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Artigo de método

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA

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DOI:

10.3791/55924

⸱

13 de julho de 2017

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina.

Resumo

Os insetos evoluíram sofisticados sistemas de recepção olfativa para detectar sinais químicos exógenos. Esses sinais químicos são transduzidos por neurônios receptores olfatórios (ORNs) alojados em estruturas parecidas com o cabelo, chamados de quimiosensila, das antenas. Nas membranas dos ORN, pensa-se que os receptores de odorantes (RUP) estão envolvidos na codificação de odor. Assim, ser capaz de identificar genes localizados nas ORNs é necessário reconhecer genes OR e fornece uma base fundamental para novos estudos funcionais in situ . Os níveis de expressão de RNA de OR específicos em antenas de insetos são muito baixos e a preservação do tecido de insetos para a histologia é desafiadora. Assim, é difícil localizar um OR para um tipo específico de sensilla usando hibridização in situ RNA. Neste artigo, é introduzido um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes OR de insetos pequenos. Além disso, um OR específico Gene waS identificado pela realização de experiências de hibridação in situ fluorescentes de duas cores utilizando um gene de receptor coexpressivo , Orco , como marcador.

Introdução

As antenas de insetos, que são os órgãos quimiossensores mais importantes, são cobertas com muitas estruturas parecidas com o cabelo - chamadas sensilla - que são inervadas pelos neurônios receptores olfatórios (ORNs). Na membrana de ORN de insetos, os receptores de odorantes (OR), um tipo de proteína contendo sete domínios transmembranares, são expressos com um coreceptor (ORco) para formar um heterômero que funciona como um canal iónico 1 , 2 , 3 odorante. OUs diferentes respondem a diferentes combinações de compostos químicos 4 , 5 , 6 .

Os gafanhotos ( Locusta migratoria ) dependem principalmente de pistas olfativas para desencadear comportamentos importantes 7 . As ERs do Locustão são fatores-chave para a compreensão dos mecanismos olfativos moleculares. Localizando um gene OR específico para o neurônio de umO tipo de sensibilidade morfológicamente específico por ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) é o primeiro passo na exploração da função OR.

RNA ISH usa uma sonda de ARN complementar marcada para medir e localizar uma sequência de ARN específica em uma seção de tecido, células ou montagens inteiras in situ , fornecendo informações sobre processos fisiológicos e patogênese da doença. As sondas de ARN marcadas com marcadores de digoxigenina (marcados com DIG) e de biotina foram amplamente utilizadas na hibridação de ARN. A marcação de ARN com digoxigenina-11-UTP ou biotina-16-UTP pode ser preparada por transcrição in vitro com polimerases de ARN de SP6 e T7. As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina possuem as seguintes vantagens: não radioativas; seguro; estável; altamente sensível; Altamente específico; E fácil de produzir usando PCR e transcrição in vitro . As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina podem ser detectadas cromogenicamente e fluorescentemente. As sondas de ARN marcadas com DIG podem ser detectadas com Alkali anti-digoxigeninaAnticorpos conjugados com fosfatase (AP) que podem ser visualizados quer com os substratos quimioluminescentes altamente sensíveis cloreto de tetrazólio nitroblue / sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizando um microscópio óptico ou com 2 -hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (HNPP) acoplado com sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazónio (Fast Red) utilizando um microscópio confocal. As sondas de ARN marcadas com biotina podem ser detectadas com anticorpos conjugados anti-biotina com estreptavidina de rabo cavalo (HRP) que podem ser visualizados com fluoresceína-tiramides usando um microscópio confocal. Assim, a hibridação fluorescente in situ de duas cores pode ser realizada para detectar dois genes alvo em uma fatia usando sondas de RNA marcadas com DIG e biotina.

