Artigo de método

Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 de outubro de 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tau de proteína microtubule-associada é uma proteína neuronal que localiza-se principalmente em axônios. Geralmente o tau é essencial para o normal funcionamento neuronal porque está envolvido na estabilização e montagem de microtúbulos. Além de neurônios, tau é expresso em humana mama, próstata, gástrica, colorretal e cânceres pancreáticos, onde mostra a estrutura quase semelhante e exerce funções semelhantes como o tau neuronal. A quantidade de tau e sua fosforilação pode alterar o seu funcionamento como um estabilizador de microtúbulos e levar ao desenvolvimento de filamentos helicoidais emparelhados em doenças neurodegenerativas diferentes, tais como a doença de Alzheimer. Determinar o estado de fosforilação da tau e suas características de microtubule-ligação é importante. Além disso, examinar a localização intracelular do tau é importante em diferentes doenças. Este manuscrito detalhes protocolos padrão para medir a fosforilação da tau e tau vinculação de microtúbulos nas células de cancro colo-rectal com ou sem a curcumina e tratamento LiCl. Esses tratamentos podem ser usados para parar o desenvolvimento e proliferação de células cancerosas. Localização intracelular do tau é examinada com o uso de imuno-histoquímica e microscopia confocal enquanto estiver usando quantidades baixas de anticorpos. Estes ensaios podem ser usados repetidamente para compostos que afetam hyperphosphorylation tau ou vinculação do microtubule de triagem. Novela terapêutica usada para diferentes Tauopatias ou agentes anticancerígenos relacionados potencialmente podem ser caracterizados usando esses protocolos.

Introdução

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Tau foi originalmente identificada como uma proteína associada a microtúbulos estável ao calor que estava co purificada com tubulina1. Tau é exclusivamente expressos em eucariontes superiores2,3,4. A principal função do tau é controlar microtubule montagem1,5,6. Também contribui para a polimerização de microtúbulos7, transporte axonal8, alterações no diâmetro axonal9, formação de neuroma polaridade e neurodegeneração10. Tau também atua como um andaime de proteína para controlar algumas vias de sinalização. Estudos do cérebro de rato sugerem que tau é neurônio-específica e que é principalmente localiza em axônios11. Porque tau é essencial para o desenvolvimento neuronal e polimerização de microtúbulos, tau era a hipótese de desempenhar um papel importante no desenvolvimento axonal no sistema nervoso central; mais tarde, esta hipótese foi verificada por experimentos in vitro e in vivo . Além dos neurônios, tau é expressa em células não-neuronais diferentes, incluindo fígado, rim e músculo células12,13. Tau é expressa também em humana mama, próstata, colorretal, gástrica e câncer pancreático célula linhas e tecidos14,15,16,17,18, 19. tau é também encontrado na miosite inclusão-corpo como torcida tubulofilaments em corpos de inclusão20.

Tau pode transportar várias modificações borne-translational. De todas as modificações borne-translational, fosforilação é a mais comum. Fosforilação da tau aumento diminui sua afinidade para os microtúbulos, finalmente, desestabilizando o citoesqueleto. Oitenta e cinco sítios de fosforilação têm sido descritos na proteína tau isolada de tecidos do cérebro humano a doença de Alzheimer. Desses sites, 53% constituem apenas 6% tirosina resíduos21,22,23, 41% de treonina e serina. Fosforilação da Tau afeta sua localização, função, ligação, solubilidade e sua susceptibilidade a outras modificações borne-translational. Também fosforilação de tau a mais do que na medida do normal (ou totalmente saturada com grupos fosfato) é conhecido como hyperphosphorylation que Replica as características estruturais e funcionais da doença de Alzheimer24. Tau mantém o bom funcionamento dos microtúbulos axonal e assegura o funcionamento neuronal normal sob condições fisiológicas. No entanto, hyperphosphorylated tau não consegue manter uma vinculação microtubule bem-organizado, causando perda neuronal por causa de desmontagem do microtubule. Níveis normais de fosforilação da tau são necessários para tau adequado funcionamento, mas tau não funcionar normalmente, se seu nível de fosforilação característico é alterada e se hyperphosphorylated25. Na doença de Alzheimer e algumas outras doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade, tau torna-se hyperphosphorylated e forma filamentos helicoidais emparelhados e tangles neurofibrillary26,27. Assim, os métodos para determinar a fosforilação da tau e vinculação de microtúbulos são importantes.

