Method Article

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Abstract

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Murino modelos da doença são indispensáveis para a investigação científica. No entanto, muitas ferramentas de diagnóstico como endoscopia ou imagem latente tomográfica não são rotineiramente empregadas em modelos animais. Leituras de experimentais convencionais muitas vezes dependem de análises post-mortem e ex vivo , que evitar exames de acompanhamento intra individuais e aumentam o número de animais de estudo necessário. Tomografia computadorizada mediada por fluorescência permite a avaliação não-invasiva, repetitiva, quantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. É altamente sensível e permite o uso de fabricantes moleculares, que permite a detecção específica e caracterização de alvos moleculares distintas. Em particular, sondas específicas representam uma ferramenta inovadora para a análise de expressão gênica de ativação e proteína na inflamação, doença auto-imune, infecção, doença vascular, migração celular, tumorigênese, etc. Neste artigo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre essa tecnologia de imagem sofisticada para na vivo detecção e caracterização de inflamação (i.e., infiltração de macrófagos F4/80-positivo) em um modelo murino amplamente utilizado de inflamação intestinal. Esta técnica também pode ser usada em outras áreas de pesquisa, como o acompanhamento imune de célula ou células-tronco.

Introduction

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Modelos animais são amplamente utilizados em investigação científica, e muitos procedimentos invasivos existem a atividade da doença de monitor e vitalidade, como a quantificação de alterações de peso do corpo ou a análise de sangue, urina e fezes. No entanto, estes são apenas os parâmetros indiretos substituto que também estão sujeitas a variabilidade inter-individual. Eles frequentemente devem ser complementados por análises post-mortem de amostra de tecido, que impede a observação serial em pontos de tempo repetitivo e direcionar a observação dos fisiológicos ou patológicos processa em vivo. Sofisticadas técnicas de imagem pequeno-animal surgiram, incluindo Cruz secional de imagem, imagem óptica e endoscopia, que permite a visualização directa destes processos e também permite análises repetitivas do mesmo animais1 , 2 , 3. Além disso, a possibilidade de monitorizar repetidamente vários Estados de doença no mesmo animal pode diminuir o número de animais necessários, que podem ser desejáveis do ponto de vista ética animal.

Várias técnicas de imagem ópticas diferentes existem para imagens de fluorescência na vivo . Originalmente, a imagem latente confocal foi empregado para estudar a superfície e subsuperfície eventos fluorescente4,5. Recentemente, entretanto, tomográficos sistemas que permitem avaliações quantitativas de tecido tridimensional foram desenvolvidos6. Isso foi feito através do desenvolvimento de sondas fluorescentes que emitem luz no espectro infravermelho próximo (NIR), oferecendo baixa absorção, detectores sensíveis e fontes de luz monocromática7. Enquanto técnicas de imagem cross-sectioning tradicionais, tais como a tomografia computadorizada (CT), ressonância magnética (MRI) ou ultra-som (US), dependem principalmente de parâmetros físicos e visualizar a morfologia, imagem latente ótica pode fornecer informações adicionais em processos moleculares subjacentes usar fluorescente endógena ou exógena sondas8.

Avanços na biologia molecular têm contribuído para facilitar a geração de inteligentes e alvo fluorescentes sondas moleculares para um número crescente de destinos. Por exemplo, absorção mediada e distribuição em uma área-alvo determinado podem ser visualizadas usando carbocyanine derivado-etiquetado anticorpos9. A abundância de anticorpos disponíveis, que podem ser rotulados para funcionar como marcadores específicos em áreas inacessíveis do corpo, fornece insights sem precedentes nos processos moleculares e celulares em modelos de tumorigênese e neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, imunológicas e inflamatórias7.

