Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo refinado para efetivamente revelar biotinilado amina de dextrano (BDA) rotulagem com uma fluorescente método através de um caminho neural recíproco de coloração. É apropriado para analisar a estrutura fina do BDA, rotulagem e distinguindo-a das outros elementos neurais sob microscópio confocal laser.

Abstract

Amina de dextrano de biotinilado de alto peso molecular (BDA) tem sido usada como um marcador altamente sensível neuroanatômica por muitas décadas. Desde que a qualidade da sua rotulagem foi afetada por vários fatores, aqui, nós fornecemos um protocolo refinado para a aplicação de alto peso molecular BDA para estudar a rotulagem neural ideal no sistema nervoso central. Após a injeção estereotáxica de BDA para o núcleo ventral póstero-medial (VPM) do tálamo em ratos através de uma pipeta de vidro delicado, BDA foi manchado com fluorescente streptavidin-Alexa (AF) 594 e counterstained com fluorescente Nissl mancha AF500/525. Sobre o fundo de coloração de Nissl do verde, o vermelho BDA etiquetando, incluindo organismos de célula neuronais e axonal terminais, mais distintamente foi demonstrada no córtex somatossensorial. Além disso, a dupla coloração fluorescente para BDA e o parvalbumin de proteína ligadora de cálcio (PV) foi realizado para observar a correlação de BDA rotular e interneurônios PV-positivas no destino cortical, proporcionando a oportunidade de estudar o local neural circuitos e suas características químicas. Assim, este método refinado não só é adequado para a visualização de alta qualidade neural de rotulagem com o alto peso molecular BDA através de vias neurais recíprocas entre o tálamo e o córtex cerebral, mas também permitirá a simultânea demonstração de outros marcadores neurais com fluorescente histoquímica ou imunoquímica.

Introduction

Alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular), um marcador altamente sensível, tem sido utilizado para rastreamento de vias neurais no sistema nervoso central por mais de 20 anos¹. Embora o uso do BDA é um trato neural comum técnica de rastreamento, a qualidade da rotulagem BDA pode ser afetada em animais por vários fatores^1,2,3. Nosso estudo recente indicou que a estrutura ideal do BDA rotulagem é não só associada com um tempo de sobrevivência de pós-injeção adequada, mas também correlacionada com a coloração do método⁴. Até ....

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em China Academy de chinês ciências médicas (número de referência 20160014). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Quatro ratos macho adulto (250-280 g de peso) foram utilizados neste estudo. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com umidade e temperatura controlada e permitiu o livre acesso à comida e água. Os instrumentos e os materiais utilizados no presente estudo foram mostrou na Figura 1.  Antes da cirurgia, to....

Results

Sobrevivência da injeção de pós 10 dias da BDA para o VPM foi suficiente para produzir intenso neural rotulagem nas áreas corticais correspondentes ipsilateral ao lado de injeção (Figura 2). ABC convencional e fluorescentes mancha procedimentos para BDA revelaram o padrão semelhante de rotulagem neural sobre a S1, incluindo anterogradely rotulado thalamocortical axônios e rotulado retrogradely corticothalamic neurônios (Figura 2<.......

Discussion

Selecionar um traçador adequado é um passo fundamental para uma experiência bem sucedida de rastreamento neural. Na família de BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) foi recomendado preferencialmente ser transportado pela via anterógrada neural em contraste com baixo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)^{2,3 , 11 , 12 , 13}. no entanto, muitos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sondas Moleculares	de Dextrana Amina Biotinilada (BDA)	D1956	10.000 peso molecular
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Sondas Moleculares	S32356	Proteger da luz
500/525 verde fluorescente Nissl mancha	Sondas Moleculares	N21480	Proteger da luz
Instrumento de estereotaxia cerebral	Narishige	SR-50
Micrótomo de congelamento	Thermo	Microm International GmbH
Imagem confocal	Olympus	FV1200
sistema
Micro Broca	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Instituto de Ciências de Animais de Laboratório, Academia Chinesa de Ciências Médicas	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost mais lâminas de microscópio	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop e Ilustração	Adobe	CS5