Câncer colorretal, câncer um envelhecimento associada, é que o terceiro mais frequentemente diagnosticado cancro e o terceiro câncer proeminente causadores de morte para homens e mulheres28. Cancro colo-rectal é um dos principais cânceres causadoras de morte no mundo ocidental29. Porque tanto câncer colorretal e doença de Alzheimer estão associados com o envelhecimento e ambos acontecem principalmente em países desenvolvidos, onde as pessoas gostam de hábitos alimentares semelhantes, as duas doenças de alguma forma podem ser correlacionadas. Além disso, as células cancerosas positiva tau e tau respondem de forma diferente de agentes quimioterápicos, por exemplo, paclitaxel16.

A curcumina é um dos principais derivativos de Curcuma longa, açafrão especiaria indiana30. Durante séculos, as populações do Sul da Ásia consumiu cúrcuma em suas dietas em uma base diária. A curcumina é usada para tratar diferentes doenças, incluindo câncer colorretal, doença de Alzheimer, diabetes, fibrose cística, doença inflamatória intestinal, artrite, hiperlipidemia, aterosclerose e cardiopatia isquêmica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lítio também pode matar células de câncer colorretal ou impedir a sua proliferação39. Lítio também pode ser usado para tratar a doença de Alzheimer40 que diminui a agregação de tau e impede a sua hyperphosphorylation, como observado em um rato transgênico modelo41,42,43, 44.

Este manuscrito visa: 1) medir o tau total e os níveis de expressão de fosfo-tau em células tratadas; 2) descrevem um ensaio da fosfatase para medir global fosforilação da tau; 3) examinar microtubule-vinculação de tau; e 4) localizar tau pela microscopia confocal em linhas de células de câncer colorretal tratados com curcumina ou LiCl. Os resultados revelam que tratamento com células com curcumina, um supostamente bom agente quimioterapêutico para câncer de cólon, e tratamento com LiCl pode reduzir a expressão de ambos total tau fosforilada tau em linhas de células de câncer colorretal. Estes tratamentos também podem causar a translocação nuclear de tau. No entanto, inesperadamente, a curcumina falha melhorar a ligação do tau de microtúbulos.

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Protocolo

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1. preparação de reagentes

  1. Adicionar 10 µ l da solução de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da solução coquetel de inibidor de protease e 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da fosfatase solução de coquetel inibidor para 1 mL de 1 buffer de ensaio (RIPA) x radioimmunoprecipitation para preparar a Lise completa de RIPA.
  2. Preparar 10 x buffer buffer (PEM) de tubulina geral.
    1. Adicionar 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ácido etanesulfónico, 10mm (95,1 mg) etileno glicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic ácido, 10mm (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (3 mL de 10 M) NaOH em um tubo de 50 mL , misture com 15 mL de água destilada e dissolver usando um vórtice. Verifica o pH (deve ser 6,9). Se pH > 6,9, descartar o buffer e remake muito fresco.
      Nota: NaOH deve ser abaixo de 1,25 M para garantir que o pH não superação 6,9. Não é aconselhável usar HCl para ajustar o pH > 6.9.
    2. Adicionar NaOH gota a gota até pH 6,9. Adicione água destilada para fazer até 25 mL de tampão de PEM X 10. Finalmente, filtre usando uma seringa e um filtro de seringa 0,2 µm. Dividir esse buffer em alíquotas em tubos de 1,5 mL e armazene a 4 ° C.
  3. Prepare 5 x tampão de amostra com um agente redutor e tintura.
    1. Mix 300 µ l (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) de glicerol a 50%, 1 mL (2%) de 10% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e 1,2 mL de água destilada para compensar a 5 mL de 5 x tampão de amostra SDS. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
      Nota: Porque o glicerol é viscoso, medindo 1,25 mL glicerol é difícil. 1 mL de glicerol 100% pesa 1,26 g. Assim, pesar 1,575 g de glicerol de 100% (que equivale a 1,25 mL de 100% ou 2,5 mL de glicerol a 50%) em um 15 mL tubo primeiro; Misture bem com os outros componentes.