O RNA ISH com sondas marcadas com DIG e / ou biotina foi utilizado com sucesso para localizar genes relacionados ao olfato, tais como OR , receptor ionotrópico, proteína de ligação aos odorantesE proteína da membrana neuronal sensorial, em antenas de insetos de, entre outras, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e gafanhoto do deserto, Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . No entanto, existem dois desafios substanciais ao executar RNA ISH para insetos OR: (1) OU genes (exceto ORco ) são expressos em níveis baixos e somente em algumas células, tornando a detecção de sinal muito difícil e (2) preservando o tecido de insetos para Histologia, de modo que a morfologia seja preservada e o ruído de fundo seja baixo, pode ser desafiador. Neste artigo, um protocolo detalhado e eficaz descrevendo RNA ISH para localizar genes OR em insetosAntenas são apresentadas, incluindo a detecção cromogênica e de ampliação de sinal de Tyramide (TSA).

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Protocolo

NOTA: Para limitar a degradação de ARN, prepare soluções usando água destilada em autoclave em húmido (a 121 ° C por 60 min) e também materiais em autoclave em molhado.

1. Preparação de RNA ISH Sondas anti-sentido e sentido

  1. Objetivo amplificação e purificação de genes
    1. Primeiro, produza um fragmento de cadeia dupla de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) a partir do plasmídeo contendo o cDNA completo de LmigOR1 com uma Taq DNA Polymerase que adiciona adeninas a ambas as extremidades dos fragmentos.
      1. Usar um 100 uL de volume de reacção final, contendo 50? L de mistura de reacção 2x, 4 uL de cada sentido e anti-iniciadores (Tabela 1), 1? L de molde do plasmídeo e 41 uL de RNase H 2 O. A utilização do seguinte PCR Protocolo: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min.
      2. Repita estes passos para produzir o fragmento de cadeia dupla de LMigOR2 (GenBank: JQ766966) de 1.303 pb e 1.000 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Os iniciadores utilizados nestas experiências são apresentados na Tabela 1 .
      3. Execute produtos de PCR em géis de agarose a 1,2% em 1x tampão Tris-acetato-EDTA e visualize usando coloração com brometo de etidio.
    2. Extraia esses produtos de PCR usando um kit de extração de gel.
      1. Após a eletroforese, adicione as faixas de DNA do gel e coloque as fatias de gel em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicione 100 μL de tampão de ligação (Buffer PN) por 0,1 g de fatia de gel. Vortex e incubar a 50 ° C até a fatia de gelar completamente dissolvida.
      2. Insira uma coluna de adsorção CA2 no tubo de coleta e adicione 500 μL de buffer de equilíbrio (Buffer BL). Isso melhora a capacidade de absorção e a estabilidade da membrana de sílica. CentriFugir em 12.400 xg por 1 min.
      3. Transferir a mistura de gel dissolvido para o conjunto da coluna de adsorção e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.400 xg durante 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta.
      4. Adicione 600 μL de solução de lavagem (etanol adicionado, Buffer PW) duas vezes. Centrifugar a 12.400 xg por 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta.
      5. Esvazie o tubo de recolha e recentrifique o conjunto da coluna em 12.400 xg durante 2 minutos para permitir a evaporação de qualquer etanol residual.
      6. Transfira cuidadosamente a coluna de adsorção para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Secar ao ar a pastilha por 5-10 min e redissolver o DNA num volume adequado ( por exemplo, 30 μL) de água isenta de nuclease.
      7. Incubar à TA por 2 min. Centrifugar a 12.400 xg por 2 min. Descarte a coluna de adsorção e armazene o DNA a 4 ° C ou -20 ° C.
  2. Construa os plasmídeos recombinantes
    1. Ligar individualmente o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1,303 pb de LmigOR2 e 1,251 pb de LmigORco em um vetor T que contém promotores para as polimerases de ARN T7 (a montante) e SP6 (a jusante) adjacentes ao DNA inserido usando T4 DNA ligase. Prepare a seguinte reação de 10 μL: 5 μL de tampão de ligação 2x, 1 μL de vetor T, 3 μL (~ 100 ng) do DNA do gene inserido e 1 μL de ADN ligase T4 e incuba O / N a 4 ° C.
    2. Adicionar 5 uL de cada plasmídeo recombinante contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 pb fragmento de LmigOR2 e 1251 pb fragmento de LmigORco separadamente em 50 uL de células de Escherichia coli DH5a competentes em tubos de 1,5 mL esteis.
      1. Misture suavemente e coloque os tubos em gelo durante 30 min e depois incubri-los durante 90 s a 42ºC.° C. Transfira-os de volta ao gelo por 3 min.
      2. Adicione 450 μL de meio líquido Luria-Bertani (LB) sem ampicilina a cada tubo e incuba-os em um agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar o E. coli DH5a.
