes precisam ser solidificadas para permitir a separação fina. O PEG é...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2016YDF0600803) o apoio financeiro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MicrotomoThermo ScientificMicrom HM430
Microscópio Raman ConfocalHoriba Jobin YvonXplora
FornoShanghai ZHICHENGZXFD-A5040

Referências

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