2. Cultura, o tratamento com curcumina ou LiCl tratamento e análise da expressão da proteína de célula

  1. Adicionar ~ 1 x 10 6 HCT 116 células em 100 mm pratos de cultura de tecidos contendo o mínimo essencial Media (MEM) suplementado com 10% de bovino fetal soro (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina. Depois de um dia de cultivo, células vão chegar a confluência de 60-70%.
    Nota: O número de placas necessária depende do número de tratamentos descritos abaixo.
  2. Quando as células alcançar confluência de ~ 65% (aproximada usando microscopia), remover o meio MEM suplementado e adicionar MEM isento de soro com 5 µM, 10 µM e 30 µM curcumina ou 25 mM, 50 mM e 100 mM LiCl. Incubar a 37 ° C por 24 h em um ambiente umidificado contendo 5% de CO 2.
  3. 24 h após o tratamento, lavar as células com 1 mL gelada fosfato salino (PBS) e raspe as células com uma espátula de célula. Transferência das células raspadas em 1,5 mL tubos de centrifuga e centrifugar durante 4 min a 1.800 x g a 4 ° C para obter célula Pelotas.
  4. Lisar as células, suspendendo as pelotas em 100 µ l de tampão RIPA completa a 4 ° C por 20 min enquanto grampeia regularmente os tubos. Proceda à sonicação as amostras brevemente.
  5. Centrifugar a célula homogenates em uma centrífuga de bancada a 22.570 x g por 20 min a 4 ° C. transferir os sobrenadantes para outros tubos etiquetados usando uma pipeta.
  6. Medir a concentração de proteína nos sobrenadantes pelo ensaio de Bradford 45 usando kits de ensaio-proteína comercial.
    7. Tampão de carregamento de gel de
  7. preparar amostras de concentração de proteína igual (10 µ g proteína/13 µ l da amostra) de lisados celulares com 4 X SDS. Preparado 4x do tampão de carregamento de gel de SDS fresco contendo 400 mM ditiotreitol (DTT).
    Nota: Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas em − 20 ° C, se necessário.
  8. Incubar as amostras em um bloco de calor a 100 ° C por 5 min. misturam as amostras usando um vórtice e esperem para refrigerá-los para ~ 10-15 min.
  9. Montar um sistema de eletroforese.
    1. Carga 10 µ g de proteína (13 µ l da amostra) por bem em um gel de poliacrilamida-SDS 10% por eletroforese (SDS-PAGE). Carregar a escada de peso molecular para o gel de uma faixa.
      Nota: Como começa a electroforese, a escada de proteína irá resolver em bandas de proteínas de peso moleculares aparentes. Use essas bandas para estimar os pesos moleculares das bandas desconhecidas da proteína.
    2. Depois de carregar as amostras, conectar os eletrodos positivos e negativos do sistema de electroforese para uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, começa a 70 V por 20 min mover as amostras da proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumentar a tensão para 125 V para aproximadamente 70-120 min até amostras e proteína escada chegam ao final do gel.
    3. Após a conclusão da electroforese, transferência do gel para uma membrana de polivinilideno difluoreto (PVDF) usando um sistema de eletroblotting molhado. Transferência para ~ 100 min a 100 V. bloco a membrana em 4% albumina de soro bovino (BSA) tampão de bloqueio para 90 min à temperatura de cerca de 25 ° C.
  10. Marcar o blot por cortá-lo do lado com a escada de peso molecular. Use uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar o Borrão. Preparar as soluções primárias-anticorpo (anti-tau a 1:5, 000; antifosfo-tau em 1:4, 000) e incube a mancha nesta solução a 4 ° C durante a noite.
  11. Após incubação durante a noite, lavar o Borrão para min 7 quatro vezes em solução tampão fosfato salino-Tween-20 (PBST).
  12. Preparar as soluções relevantes do secundário-anticorpo (cabra anticoelho ou anti-mouse IgG em 1:5, 000) e incubar o blot nesta solução para 90 min à temperatura de cerca de 25 ° C. lavagem em PBST quatro vezes, 7 min cada.
  13. Desenvolver o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com o fabricante ' recomendações de s. Cobrir a mancha usando um plástico transparente. Adquirir imagens de uma sistema para quimioluminescência com relevante software de imagem de quimioluminescência.