      3. Pegue uma alíquota de 100 μL de cada transformante e use-os para inocular placas de substrato sólido LB contendo 50 μg / mL de ampicilina, 24 μg / mL de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 40 μg / mL de 5-bromo-4 -cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido (X-gal).
      4. Incubar estas placas em uma incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Tira os plasmídeos recombinantes alvo usando o método de triagem azul-branco. Seqüencie os plasmídeos recombinantes alvo usando a seqüência de Sanger e identifique as direções de inserção dos genes OR.
  3. Selecione endonucleases de restrição para linearizar plasmídeos recombinantes
    1. Usar endonucleases de restrição tNão apenas digerir no site de clonagem múltipla do vetor, mas também não cortar o DNA da inserção. Nesta experiência, todos os 3 genes são inseridos no vetor T na direção correspondente à do vetor.
    2. Utilize a endonuclease de restrição Nco I para linearizar os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30mm de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco para produzir as sondas anti-sentido. Use a endonuclease de restrição Sp e I para produzir as sondas sensoriais.
      NOTA: Se a direção da inserção corresponde à do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a ARN polimerização de SP6 é usada para preparar a sonda anti-sentido. Um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda de detecção. Caso contrário, se a direção da inserção não corresponder a tA direção do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda anti-sentido. O site de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a ARN polimerização SP6 é usada para preparar a sonda de detecção.
  4. Purificando os plasmídeos recombinantes linearizados
    1. Digerir 20 μg de cada um dos três plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30ig de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco usando a endonuclease de restrição de Nco I em uma reação de 100 μL que contém 10 μL de tampão 10x, 40 μL de 0,5 ug de plasmídeo / L, 3 mL de Nco I e 47 uL de RNase H 2 O, seguido por uma incubação de 3 h a 37 ° C.
    2. Da mesma forma, digerir 20 μg de cada um desses três plasmídeos recombinantes vocêCante a endonuclease de restrição Spe I.
    3. Purifique estes plasmídeos digeridos usando um kit de extração de gel como descrito em 1.1.2. Determine as concentrações destes plasmídeos recombinantes linearizados extraídos por espectrofotometria e ajuste para 0,5 μg / μL.
  5. Prepare sondas anti-sentido e sensoriais
    1. Use o sistema de transcrição de ARN T7 / SP6 para gerar sondas anti-sentido e sensoriais. A polimerase de ARN de SP6 é usada para transcrever ARN de cadeia dupla para sondas anti-sentido marcadas com DIG e biotina para esses três genes OR usando plasmídeos recombinantes linearizados como modelos in vitro . A polimerase de ARN T7 é utilizada para produzir sondas sensoriais. Realize a reação em um volume final de 20 μL, contendo 2 μL de mistura de NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição 10X, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de ARN polimerização T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmídeo linearizado e 9 ul de ARNase isento de H 2 O, seguidoPor uma incubação de 3 h a 37 ° C.
    2. Incubar as sondas de detecção anti-sentido marcadas com DIG e biotina durante 30 min com 1 μL de DNase a 37 ° C. Adicionar 2,5 μL de LiCl 5 M e 75 μL de etanol absoluto, depois incubar as reações durante 30 min a -70 ° C.
    3. Centrifugar a 15,000 xg durante 30 min a 4 ° C. Decanta com cuidado o sobrenadante. Adicione 150 μL de etanol a 70% para lavar o precipitante. Prepare o etanol a 70% (1 L) adicionando 95% de etanol (736,8 mL) a água destilada estéril (263,2 mL).
    4. Centrifugar a 15,000 xg durante 30 minutos a 4 ° C novamente e secar ao ar a pastilha por 5-10 minutos à TA. Adicione 25 μL de H 2 O isento de RNase para dissolver as sondas anti-sentido e sensoriais de RNA.
    5. Se o comprimento do gene inserido for superior a 1 kb, subseqüentemente fragmenta sondas de sentido antisentido e de detecção de ARN até um comprimento médio de 300 pb por incubação em soluções tampão de carbonato de carbonato. Realize a reação em um volume final de 50 μL, containing 25 pL da sonda de ARN e 25 uL da solução tampão de bicarbonato-carbonato (80 mM de NaHCO3, 120 mM de Na 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. O tempo de hidrólise requerido é dado por uma fórmula 17 previamente publicada.
    6. Adicione 5 μL de ácido acético a 10% para parar a reação. Neste experimento, fragmentar as sondas de sentido antisense e LmigOR2 LmigOR2 e LmigORco durante 24 e 23 minutos, respectivamente.
      T = (L o -L f ) / kXL o XL f
      L o = os comprimentos de fragmentos iniciais em kb
      L f = o comprimento final dos fragmentos em kb
      K = a constante de taxa para hidrólise, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1
      T = tempo de hidrólise em min
    7. Finalmente, adicione 250 μL de tampão de hibridação e armazene a -80 ° C.

