Artigo de método

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

DOI:

10.3791/55918

⸱

26 de julho de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células satélites (SC) são células-tronco muscular localizadas entre a membrana plasmática das fibras musculares e a lâmina basal circundante. São essenciais para a regeneração muscular. Após lesão, que ocorre freqüentemente nos músculos esqueléticos, os SCs são ativados. Eles proliferam como mioblastos e se diferenciam para reparar lesões musculares. Entre muitos eventos que ocorrem durante a diferenciação muscular, os sinais citostáticos de Ca 2 + são de grande importância. Estes sinais de Ca2 + surgir de libertação de Ca2 + a partir de Ca 2+ lojas internos, bem como de Ca2 + entrada a partir do espaço extracelular, particularmente a entrada de Ca2 + operado por armazenamento (SOCE). Este artigo descreve uma metodologia utilizada para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir de amostras musculares coletadas após a cirurgia ortopédica. O tecido é digerido mecanicamente e enzimaticamente, e as células são amplificadas e depois ordenadas por citometria de fluxo de acordo com a presença de especificaçãoMarcadores de membrana de fic. Uma vez obtidos, os mioblastos humanos são expandidos e comprometidos em se diferenciar removendo os fatores de crescimento do meio de cultura. Os níveis de expressão de fatores de transcrição específicos e imunofluorescência in vitro são utilizados para avaliar o processo de diferenciação miogênica em condições de controle e após o silenciamento de proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ . Finalmente, detalhamos o uso de Fura-2 como uma sonda ratiométrica de Ca 2+ que fornece medidas confiáveis ​​e reprodutíveis de SOCE.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os músculos esqueletais humanos são compostos de grupos de fibras musculares contrácteis e multinucleadas resultantes da fusão de células precursoras miogênicas. Os músculos esqueléticos têm a capacidade de regenerar após lesão graças à presença de SCs, as células estaminais do músculo esquelético localizadas entre a membrana plasmática das miofibras (sarcolemma) e a lâmina basal. Em músculos não feridos, os SCs estão principalmente presentes em um estado quiescente. Em resposta ao estresse ou lesão mecânica, os SCs se tornam ativados (mioblastos), proliferam e sofrem qualquer diferenciação para formar novas miofibras ou auto-renovação para reabastecer o SC pool 1 , 2 . Ao longo dos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para isolar SCs e sua progênie, os mioblastos, a partir de biópsias de músculo esquelético. Com a maior compreensão dos marcadores de superfície celular expressados ​​nessas células e a metodologia de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) 3, 4 , 5 , agora é possível isolar populações puras de mioblastos humanos a partir de amostras musculares.

A sinalização de cálcio rege o desenvolvimento do músculo esquelético, a homeostase e a regeneração. Em particular, a entrada Ca 2+ que é ativada após a depleção da loja intracelular, chamada SOCE, é de grande importância 6 para esses processos. Após a estimulação celular, o nível de Ca 2 + no retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR) diminui, o que, por sua vez, ativa os canais de Ca 2+ da membrana plasmática que permitem a entrada de Ca 2+ para reabastecer o ER / SR 7 . As duas principais proteínas envolvidas em SOCE são a proteína 1 (STIM1) da molécula de interação estromal sensível ao ER / SR Ca 2 + e o canal Ca 2+ da membrana plasmática Orai1. O músculo esquelético expressa abundantemente essas duas proteínas, bem como outras proteínas das mesmas famílias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 e vários canais permeáveis ​​a Ca 2+ da família canônica potencial de receptor transitório (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . A entrada de Ca 2+ através da via SOCE é de grande importância para a formação / regeneração muscular 14 . As mutações das proteínas STIM1 ou Orai1 têm efeitos deletérios sobre a função muscular, levando principalmente a hipotonia muscular 15 . Modelos de animais com deficiência de SOCE também apresentam massa muscular reduzida e força, juntamente com uma fatigabilidade melhorada 6 , 16 , 17 . Como mencionado, outras proteínas STIM e Orai, bem como muitos canais TRPC, são expressas no músculo esquelético, e seus respectivos papéis não foram determinados até agora. Ao bater dPossuem seu nível de expressão, é possível investigar suas implicações na SOCE e seus papéis durante a diferenciação muscular do esqueleto humano.