3. Ensaio de fosfatase

  1. tratar os lisados celulares (da etapa 2.5) com fosfatase alcalina no buffer de fosfatase alcalina.
    1. Para ambos controlam e amostras tratadas, prepare-se 20 µ l amostras contendo 20 µ g proteína total. Adicione o volume de lisados celulares que contém 20 µ g da proteína total, seguido de 2 µ l fosfatase alcalina buffer e fosfatase alcalina de 10 µ l. Adicionar água destilada para compensar a 20 µ l.
  2. Incubar as amostras a 37 ° C por 1 h. parar a reação pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a uma concentração final de 50 mM, ou adicionando ortovanadato de sódio (at 3 VO 4) em uma concentração final de 10 mM. A reação também pode ser interrompida por aquecimento a 75 ° C por 5 min.
  3. Antes de termina a incubação das amostras com fosfatase, preparar amostras de mesma concentração sem adicionar fosfatase para comparação com amostras tratadas fosfatase.
  4. Buffer de carregamento de gel de SDS X Add a 4 recentemente preparada contendo 400 mM DTT.
  5. Incubar as amostras em um bloco de calor a 100 ° C por 5 min. misturar as amostras usando um vórtice. Legal à temperatura de ~ 10-15 min.
  6. Montar um sistema de eletroforese para a execução de um gel de poliacrilamida de 10% por SDS-PAGE.
    1. Carga 10 µ g da proteína (13 µ l da amostra) por bem em um polyacry de 10%gel de lamide. Carregar a peso molecular escada.
    2. Após o carregamento da amostra, conectar os eletrodos positivos e negativos do sistema de electroforese para uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, começa a 70 V por 20 min mover as amostras da proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumentar a tensão para 125 V e funcione o gel para aproximadamente 70-120 min até amostras e proteína escada chegam ao final do gel.
    3. Após a conclusão da electroforese, transferência do gel para uma membrana PVDF usando um sistema de eletroblotting molhado. Transferência para ~ 100 min a 100 V.
    4. Marcar o blot, fazendo um pequeno corte no lado da escada de peso molecular. Usar uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar o blot.
  7. Bloquear a membrana em tampão de bloqueio BSA 4% para 90 min à temperatura ambiente.
  8. Incubar o borrão na solução primária-anticorpo (anti-tau a 1:5, 000), a 4 ° C durante a noite. Lave o borrão em PBST quatro vezes, durante 7 min cada.
  9. Preparar a solução de anticorpo secundário relevante (cabra anti-mouse IgG em 1:5, 000) e incubar o Borrão para 90 min à temperatura ambiente. Lavar em PBST quatro vezes, durante 7 min cada.
  10. Desenvolver o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com o fabricante ' recomendações de s. Cobrir a mancha dentro de um envoltório de plástico transparente. Adquirir imagens de uma sistema para quimioluminescência com relevante software de imagem de quimioluminescência.