2. Preparação de seções de criostato

  1. Precool o freeziNg microtome a -24 ° C.
  2. Selecione novos gafanhotos adulto em muda que estejam ativos e tenham antenas intactas. Corte as antenas em pedaços de 2-3 mm usando máquinas de barbear estéreis.
  3. Coloque o composto OCT em um suporte de micrótomo congelante e coloque uma ou duas amostras sobre o composto horizontalmente. Em seguida, transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C para equilibrar até o composto congelar. Retire o suporte e cubra as amostras com um pouco de composto. Transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C novamente durante pelo menos 10 minutos ( Figura 1 ).
    NOTA: Evite obter bolhas no composto.
  4. Fixar o suporte com as amostras no micrótomo de congelação, depois separar as amostras congeladas em fatias de 12 μm de espessura a -24 ° C.
  5. Descongelar as fatias uma a uma nas lâminas (25 x 75 mm, livre de nuclease) e secar ao ar por 10 min.

3. Seções de fixação

  1. Após a preparação do criostatoSeções, coloque as lâminas em um recipiente de plástico (~ 100 x 40 x 80 mm) e conserte os tecidos incubando as lâminas em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos a 4 ° C.
  2. Lavar as lâminas em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 min.
  3. Para eliminar as proteínas alcalinas, transfira as lâminas para HC1 0,2 M por 10 min.
  4. Para eliminar a proteína superficial do ácido nucleico, transfira as lâminas para 1XPBS com 1% de Triton X-100 durante 2 min.
  5. Lave os slides duas vezes por 30 s em 1x PBS.
  6. Finalmente, enxaguar as lâminas na solução de formamida durante 10 min a 4 ° C.