A medição de SOCE pode ser realizada usando duas abordagens diferentes: gravações eletrofisiológicas atuais e medições de Ca 2+ . A eletrofisiologia é certamente um método mais direto, pois mede a atualidade de interesse e sua assinatura eletrofisiológica associada. No entanto, esta técnica é muito difícil de aplicar às células musculares, principalmente devido ao grande tamanho das células musculares e ao pequeno tamanho da corrente endógena da SOCE. A imagem citosólica do Ca 2 + é tecnicamente muito acessível, mas a medida é mais indireta, pois o nível de Ca 2+ medido no citosol reflete tanto a entrada de Ca 2 + quanto o re-bombeamento da célula ou nas lojas internas.

Uma metodologia que inclui a isolação de mioblastos de pequenos pedaços de skel humanoO músculo etal após digestão enzimática, amplificação e FACS é explicado neste artigo. O processo de diferenciação muscular e o protocolo de imunofluorescência para seguir a expressão de marcadores de diferenciação ao longo do tempo são descritos 18 . Finalmente, são explicadas as medidas de SOCE e o papel de diferentes canais de íons na sinalização de Ca 2 + e diferenciação muscular esquelética.

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Protocolo

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As amostras musculares humanas (tecidos obtidos a partir de músculos semitendinosos) foram coletadas durante a cirurgia ortopédica em pacientes saudáveis ​​como resíduos cirúrgicos. Todos os métodos relacionados ao estudo humano foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos das Autoridades Regulatórias de Saúde da Suíça e aprovados pela Comissão Cantonale d'Ethique de Recherche dos Governos Cantonais de Genebra, Suíça (protocolo CER n ° 12-259) . Foram obtidos consentimentos informados e escritos de todos os sujeitos adultos envolvidos no estudo.

1. Isolamento de mioblastos do músculo esquelético humano

  1. Durante todos os procedimentos, mantenha condições estéreis trabalhando sob um capô de cultura de tecidos de nível II e usando tampões estéreis e esterilizados.
    Nota: Este procedimento pode ser aplicado a muitos músculos esqueletais humanos.

2. Protocolo de dissociação

  1. Transfira amostras de músculo (2 - 3 g) para um esterilizado de 6 cmPrato.
  2. Lave as amostras musculares com 5 - 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Repita a lavagem.
  3. Remova os tecidos conectivos e adiposos usando tesoura curvada e uma braçadeira.
  4. Pesar a amostra muscular (ver passo 2.13) e transferi-la para uma nova placa esterilizada de 6 cm.
  5. Adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
  6. Usando tesoura, corte e mole o tecido muscular em pequenos pedaços (menos de 2 mm).
  7. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, transfira o músculo picado para um frasco de dissociação de 200 mL contendo uma barra magnética. Repita este passo até 90 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ter sido transferido com todos os músculos picados para a caixa de dissociação. Feche o frasco de dissociação e incube a 37 ° C durante 60 minutos sob agitação suave.
  8. Retire o frasco de dissociação do banho de aquecimento e pare a reação enzimática adicionando 10 mL de soro fetal de vitela (FCS, 10% de volume final) ao frasco de dissociação. Homogenize a mistura com uma pipeta.
  9. PreparaçãoSão dois tubos de 50 mL com um filtro celular de 70 μm em cada um. Passe a metade da suspensão celular através do filtro celular em cada tubo, pipetando para cima e para baixo no filtro até a suspensão passar.
  10. Centrifugar os tubos a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
  11. Ressuspender as células com 10 mL de meio de crescimento (GM, Tabela 1 ) e passar as células através de um filtro de células de 40 um colocado em um tubo de 50 mL. Centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
  12. Ressuspender as células com 10 mL de GM e centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
  13. Ressuspender as células com 1 mL de GM e contar as células usando uma câmara de Neubauer.
    Nota: Geralmente, um rendimento de 3 x 10 5 células por g de músculo deve ser colhido. O rendimento é calculado dividindo o número de células pelo peso da biopia muscularSy (passo 2.4).
  14. Coloque 2 x 10 5 células em uma placa estéril de 6 cm contendo 4 mL de GM e incuba a 37 ° C e 7% de CO 2 . Prepare tantas placas quanto necessário.
  15. Mude o GM após 3 dias.
    Nota: células recém-dissociadas precisam de tempo para aderir à placa de cultura. Além disso, o primeiro tempo de duplicação de células miogênicas é de cerca de 50 a 60 h. Após a primeira divisão, o tempo de duplicação é de cerca de 20 h.
  16. Após 5 a 7 dias, quando as células atingem 70 a 80% de confluência (cerca de 1,5 x 10 6 células / por placa de 6 cm), comece a coloração de anticorpos e a triagem celular (passo 3).