4. Ensaio do microtubule

  1. para o ensaio de ligação do microtubule, repita os passos 2.1-2.6.
  2. Preparar 1 X (2 mL) PEM de tampão de buffer de PEM X 10 armazenadas a 4 ° C, adicionando 20 µM (40 µ l) de paclitaxel e GTP (20 µ l) de 1 mM. Inventariar os microtúbulos (MT) de − freezer de 80 ° C e o estoque de trabalho Escherichia coli tau de − congelador de 20 ° C.
  3. Preparar amostras conforme tabela 1.
  4. Incubar a 37 ° C por 30 min. se a 25 ° C por 60 min a 100.000 x g.
  5. Transferência de 120 µ l de sobrenadantes contendo desassociada tau, limpar e rotulado tubos.
  6. Adicionar 120 µ l (mesmo volume que o sobrenadante) de 5 X buffer para a pelota contendo limite tau da amostra e misture bem. Transferir a solução para limpar tubos etiquetados e misture bem.
  7. Medir a concentração de proteína (ver passo 2.6).
    Nota: Durante a preparação de amostras, use o volume de solução (etapa 4.6) para a preparação de amostras da pelota e o sobrenadante.
  8. Preparar amostras de concentração da proteína equivalente e adicionar preparadas 4 x tampão de carregamento de gel de SDS contendo DTT (400mm).
    Nota: As amostras podem ser armazenadas em − 20 ° C, nesta fase.
  9. Repita os passos 3.5-3.10.
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amostra nome Microtubule necessário principal proteína necessária PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-controle (6.21 μg/μl) 2 μl 9,66 μl (60 μg) μl de 108.34
μl 101.37 16.63 μl (80 μg) 2 μl HCT 116-curcumina 10 μM (4.81 μg/μl)2
3 HCT 116-curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) μl 87.51
4 HCT 116-LiCl 25mm (5,43 μg/μl) 2 μl 18.42 μl (100 μg) μl 99.58
5 Escherichia coli tau 2 μl 1 μl Tau-352 μl 117
6 MT apenas 2 μl X μl 118
120 μl de cada

tabela 1: preparação para o ensaio do microtubule-vinculação da amostra.

5. localização e expressão de Tau após tratamento das pilhas com curcumina

  1. limpar uma lamela usando 70% de etanol e seque-o com um tecido de laboratório. Inserir uma lamela única em cada poço da placa rotulado 6-poços-cultura de tecidos. Coloque a placa em uma câmara de segurança biológica do armário e ligue um UV luz pelo menos 3 h.
  2. Subcultura das células e semente-los nos poços relevantes da chapa 6-poços em 2.5 x 10 5 células/poço no meio de cultura recomendado.
  3. ~ 24 h, depois de examinar as células com um microscópio invertido usando tanto o X 10 e 40 objetivos X para verificar se há alterações morfológicas celulares. Gravar fotos se necessário.
  4. Lavar as células duas vezes com PBS. Consertar as células em 3,7% de formaldeído em uma incubadora de 37 ° C no escuro.
    Nota: Fixação por formaldeído à temperatura funciona bem, também. Usar equipamento de protecção adequado ao manusear formaldeído.
  5. Lavar as células em PBS. Consertar as células em metanol gelada no − 20 ° C durante 15 min. Permeabilize as células incubando-os em 3% BSA e 0,1% Triton X-100 em PBS no gelo durante 10 min. Lave as células com PBS.
  6. Incube as celulas em tampão de bloqueio (3% de BSA e 0.1% Tween-20 em solução de PBS) por 1h à temperatura ambiente.
    Nota: Incubação durante 2 h a 4 ° C funciona bem, também.
  7. Preparar a solução primária-anticorpo (anti-tau em 1: 200) em BSA 3% e 0,1% Tween-20 em PBS (por exemplo, 2 µ l tau-13 anticorpo em 0,4 mL de tampão).
  8. Cortar pequenos pedaços de um PVDF membrana para que as peças se encaixam dentro de cada poço da placa de 6-poços; mergulhe-os em água por 5 min. lugar o corte PVDF em cada poço.
  9. Adicionar 60 µ l de solução de anticorpo primário para o corte de peças PVDF em cada poço. Coloque as lamelas tal que as células podem tocar a solução primária-anticorpo. Incube a 4 ° C, numa câmara escura, úmida, durante a noite. Lavagem em PBS quatro vezes.
  10. Prepare a solução anticorpo secundário (conjugada com fluoresceína 594 anti-mouse IgG em 1: 400) em 3% BSA e 0.1% Tween-20 em PBS.
  11. Cortar pequenos pedaços de uma membrana PVDF, de modo que as peças encaixam-se dentro de cada poço da placa de 6-bem e mergulhe-os em água por 5 min. lugar o corte PVDF em cada poço.
  12. Adicionar 80 µ l da solução para cada uma das peças PVDF na placa 6-poços-anticorpo secundário. Coloca a lamela tal que as células podem tocar a anticorpo secundário solução. Incubar em uma câmara escura, úmida à temperatura ambiente por 2 h. lavagem com PBS quatro vezes.
  13. Montar amostras no meio de montagem com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e corrigir as lamelas em lâminas de vidro.
    1. Adicionar uma gota do meio de montagem com DAPI em lâminas de vidro. Remover as lamelas de cada poço e colocá-los nas corrediças de vidro contendo o meio de montagem com DAPI. Certifique-se de que a superfície de cada lamela contendo células coradas toca o mounmédio de Ting do slide de vidro correspondente.
    2. Aplicar esmalte ao redor cada lamela para selar e corrigi-los hermético nas corrediças de vidro. Se necessário, fazer essa etapa duas vezes.
  14. Incubar por 1,5 h em temperatura ambiente em uma câmara escura.
  15. Examinar os slides usando um microscópio confocal, usando óleo de imersão sobre a lamela em uma sala escura.