4. Hibridação

  1. Prepare as sondas anti-sentido e sensoriais
    1. Use o tampão de hibridação para diluir as sondas antisentido ou sensora de RNA nos tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Nesta experiência, para todas as sondas antisentido e sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), adicione 1 μL de sonda a 99 μL buffer de hibridação por slide. Geralmente, o uso de diluições 1: 100 de sondas anti-sentido produz sinais positivos significativos e baixos fundos usando este protocolo.
    2. Para detecção cromogênica, diluir as sondas marcadas com DIG individualmente.
    3. Para a detecção de TSA, diluir LmigOR1 marcado com DIG com sondas LmigOrco marcadas com biotina ou LmigOR2 marcado com DIG com sondas LmigOR1 marcadas com biotina em conjunto no tampão de hibridação.
    4. Aquecer as diluições durante 10 min a 65 ° C e colocá-las em gelo durante pelo menos 5 min.
  2. Hibridação
    1. Drene as lâminas e adicione 100 μL de sondas de detecção anti-sentido diluídas (Etapa 4.1) às secções de tecido. Em seguida, coloque lamínulas (24 mm x 50 mm, livres de nuclease) nas seções de tecido.
    2. Coloque as lâminas cobertas horizontalmente em uma caixa úmida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incubar umaT 55 ° C durante 22 h. Adicione a solução de formamida ou 1X PBS no fundo da caixa para manter o ambiente úmido, mas não submergir as lâminas no líquido.
  3. Lavagem e bloqueio.
    1. Após a hibridação, remova cuidadosamente os lamínulas. Lave as lâminas duas vezes por 30 min em citrato de sódio salino 0.1x (SSC) a 60 ° C.
      NOTA: A lavagem significa colocar as lâminas em um suporte de deslizamento que é então colocado em um recipiente de plástico e agitado suavemente em um balancim (~ 50 rpm, Figura 2 ).
    2. Enxaguar as lâminas em 1x Tris-Buffered Saline (TBS) durante 30 s.
    3. Adicionar 1 mL de reagente de bloqueio a 1% em TBS suplementado com Triton X-100 a 0,03% em cada lâmina e incubar durante 30 min. Em seguida, descarte a solução de bloqueio.
  4. Imuno-histoquímica.
    1. Para a detecção cromogênica, use reagente de bloqueio no TBS para diluir 750 unidades (U) / mL anti-digoxigenina anti-conjugado APDy a 1,5 U / mL AP solução. Adicione 100 μL de solução AP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm).
    2. Para detecção de TSA, use reagente de bloqueio em TBS para diluir 750 U / mL de anticorpo anti-digoxigenina AP conjugado e anticorpo anti-biotina com estreptavidina conjugada com HRP para a solução AP / HRP. Adicione 100 μL de solução de AP / HRP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm).
    3. Incube os slides em uma caixa úmida ( Figura 2 ) durante 60 min a 37 ° C. Use a solução de formamida ou 1X PBS para manter a caixa úmida, mas não encharcada.

5. Coloração

  1. Remova cuidadosamente os lamínulas. Lavar as lâminas três vezes durante 5 min em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. Enxaguar os slides em tampão DAP (detecção cromogênica: pH 9,5, detecção TSA: pH 8,0) durante 5 min.
  2. Coloração (detecção cromogênica)
    1. Adicionar 100 μL de solução de substrato NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluída em DAP;PH 9,5) para cada slide. Coloque cuidadosamente os lamínulos (24 x 50 mm) nos slides.
    2. Incube as lâminas em uma caixa úmida com solução de substrato por 10 min - O / N a 37 ° C.
      NOTA: Verifique o desenvolvimento, olhando os slides de vez em quando ao microscópio.
    3. Quando o desenvolvimento estiver pronto, pare a reação transferindo as lâminas para dentro da água.
  3. Coloração (detecção TSA)
    1. Use uma seringa para mover o substrato de HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) do filtro da seringa (0,22 μm, Figura 2 ).
    2. Adicione 100 μL de HNPP / Substrato Vermelho Rápido por slide coberto com uma lamínula (24 x 50 mm). Incube as lâminas durante 30 minutos com HNPP / Substrato Vermelho Rápido à RT.
    3. Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes por 5 minutos em 1X TBS suplementado com 0,05% de Tween-20.
    4. Use 100 μL de substrato TSA / coberto (24 x 50 mm 2 ) deslize. Incube as lâminas com substrato de TSA durante 10 min à TA.
    5. Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes durante 5 minutos em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20.
  4. Incorporar as lâminas em PBS / glicerol (1: 3).
    NOTA: Depois de concluir estes procedimentos, as lâminas devem ser observadas o mais cedo possível porque o sinal fluorescente vai aplacar rapidamente.

6. Observação

  1. Detecção cromogênica
    1. Observe as seções de tecido usando um microscópio óptico. Escolha as lentes objetivas 10X, 20X e 40X para observar os resultados da detecção cromogênica.
    2. Use o software DP-BSW para analisar os resultados e capturar as imagens.
  2. Detecção TSA
    1. Observe seções de tecido usando um microscópio confocal. Os genes marcados com DIG devem ser observados sob luz de 543 nm, apresentando uma cor vermelha, e os genes marcados com biotina devem serObservado sob luz de 488 nm, apresentando uma cor verde. Quando emergem, apresentam cor amarela.
    2. Escolha as lentes objetivas 20X e 40X para observar os resultados da detecção TSA, respectivamente.
    3. Use o software FV1000 para analisar os resultados e capturar as imagens.