3. Coloração de anticorpos e classificação de células

  1. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min (ou incubar a 5% de CO 2 ). Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), resUspend as células em 1 mL de GM.
  2. Contar as células usando uma câmara de Neubauer.
  3. Execute os seguintes procedimentos no gelo.
    Nota: O procedimento para ajustar a compensação de fluorescência correta no citómetro é essencial e deve ser semelhante em qualquer citómetro. Os tubos 1 e 2 são usados ​​como controles negativos. Os tubos 3 - 7 são usados ​​para ajustar a compensação no citómetro durante o primeiro experimento ( Tabela 2 ). A concentração final utilizada para cada anticorpo e seu isotipo correspondente deve ser a mesma (cerca de 1 μg / 10 6 células).
  4. Despachar 1 x 10 5 células por tubo (tubo de 5 mL) para tubos 1 - 7 ( Tabela 2 ). Coloque a suspensão celular restante no tubo 8 para triagem celular.
  5. Lavar as células com 1 mL de tampão FACS frio (PBS-5% FCS). Feche e centrifugue os tubos a 200 xg e 4 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
  6. Adicione 200 μL de tampão FACS por tubo. Adicionar anticorpos contraE tubo de acordo com a Tabela 2 . Incubar no gelo durante 30 min.
  7. Lave as células: adicione 1 mL do tampão FACS a cada tubo. Feche e centrifugue os tubos a 200 xg e 4 ° C por 5 min. Aspirar e descartar o sobrenadante. Repita este passo mais uma vez.
  8. Ressuspender as células em 500 μL de tampão FACS. Feche os tubos e mantenha-os no gelo até a classificação das células. Prepare 4 tubos de 1,5 mL, cada um contendo 500 μL de GM, o que é necessário para coletar as células durante a triagem celular. Mantenha-os no gelo.
  9. Classifique os mioblastos humanos por citometria de fluxo ( Figura 1 ). Depois de excluir as células hematopoiéticas CD45-positivas, separar células CD45-negativas com base na expressão de CD56. Em seguida, administre a população positiva de CD56 para CD34, CD144 e CD146 (os mioblastos humanos são definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Realizalize uma pequena fração da população de células ordenadas para verificar a pureza.
  10. Coloque os tubos contendo myobla humanaEm um tubo de 15 ml e lave uma vez adicionando 5 mL de GM. Centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
  11. Ressuspender as células em 1 mL de GM e plaquear as células em uma placa não revestida de 6 cm contendo 4 mL de GM (2 x 10 5 células por placa). Incubar a 37 ° C e 7% de CO 2 .

4. Manutenção celular

  1. Mude a metade do meio de cultura a cada 2 dias. Remova 2 mL de GM antigo do prato de cultura e adicione 2 mL de GM.
    Nota: Myoblasts produzem fatores de crescimento que são benéficos para as condições de cultura.
  2. Tossinize as células quando atingem 70 a 80% de confluência para evitar a pré-diferenciação. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min. Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), resusPular as células em 1 mL de GM.
  3. Contar as células e preparar placas de 6 cm com 2 x 10 5 células por placa em 4 mL de GM.
  4. Manter mioblastos humanos até 6 passagens ou congelá-los em GM contendo 10% de DMSO, 1 x 10 6 células por mL. Congelar as células em uma caixa de congelamento progressiva (1 ° C / min); Para armazenamento a longo prazo, coloque as células em nitrogênio líquido.

