Artigo de método

UMA

DOI:

10.3791/55939

⸱

26 de julho de 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

Resumo

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Para garantir a sobrevivência, os organismos devem ser capazes de evitar habitats desfavoráveis, garantindo uma fonte consistente de alimentos. Caenorhabditis elegans alteram seus padrões de locomotriz após a detecção de diversos estímulos ambientais e podem modular seu conjunto de respostas comportamentais em resposta a condições de fome. Os nemematódios exibem tipicamente uma resposta aversiva diminuída quando removidos de uma fonte de alimento durante mais de 30 min. A observação de mudanças comportamentais em resposta a um estado nutricional em mudança pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a transição de um estado bem alimentado para um estado de fome.

Nós desenvolvemos um ensaio que mede a capacidade de um nematóide de atravessar uma barreira aversiva ( isto é, cobre) e chegar a uma fonte de alimento durante um período prolongado de tempo. Este protocolo baseia-se no trabalho anterior, integrando múltiplas variáveis ​​de forma a permitir a coleta contínua de dados à medida que os organismos se deslocam para umaN condição cada vez mais fome. Além disso, este ensaio permite um aumento do tamanho da amostra para que populações maiores de nemátodos possam ser avaliadas simultaneamente.

Os organismos defeituosos para a capacidade de detectar ou responder ao cobre imediatamente atravessam a barreira química, enquanto os nemátodos de tipo selvagem são inicialmente repelidos. À medida que os vermes de tipo selvagem estão cada vez mais famintos, eles começam a atravessar a barreira e chegar à fonte de alimento. Nós projetamos este ensaio para avaliar um mutante incapaz de responder a diferentes pistas ambientais, incluindo a sensação de alimentos ou a detecção de produtos químicos aversivos. Quando avaliados através deste protocolo, os organismos defeituosos atravessaram imediatamente a barreira, mas também foram incapazes de detectar uma fonte de alimento. Portanto, esses mutantes atravessam repetidamente a barreira química apesar de terem chegado temporariamente a uma fonte de alimento. Este ensaio pode facilmente testar populações de vermes para avaliar potenciais defeitos de via relacionados à aversão e à fome.

Introdução

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Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios 1 . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais 2 . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes 3 , atrativos 4 , temperatura 5 e até mesmo umidade 6 . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos 7- 9. Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural 10 em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos 11 , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado 1 e mutações para quase todos os genes do genoma 12 do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados.

Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens 17 . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis ​​múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental 18 . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva 4 . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo.

Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui 19 . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s 20 . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos 21 . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás 21 . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos 21 . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial 22 , 23 . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol 24 . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como "ensaio de raça alimentar". O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos.

Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ​​ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans 4 . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas 21 . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos 25 , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.

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Protocolo

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1. Preparação de organismos experimentais

  1. Escolha 10 nemátopos encenados L4 por estirpe 24 h antes de iniciar o ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nematóide de controle testado, escolha 10 L4s (10 para o controle e 10 para o ensaio).
    1. Manter os organismos L4 usando métodos padrão 26 , 27 durante 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichia coli . Se os organismos forem perdidos durante as etapas de lavagem subsequentes, compense aumentando o tamanho da amostra inicial ( ou seja, coloque 20 vermes em vez de 10).
      Nota: O comportamento é um fenótipo indevidamente variável. Execute o método em triplicado para cada tensão em três dias separados. Inclua tensões de controle adicionais e condições para novas tensões, como destacado na seção de discussão.
  2. Imediatamente antes do ensaio, transferir orga experimentalNismos para uma placa de ágar sem bactérias e permitir que os nematóides se movam livremente durante 1 minuto para remover o excesso de bactérias.
    1. Se os organismos experimentais tiveram condições de contaminação durante as 24 h anteriores ao ensaio, descarte-os.
  3. Pipetar 1 mL de M9 na placa sem bactéria para lavar vermes em um tubo de microcentrífuga.
  4. Centrifugar a 3.000 xg por 1 min. Worms deve formar uma pelota no fundo do tubo. Solução Aspirar M9 sem perturbar a pelota de sem-fim. Adicione 1 mL de M9 à pastilha de sem-fim, invertendo o tubo para misturar vermes com a solução.
  5. Repita as etapas 1.4 mais três vezes.
    1. Se o excesso de bactéria foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de 5 vezes. Nenhuma bactéria deve ser transferida para as placas de alimentação de cobre. Se o alimento for transferido para a placa de ensaio, ele irá interferir com a coleta precisa de dados.
  6. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 10081; L de M9 e a pele de sem-fim permanecem.
    Atenção: os comportamentos relacionados com a fome tornam-se evidentes após 30 min. Conseqüentemente, os vermes devem ser transferidos imediatamente da solução, uma vez que os passos de lavagem foram concluídos.

