Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.
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Artigo de método
Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tau de proteína microtubule-associada é uma proteína neuronal que localiza-se principalmente em axônios. Geralmente o tau é essencial para o normal funcionamento neuronal porque está envolvido na estabilização e montagem de microtúbulos. Além de neurônios, tau é expresso em humana mama, próstata, gástrica, colorretal e cânceres pancreáticos, onde mostra a estrutura quase semelhante e exerce funções semelhantes como o tau neuronal. A quantidade de tau e sua fosforilação pode alterar o seu funcionamento como um estabilizador de microtúbulos e levar ao desenvolvimento de filamentos helicoidais emparelhados em doenças neurodegenerativas diferentes, tais como a doença de Alzheimer. Determinar o estado de fosforilação da tau e suas características de microtubule-ligação é importante. Além disso, examinar a localização intracelular do tau é importante em diferentes doenças. Este manuscrito detalhes protocolos padrão para medir a fosforilação da tau e tau vinculação de microtúbulos nas células de cancro colo-rectal com ou sem a curcumina e tratamento LiCl. Esses tratamentos podem ser usados para parar o desenvolvimento e proliferação de células cancerosas. Localização intracelular do tau é examinada com o uso de imuno-histoquímica e microscopia confocal enquanto estiver usando quantidades baixas de anticorpos. Estes ensaios podem ser usados repetidamente para compostos que afetam hyperphosphorylation tau ou vinculação do microtubule de triagem. Novela terapêutica usada para diferentes Tauopatias ou agentes anticancerígenos relacionados potencialmente podem ser caracterizados usando esses protocolos.
Introdução
Tau foi originalmente identificada como uma proteína associada a microtúbulos estável ao calor que estava co purificada com tubulina1. Tau é exclusivamente expressos em eucariontes superiores2,3,4. A principal função do tau é controlar microtubule montagem1,5,6. Também contribui para a polimerização de microtúbulos7, transporte axonal8, alterações no diâmetro axonal9, formação de neuroma p....
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Protocolo
1. preparação de reagentes
- Adicionar 10 µ l da solução de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da solução coquetel de inibidor de protease e 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da fosfatase solução de coquetel inibidor para 1 mL de 1 buffer de ensaio (RIPA) x radioimmunoprecipitation para preparar a Lise completa de RIPA.
- Preparar 10 x buffer buffer (PEM) de tubulina geral.
- Adicionar 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ácido etanesulfónico, 10mm (95,1 mg) etileno glicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic ácido, 10mm (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (....
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Resultados
Analisou-se a expressão de fosfo-tau e tau total após o tratamento das células com diferentes concentrações de curcumina ou LiCl (Figura 1). Tratamento das células com as três diferentes concentrações de curcumina diminuiu níveis de expressão de tau; no entanto, expressão fosfo-tau aumentou após o tratamento com baixa concentração de curcumina mas diminuiu após tratamento de células com altas concentrações de curcumina. Antifosfo-tau (Ser396) foi utilizada pa.......
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Discussão
Este manuscrito estabeleceu diferentes condições processuais para a detecção de tau total e fosforilada tau em células de cancro colo-rectal, tratados com curcumina e LiCl. Para avaliar o status geral de fosforilação da tau em amostras da proteína, foi descrito um ensaio da fosfatase. Este ensaio potencialmente pode ser usado para examinar o status de fosforilação de proteínas.
Este ensaio é baseado no princípio de que fosforilado proteína movimentos mais lento do que o seu estado não-fosforil.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto intitulado 'Desenvolvimento e industrialização de matérias primas cosméticas de alto valor de microalgas marinhas', financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, Coreia e foi apoiado por uma subvenção intramural (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de produtos naturais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HCT 116 células | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Armazenar a -20 ° C |
| penicilina-estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| solução de tripsina-EDTA | WelGene | LS 015-01 | |
| Placa de 100 mm | Corning | 430161 | |
| placa de 6 poços | Corning | Coster 3516 | |
| Anticorpo anti-Tau 13 | abcam | ab19030 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° |
| Centrífugas de Microlitro | C Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C |
| Microtúbulos (MT) | Citoesqueleto | MT001 | Armazenar a 4 &graus; C (dessecado) |
| Meio de montagem com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Armazene a 4 ° C no escuro |
| Hidróxido de sódio | Sigma | 72068 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Loja em -20 ° C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Desmembrador | Sônico Fisher Scientific | Modelo 500 | |
| Ultracentrífuga | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS + | Armazene a 4 ° Reagente |
| corante de ensaio de proteína | C Bio-Rad | 500-0006 | |
| &alfa;-tubulina (11H10) Sinalização de células mAb de coelho | 2125 | ||
| GAPDH (14C10) Sinalização de células mAb de coelho | 2118 | ||
| Anticorpo anti-Tau (fosfo S396) | abcam ab109390 | ||
| EGTA | Sigma | E3889 | Armazenar em temperatura ambiente |
| FastAP Fosfatase Alcalina Termossensível | Thermo Scientific | EF0651 | Armazene a -20 ° C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Armazenar em temperatura ambiente |
| Coquetel de Inibidor de Fosfatase | Sinalização Celular | 5870 | Armazenar a 4 &graus; C |
| Inibidor de Protease Coquetel | Sinalização Celular | 5871 | Armazenar a 4 &graus; C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C |
| Tau-352 humano | Sigma | T 9950 | Loja em -20 ° C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Loja por volta de 25 & C |
| Membrana PVDF | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Cabra anti-camundongo IgG Anticorpo Secundário | ThermoFisher | A-11005 | Armazenar em 4 ° C no escuro |
| Microscopia Confocal | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Ensaio | de Proteína Bio-Rad | 500-0006 | Armazenar em 4 ° O |
Referências
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neuro....
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Reimpressões e permissões