5. Transfecção de mioblastos humanos com siRNA

Nota: Os mioblastos são transfectados utilizando reagente de transfecção comercial dois dias antes da indução da diferenciação. O efeito de siRNA específico contra um gene é sempre comparado ao efeito de um siRNA de controle. SiRNAs são RNAs de cadeia dupla que devem ser mantidos no gelo e manipulados com luvas.

  1. Obtenha uma monocamada confluente de 70 a 80% de mioblastos humanos em uma placa de 6 cm (cerca de 1,5 x 10 6 células).
    Nota: 5 x 10 5 células por transfecção são necessárias para obter um conMonocamada fluida de mioblastos transfectados após 2 dias em GM.
  2. Prepare lamínulas de vidro (descritas para a imagem de cálcio no passo 7).
  3. Warm GM, 0,05% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C.
  4. Execute todas as etapas a seguir em um capuz de cultura de tecidos de nível II para manter a esterilidade.
  5. Em um tubo de 1,5 mL, despachar 500 μL de meio soro reduzido, 3 μL de reagente de transfecção e 1 μL de siRNA a 20 μM. Misture suavemente e mantenha a temperatura ambiente (RT) durante 15-20 minutos.
  6. Durante este período de incubação, prepare os mioblastos para transfecção. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min. Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), ressuspender as células em 1 mL de GM.
  7. Contar as células usando uma câmara de Neubauer.
  8. Ressuspender 5 x 10 5 célulasEm 200 μL de GM para cada transfecção ( isto é, para 2 transfecções, ressuspender em 400 μL).
  9. Adicione 200 μL da suspensão celular a cada 500 μL de mistura de siRNA-transfectante. Pipetar para cima e para baixo duas vezes e incubar durante 5 min à TA.
  10. Adicione os 700 μL (células + siRNA-transfectante) a um prato de cultura de 3,5 cm contendo uma lamínula de vidro. Adicione GM para obter um volume final de 2 mL.
  11. Após 24 h a 37 ° C e 7% de CO 2 , substitua completamente o meio por 2 mL de GM fresco. Após mais 24 h, uma monocamada confluente de células transfectadas está geralmente presente; Se assim for, induzir a diferenciação de mioblastos substituindo o GM por 2 mL de meio de diferenciação (DM, Tabela 1 ).
  12. Execute experiências de imagem de cálcio 24 - 48 h após a indução de diferenciação ou em mioblastos de proliferação.
    Nota: A imunofluorescência é geralmente realizada 48 h após a indução da diferenciação.

6. ImNão-fluorescência Coloração de Marcadores de Diferenciação

Nota: A coloração por imunofluorescência é realizada após 48 h em DM, mas também pode ser realizada em outros tempos de diferenciação. Myogenin e MEF2 são proteínas nucleares apenas expressas em células diferenciadas (antes da fusão em miotubos), e sua coloração permite a avaliação do processo de diferenciação. A cadeia pesada de Myosina (MyHC) é expressa apenas em miotubos e é utilizada para estimar o tamanho do miotubo e índice de fusão (número de núcleos em miotubos / número total de núcleos).

  1. Após 48 h em DM, lave a monocamada confluente de células diferenciadas duas vezes com 1 mL de PBS à TA. Faça isso com cuidado para evitar o desprendimento dos miotubos.
  2. Corrigir as células com 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) durante 15 minutos à TA. Lave as células com PBS duas vezes, durante 5 minutos cada.
  3. Permeabilize as células com 1 mL de PBS contendo Triton X-100 a 0,25% durante 45 minutos e lave 3 vezes com 1 mL de PBS.
  4. Bloqueie os insLocais de ligação pecificos incubando as células em PBS suplementado com 0,2% de Tween-10 e 2% de soro de cabra (solução de bloqueio) durante 30 min à TA.
  5. Prepare anticorpos primários diluídos em solução de bloco (600 μL por placa de 3,5 cm).
    Nota: Os seguintes anticorpos primários são utilizados: anti-miogenina de rato (1: 600), anti-MEF2 de coelho (1: 300) e anticorpo anti-MyHC de rato (MF20, 1: 1000). É possível misturar na mesma solução de bloqueio, cadeia pesada anti-miosina de mouse ou anti-miogenina de mouse, com anti-MEF2 de coelho.
  6. Remova a solução de bloco e adicione 600 μL de soluções de anticorpos primários por placa de 3,5 cm e incube durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada.
  7. Lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS. Incubar durante 1 h à RT em uma câmara escura com 600 μL dos anticorpos secundários preparados na solução de bloqueio, da seguinte forma: Alexa 488 de cabra (1: 1.000), cabra anti-coelho Alexa 546 (1: 1.000), E DAPI (1:50, solução-mãe a 15 μM).
    CAUTION: DAPI é um composto tóxico que deve ser manipulado com luvas.
  8. Aspirar e lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS.
  9. Monte revestimentos de vidro usando meio de montagem de álcool polivinílico com solução antitransmuvante. Mantenha-os a 4 ° C e protegidos da luz até imaginar as células.