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Resultados

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Analisou-se a expressão de fosfo-tau e tau total após o tratamento das células com diferentes concentrações de curcumina ou LiCl (Figura 1). Tratamento das células com as três diferentes concentrações de curcumina diminuiu níveis de expressão de tau; no entanto, expressão fosfo-tau aumentou após o tratamento com baixa concentração de curcumina mas diminuiu após tratamento de células com altas concentrações de curcumina. Antifosfo-tau (Ser396) foi utilizada pa...

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Discussão

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Este manuscrito estabeleceu diferentes condições processuais para a detecção de tau total e fosforilada tau em células de cancro colo-rectal, tratados com curcumina e LiCl. Para avaliar o status geral de fosforilação da tau em amostras da proteína, foi descrito um ensaio da fosfatase. Este ensaio potencialmente pode ser usado para examinar o status de fosforilação de proteínas.

Este ensaio é baseado no princípio de que fosforilado proteína movimentos mais lento do que o seu estado não-fosforil...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto intitulado 'Desenvolvimento e industrialização de matérias primas cosméticas de alto valor de microalgas marinhas', financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, Coreia e foi apoiado por uma subvenção intramural (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de produtos naturais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HCT 116 célulasATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Armazenar a -20 ° C
penicilina-estreptomicinaHycloneSV30010
solução de tripsina-EDTAWelGeneLS 015-01
Placa de 100 mmCorning430161
placa de 6 poçosCorningCoster 3516
Anticorpo anti-Tau 13abcamab19030
Ditiotreitol (DTT)Roche10 708 984 001Temperatura de Armazenamento 2– 8 °
Centrífugas de MicrolitroC Hettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C
Microtúbulos (MT)CitoesqueletoMT001Armazenar a 4 &graus; C (dessecado)
Meio de montagem com DAPIVector LaboratoriesH-1200Armazene a 4 ° C no escuro
Hidróxido de sódioSigma72068
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Loja em -20 ° C
DPBSWelGeneLB 001-02
DesmembradorSônico Fisher ScientificModelo 500
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS +Armazene a 4 ° Reagente
corante de ensaio de proteínaC Bio-Rad500-0006
&alfa;-tubulina (11H10) Sinalização de células mAb de coelho2125
GAPDH (14C10) Sinalização de células mAb de coelho2118
Anticorpo anti-Tau (fosfo S396)abcam ab109390
EGTASigmaE3889Armazenar em temperatura ambiente
FastAP Fosfatase Alcalina TermossensívelThermo ScientificEF0651Armazene a -20 ° C
PMSFSigmaP7626Armazenar em temperatura ambiente
Coquetel de Inibidor de FosfataseSinalização Celular5870Armazenar a 4 &graus; C
Inibidor de Protease CoquetelSinalização Celular5871Armazenar a 4 &graus; C
RIPA BufferSigmaR 0278Temperatura de Armazenamento 2– 8 ° C
Tau-352 humanoSigmaT 9950Loja em -20 ° C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Loja por volta de 25 & C
Membrana PVDFBio-Rad162-0177
Cabra anti-camundongo IgG Anticorpo SecundárioThermoFisherA-11005Armazenar em 4 ° C no escuro
Microscopia ConfocalLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)Affymetrix75819
Ensaiode Proteína Bio-Rad500-0006Armazenar em 4 ° O
de de

Referências

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