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Resultados

Com a detecção cromogênica, um pequeno subconjunto das células antenais em todas as seções antenais adultas foi indicado pelas sondas antisentidades LmigOR1 e LmigOR2 marcadas com DIG ( Figura 3 ). ARN ISH em secções consecutivas para localizar LmigOR1 e LmigOR2 mostrou que as células que expressam antenares os dois genes foram localizados em aglomerados ORN expressam LmigORco, indicando que o LmigOR1 put...

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Discussão

É difícil realizar RNA ISH para localizar genes OU em antenas de insetos porque os níveis de expressão de genes OR, exceto ORco , são muito baixos e a preservação de fatias histológicas de antenas de insetos é muito difícil. Além disso, a detecção TSA também é muito complicada. Para resolver esses problemas, as seguintes medidas devem ser tomadas. As antenas são selecionadas a partir de gafas adultas de muda que possuem cutículas antenas finas e macias, que mantêm sua morfologia no slide. As amostras congeladas...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar ou quaisquer outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por uma doação da National Natural Science Foundation of China (nº31472037). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fornecer informações específicas e não implica recomendação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
2× TSINGKETM Master MixTSINGKE, ChinaTSE004
H2O sem RNaseTIANGEN, ChinaRT121-02
AGAROSE REGULAR G-10BIOWEST, ESPANHA91622
Tampão de ligaçãoTIANgel Midi Kit de purificação, TIANGEN, ChinaDP209-02
Tampão de equilíbrioTIANgel Midi Kit de purificação, TIANGEN, ChinaDP209-02
Solução de lavagemTIANgel Midi Purificação Kit, TIANGEN, ChinaDP209-02
T VectorPromega, EUAA362A
T4 DNA LigasePromega, EUAM180A
Escherichia coli DH5αTIANGEN, ChinaCB101
AmpicilinaSigma, EUAA-6140
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeoInalco, EUA1758-1400
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeoSBS Genetech, ChinaGX1-500
Nco IBioLabs, Nova InglaterraR0193S
Spe IBioLabs, New EnglandR0133M
DIG RNA LabelingRoche, Suíça11175025910
Kit de Rotulagem de RNA de BiotinaRoche, Suíça11685597910
DNaseDIG RNA Labeling Kit, Roche, Suíça11175025910
LiClSinopharm, China10012718
EtanolSinopharm, China10009257
Ácido acéticoBEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China10000292
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Holanda4583
SlidesTINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, ChinaFISH0010
HClSinopharm, China80070591
MillexMillipore, EUASLGP033RS
Tween 20AMRESCO, EUA0777-500ML
Nitroblue cloreto de tetrazólio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina salRoche, Suíça11175041910
GlicerolSinopharm, China10010618
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solutions
1× Tris-acetato-EDTASigma, EUAV900483-1KG0,04 mol/L Tris-Base
1× Tris-acetato-EDTABEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China100002920,12% de ácido acético
1 e vezes; Tris-acetato-EDTASigma, EUA03677Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)
Luria-Bertani (LB) meio líquidoSinopharm, China1001939210 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) meio líquidoMERCK, AlemanhaVM33523110 g/L Peptona de caseína (triptona)
Luria-Bertani (LB) meio líquidoMERCK, AlemanhaVM3615265 g/L Extrato de levedura
Placa de substrato sólido LBSinopharm, China1001939210 g/L NaCl
Placa de substrato sólido LBMERCK, AlemanhaVM33523110 g/L Peptona de caseína (triptona)Placa de
substrato sólido LBMERCK, AlemanhaVM3615265 g/L Extrato de levedura
Placa de substrato sólido LBWISENT ING, Canadá800-010-CG15 g/L Ágar Grau Bacteriológico
10 vezes; Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,1)Sinopharm, China100193928,5% NaCl