7. Imaging de cálcio

  1. Cultura anterior, prepare cobertores de vidro com 25 mm de diâmetro. Coloque os lamínulas em etanol a 70% durante 48 h para remover qualquer graxa e sujeira da superfície, o que reduz a adesão celular à lamínula.
  2. Depois de enxaguar as lâminas com as águas, coloque-as novamente na água e esterilize-as (autoclavadas).
  3. Coloque um lamíngulo por placa de cultura de 3,5 cm e deixe secar. Armazene as placas de Petri para experiências adicionais ou use-as imediatamente.
  4. Adicione os mioblastos transfectados (5 - 6 x 10 5 células) ao lamínula de vidro.
    Nota: as experiências são feitas 24 - 48 h após a indução de diferenciaçãoSobre, ou em proliferação de mioblastos.
  5. Para realizar imagens de Ca 2+ , lave as células 2 vezes com PBS ou diretamente com o meio utilizado para as experiências (meio contendo cálcio, Tabela 3 ). Carregar as células com 2 μM de Fura-2 / AM mais 1 μM de ácido plurônico durante aproximadamente 30 min no escuro à temperatura ambiente.
    Nota: O ácido plurônico ajuda a solubilizar Fura-2. Fura-2 / AM e ácido plurónico são dissolvidos no meio contendo cálcio.
  6. Lave as células duas vezes no mesmo meio, mas sem Fura-2 / AM e ácido plurônico e deixe-as no escuro durante 10 a 15 minutos adicionais para permitir a desesterificação de Fura-2 / AM.
  7. Se a eficiência de carga de Fura-2 for muito baixa, adicione mais Fura-2 ( por exemplo, 4 μM) e / ou incuba as células por mais tempo ( por exemplo, 40 min).
  8. Remova o lamínula da placa de cultura e instale-a na câmara experimental. Adicione ~ 1 mL de meio contendo cálcio (dependendo do volume da experiênciaCâmara mental). Instale-o no palco do microscópio e comece a gravar.
    Nota: A sonda sensível fluorescente Ca 2 + Fura-2 é excitada alternadamente a 340 nm e 380 nm, e a luz de emissão é coletada a 510 nm. Como as flutuações da concentração de Ca 2+ são relativamente lentas, adquira 1 razão a cada 2 s.
  9. Para ativar o SOCE, é utilizado o seguinte protocolo clássico de reabsorção de thapsigargin / Ca 2+ : deixe as células por 2-3 minutos em meio contendo cálcio. Substitua o meio por meio sem cálcio por 1-2 minutos.
    1. Adicione 1 μM de thapsigargina para esgotar as lojas internas de cálcio.
      Nota: O Thapsigargin é um bloqueador irreversível da atividade da bomba da ATPase de Ca 2+ ATPase sarco-endoplasmática (SERCA). Após 8 a 10 min, substitua rapidamente o meio com o meio contendo cálcio. Ca 2+ entrará nas células através dos canais SOCE. Aguarde cerca de 5 minutos antes de terminar as experiências.
      CUIDADO: Thapsigargin é um composto tóxico que deve ser manuseado com luvas.

8. Ca 2+ Análise de Medição

Nota: Execute a análise com o software de aquisição.