2. Preparação de placas de ensaio

  1. Prepare placas de agar NGM padrão dois dias antes do ensaio.
    1. Se as placas forem mantidas em um ambiente úmido, faça placas de ágar 3 dias antes do ensaio. Alternativamente, retire a tampa da placa por 3-6 h para garantir a secura adequada (se em um ambiente estéril).
  2. Com um marcador permanente espesso, faça uma linha na parte inferior da placa ao longo da borda externa e outra para formar uma barreira de linha média ( Figura 1 ). A barreira da linha média deve ser equidistante de cada borda da placa. Use uma régua para garantir medições precisas. Essas linhas servirão de guia ao transferir bactérias e a solução de cobre. Providenciou queE. coli é transferida antes da solução de cobre, essas linhas servirão como indicadores.
  3. Placa de semente com 50 μL de OP50 E. coli em apenas um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme ( Figura 2 ). A concentração bacteriana deve permanecer consistente em todos os ensaios; No entanto, pouca variabilidade foi observada em resposta a diferenças leves na concentração.
    1. Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Desde que a solução de cobre alinhe a borda da placa e forme uma barreira de linha média, transfira a bactéria para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento.
  4. Marque um segundo conjunto de placas e transfira-os não OP50 E. coli ( Figura 2 ). Essas placas servirão para avaliar o controle negativo. Essas placas também devem ter umMarcando em uma metade da placa para denotar a origem da transferência inicial.
  5. Permitir que as bactérias se sectem, depois incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Certifique-se de que os remendos bacterianos não sejam perturbados ao se transferir para uma incubadora ou sala de 37 ° C. Perturbações excessivas podem alterar a localização ou a forma do remendo de alimentos.

3. Ensaio de quimiotaxis

  1. Prepare uma solução de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes da hora de início do ensaio. Desde que sejam utilizados 125 μL da solução por placa, amplie este volume dependendo do número de placas de ensaio utilizadas ( por exemplo, 5 placas de ensaio, 625 μL).
  2. Pipetar 100 μL da solução de sulfato de cobre (II) na borda do ágar para criar uma barreira de cobre externa. O lado inferior marcado da placa deve servir de guia.
  3. Pipetar 25 μL da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira da linha média.
    1. Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II)Não entra em contato com o remendo bacteriano. Use uma técnica manchada, uma vez que a varredura pode afetar a locomoção devido a entalhes / arranhões no ágar.
  4. Deixe a solução de cobre secar na placa. O período de tempo pode variar dependendo das condições de placa e laboratório. Verifique visualmente a secura a cada 5 minutos após a transferência.
    Nota: A solução de cobre apresenta uma tonalidade azulada e é facilmente identificável. Use um lenço de laboratório para tomar levemente a solução perto da borda da placa para discernir a secura.
  5. Pipetar 20 μL da pastilha de sem-fim do fundo do tubo na metade sem bactéria da placa de ensaio.
    1. Certifique-se de que 10 vermes são transferidos para a placa de ensaio. Se extras adicionais foram incluídos acidentalmente, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa. Cada ensaio deve ter um número consistente de nemátodos durante o ensaio.
      NOTA: se muito poucos vermes são transfErrado durante os ensaios, o aumento do tamanho da amostra inicial mitiga as perdas potenciais durante lavagens e transferências.
  6. Remova o excesso de M9 da placa com um tecido de laboratório. M9 não deve entrar em contato com a solução de sulfato de cobre (II).
    Cuidado: Certifique-se de que os vermes e a superfície do ágar permanecem inalterados ao executar esta etapa. Se usado com muita dureza, o tecido do laboratório pode criar entalhes na superfície de agar da placa e pode remover vermes. Worms acidentalmente removidos via KimWipe devem ser descartados.
  7. Uma vez que a solução M9 foi removida e todos os vermes começaram os padrões de locomotriz não líquida, comece o cronômetro do ensaio.
    1. Otimamente, remova a solução M9 dentro de um min. O parâmetro essencial é a identificação da locomoção sinusoidal. Worms locomote de forma diferente, por exemplo , batendo em vez de sinusoidal, quando em líquido. Comece o teste de parada de ensaio uma vez que cada um dos órgãos experimentaisIsms pára de bater.
  8. Verifique as placas de ensaio a cada 30 min.
    1. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, marcar positivamente os organismos se atingirem o parto alimentar ao longo de um período de 4 h. Para as placas de controle negativo, marcar positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira.

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Resultados

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Utilizamos o tipo selvagem (N2), npr-9 (tm1652) e uma tensão de supressão npr-9 , ou seja , npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para avaliar as respostas à fome e à aversão ao cobre. Os organismos de tipo selvagem são capazes de detectar e responder à barreira de cobre aversiva, enquanto os mutantes npr-9 (GF) não iniciam uma resposta aversiva ao cobre ao longo do ensaio de

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Discussão

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Este design de ensaio modifica o ensaio de ração alimentar 24 para incluir uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva e ao redor da borda da placa para evitar a perda de nemátodos. Os organismos são testados quanto à sua capacidade de atravessar a barreira aversiva e alcançar um parto alimentar ao longo de um período de 4 h. No contexto de npr-9 (GF) , utilizamos este ensaio para avaliar como as condições de inanição podem afetar as respo...

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Divulgações

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Não temos nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 para William G. Bendena.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O até 1 litro. Autoclave para esterilizar antes de usar.]Produzido no laboratório
Sulfato CúpricoSigmaC-1297Use água para suspender adequadamente a uma concentração de 0,5M

Referências

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