10 vezes; Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,1)Sigma, EUAV900041-500G14 mM KH2PO4
10× Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,1)Sigma, EUAV900268-500G80 mM Na2HPO4
10× Solução salina tamponada com tris (TBS, pH 7,5)Sigma, EUAV900483-1KG1 M Tris-Base
10× Solução salina tamponada com tris (TBS, pH 7,5)Sinopharm, China10019392NaCl de 1,5 M
(DAP)           detecção cromogênica pH 9,5            Detecção TSA pH 8.0Sigma, EUAV900483-1KG100 mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)           detecção cromogênica pH 9,5            Detecção TSA pH 8,0Sinopharm, China10019392NaCl (DAP) de 100 mM
          detecção cromogênica pH 9,5            Detecção TSA pH 8.0Sigma, EUAV900020-500G50 mM MgCl2· 6H2O
20× citrato salino-sódico (pH 7,0)Sinopharm, China100193923 M NaCl
20× solução salina-citrato de sódio (pH 7,0)Sigma, EUAV900095-500G0,3 M Solução de paraformaldeído Na-Citrato
a 4% (PFA, pH 9,5)Sigma, EUAV900894-100Gparaformaldeído a 4%
Sigma, EUAV900182-500G0,1 M Tampão de carbonato de sódio NaHCO3
(pH 10,2)Sigma, EUAV900182-500G80 mM NaHCO3
carbonato de sódio sub> (pH 10,2)Sigma, EUAS7795-500G120 mM Na2< / sub>CO3< / sub>
Solução de formamida (pH 10,2)MPBIO, EUAFORMD002formamida deionizada a 50%
(pH 10,2)5 vezes; Tampão de bloqueio de citrato de sódio-solução salina
em TBSRoche, Suíça111750419101% de blot
em TBSAMRESCO, EUA0694-500ML0,03% Triton X-100
Blocking Buffer em TBS1× Solução salina de fosfatase alcalina tamponada com Tris
Roche, Suíça111750419101,5 U/mL anticorpo conjugado com fosfatase alcalina antidigoxigenina
Solução de fosfataseTampão de bloqueio em TBS
Solução de fosfatase alcalina/peroxidase de rabaneteRoche, Suíça111750419101,5 U/mL de fosfatase alcalina antidigoxigenina conjugada anticorpo
Solução de fosfatase alcalina / peroxidase de rabanetekit TSA, Perkin Elmer, EUANEL701A001KTanticorpo conjugado com 1% de estreptavidina de rabanete peroxidase de rabanete
alcalino Solução de fosfatase alcalina / peroxidaseBuffer de bloqueio no
tampão de hibridizaçãoMPBIO, EUAFORMD00250% de hibridização de formamida deionizada
Buffer2&vezes; tampão de hibridização de citrato de sódio salino-sódio
Sigma, EUAD8906-50G10% sulfato de dextrano
Tampão de hibridizaçãoinvitrogen, EUAAM711920 µ g/mL de tampão de hibridização de t-RNA de levedura
Sigma, EUAD3159-10G0,2 mg/mL DNA de esperma de arenque
2-hidroxi-3-ácido naftóico-2'-fenilanilídeo/ 4-cloro-2-metilbenzenodiazônio substrato de sal de cloreto de hemi-zincoRoche, Suíça117588880011% de fosfato de 2-hidroxi-3-ácido naftóico-2'-fenilanilida (10 mg/mL)
Substrato de sal de cloreto de hemi-zinco de ácido 2-hidroxi-3-naftóico-2'-fenilanilídeo/ substrato de sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazônioRoche, Suíça11758888001sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazônio a 1% (25 mg/mL)
2-hidroxi-3-ácido naftóico-2'-fenilanilida fosfato/ substrato de sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazônioTampão de detecção
kit TSA de substrato de amplificação, Perkin Elmer, EUANEL701A001KT2% de fluoresceína-tiramidas
substrato de amplificação de sinal de tiramida, Perkin Elmer, EUANEL701A001KTDiluente de amplificação
Nome<strong>EmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumento
micrótomo de congelamentoLeica, Nussloch, AlemanhaEspectrofotômetro de criostato
Thermo SCIENTIFIC, USANANODROP 2000
Microscópio ópticoOlympus, Tóquio, JapãoMicroscópio Olympus IX71 Microscópio
confocalOlympus, Tóquio, JapãoOlympus BX45 microscópio
Kit Tampão de detecção de Tampão de detecção de Tampão de carbonato de sódio com Solução de Tampão de bloqueio de alcalina de rabanete TBS Sinal de tiramida Kit TSA deJung CM300 confocal

Referências

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