  1. Abra o experimento. Desenhe a região 1 em uma área onde não há células (região de fundo) e desenhe as outras regiões no citoplasma das células a serem analisadas (as regiões podem ser desenhadas em qualquer imagem: a 340 nm, a 380 nm, Ou a imagem de proporção). Vá para "Executar experiências"> "imagens de referência". Sob os 340 e 380 canais, selecione "região 1" e clique em "Subtrair fundo".
  2. Execute toda a experiência (F4: para frente) para garantir que nada interfira com a região do fundo, como um ponto de poeira fluorescente que percorra a região de fundo e que as células não se movem durante o tempo das experiências.
    Nota: as regiões de interesse que são selecionadasNão deve incluir áreas escuras; Caso contrário, o valor da relação aparecerá ruidoso, pois parte do plano de fundo será incluído na medição.
  3. Clique em "Log data" e reproduza todo o experimento novamente.
    Nota: Isso abrirá uma planilha em que o tempo e a relação são registrados. Também é possível salvar os comprimentos de onda individuais de 340 nm e 380 nm.
  4. Para obter informações sobre SOCE, extraia os dois parâmetros importantes do experimento: a amplitude da re-adição de Ca 2 + e a inclinação da fase de entrada de Ca 2+ ( Figura 3 ).
  5. Obter a amplitude subtraindo-se o valor de razão pouco antes de Ca2 + re-adio a partir da amplitude máxima da elevação de Ca2 +. Obtenha a inclinação máxima ajustando uma regressão linear dos primeiros segundos após a re-adição de Ca 2+ .
    Nota: A área sob a curva da resposta ao thapsigargin é também um parâmetro informativo para extracT, pois reflete a quantidade de cálcio livre armazenada no SR.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Após a dissociação enzimática de uma amostra de músculo humano, as células foram amplificadas em GM. Os mioblastos humanos, definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, foram obtidos após FACS. Os mioblastos representaram mais de 60% da população analisada ( Figura 1 ). Os mioblastos humanos primários foram reaparecidos, cultivados em confluência e cultivados em DM por 48 h. Após a imunocoloração para a expressão do fator de transcrição MEF2 e da proteína muscular espec...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O isolamento e a cultura dos mioblastos humanos do músculo esquelético adulto oferecem um modelo in vitro para estudar a diferenciação muscular e a regeneração muscular. Neste artigo, fornecemos um protocolo que permite a purificação de altos rendimentos de mioblastos humanos de maneira simples e limitada em termos de custo. Além disso, esta técnica fornece resultados confiáveis ​​e reprodutíveis em termos de porcentagem de mioblastos isolados e sua eficiência de diferenciação m...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (número de subvenção 310030-166313), a "Fundação Suisse para a pesquisa sobre les maladies musculaires", a "Fundação Marcel Levaillant" e a "Fundação para a pesquisa ostéo-articular".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Presunto' s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Lote 41G5532K
BSASigmaO5482
fetuinSigmaF3385
EGFCorning354001
DexamethansoneSigmaD1756
InsulinaSigmaI9278
CreatinaSigma27900
PiruvatoSigmaP4562
UridinaSigmaU3003
GentamicinaThermoFisher Scientific15710-049
Tripsina-EDTA 0,05%ThermoFisher Scientific25300-062
70 μ filtro de célula mFalcon352350
40 μ filtro de célula mFalcon352340
Falcon 50  tubo mLFalcon352070
Falcon 15  tubo mLFalcon352096
Falcon 5  Tubo mL (FACS)Falcon352058
Meio de cultura: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Tubo transfectant: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
Meio de montagemFluka10981
Mouse anti-MyHC *DSHBMF20 concentrar
Rato anti-miogeninaBD Pharmigen556358
Coelho anti-MEF2Santa Cruz BiotechC-21
Cabra anti-rato Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
Cabra anti-coelho Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
Rato anti humano CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
Rato anti humano CD146-PECy7BD Pharmingen562135
Rato anti humano CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
Rato anti humano CD34-APCBD Pharmingen345804
Rato anti humano CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 rato IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 rato IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 mouse IgG1kBD Pharmingen562292
APC mouse IgG1kBD Pharmingen550854
PE mouse IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542CUIDADO:  composto tóxico
ParaformaldeídoFluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033CUIDADO: composto tóxico
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Referências

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