Neste estudo, descrevemos o uso de tomografia computadorizada mediada por fluorescência em um modelo murino de colite. Sulfato de dextrano de sódio (DSS)-colite induzida é um modelo padrão de rato quimicamente induzida de inflamação intestinal que se assemelha a inflamatória intestinal (IBD) de doença10. É particularmente útil avaliar a contribuição do sistema imunológico inato para o desenvolvimento do intestino inflamação11. Desde o recrutamento, ativação e infiltração de monócitos e macrófagos representam passos cruciais na patogênese da IBD, visualização de seu recrutamento e cinética de infiltração são essenciais para o monitoramento, por exemplo, o efeito de potenciais substâncias terapêuticas em uma configuração pré-clínicos12. Descrevemos a indução de colite DSS e demonstrar a caracterização mediada por tomografia computadorizada da infiltração de macrófagos da mucosa do intestino utilizando tomografia computadorizada molecular de fluorescência para a visualização específica do marcador de monócitos/macrófagos F4/80 13. Além disso, podemos ilustrar procedimentos auxiliares e complementares, tais como anticorpos rotulagem; a instalação experimental; e análise e interpretação das imagens obtidas, em correlação com as leituras convencionais, tais como índices de atividade de doença, fluem cytometry e análise histológica e imunohistoquímica. Podemos discutir as limitações desta técnica e comparações com outras modalidades de imagem.

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Protocol

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, de acordo com a lei alemã de proteção Animal (Tierschutzgesetz).

1. materiais e instalação Experimental

  1. Cuidados com animais.
    1. Use ratos combinados por sexo e idade de qualquer estirpe DSS-sensíveis (por exemplo, C57BL/6) em 20-25 g de peso corporal.
    2. Plano de pelo menos cinco ou mais ratos por grupo experimental e casa os ratos de acordo com as orientações de cuidados de animais locais.
    3. Fornece um padrão chow roedor dieta e autoclavadas bebendo água ad libitum.
    4. Remover o chow padrão e substituí-lo com chow alfafa-livre pelo menos três dias antes da digitalização para reduzir endoluminal autofluorescência.
  2. Indução de colite aguda induzida em DSS.
    1. Dissolver 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) em 100 mL de água esterilizada para obter um 2% (solução p/v).
    2. Encher o fornecimento de bebida dos ratos exclusivamente com a solução DSS e estimar 5 mL de líquido por rato por dia. Fornece a mesma água potável sem DSS para o controle de ratos10.
      Nota: Monitore os ratos diariamente até o final do experimento. Eutanásia nos ratos que perder maior que 20% do seu peso corporal inicial, ou que se tornam moribundo (i.e., persistentemente debruçado postura, diminuição dos movimentos, marcadamente com dificuldade de respiração, erectos casaco) de acordo com directrizes aplicáveis locais no animal bem-estar.
  3. Preparação do tomography mediada por fluorescência.
    1. Rotular o anticorpo desejado (por exemplo, rato anti-rato F4/80) com tintura de fluorescência (por exemplo, Cyanine7, λexcitação: 750 nm, λemissão: 776 nm) conforme descrito no protocolo do fabricante. Dialize anticorpo purificado em uma membrana de diálise adequada (tamanho de poros < 50-100 kDa) contra 1 L de cloreto de sódio 0,15 M pelo menos 2 h ou durante a noite.
      1. Transferir o anticorpo para 1 L de 0,1 M NaHCO3 e urinar pelo menos 2 h.
      2. Dissolver a quantidade necessária de corante fluorescente em dimetilsulfóxido (DMSO) (10,8 µ l/mg do anticorpo) e adicioná-lo para a solução de anticorpo. Use o corante fluorescente em 20-fold excesso molar para atingir uma taxa de tintura-para-proteína de 1:3.
      3. Incubar no escuro a 4 ° C por 1 h. Retire o anticorpo não-marcado pela diálise contra 1 L de sódio 0,15 M, ou usando uma coluna do desalting PD-10 e resolver em tampão fosfato salino (PBS) para aplicação em vivo .
      4. Determine a concentração de anticorpo final e relação de rotulagem por espectrofotometria.
      5. Medir a concentração de proteína em uma absorção de 250-330 nm e considerar absorção adicional pelo corante. Corrigir a absorção máxima em 280 nm (proteína), 11% da absorção máxima em 750 nm (próximo passo) para a rotulagem de Cyanine7.
      6. Medir uma diluição do composto (geralmente 01:10) 250-800 nm e extrair a concentração de Cyanine7 a 750 nm.
      7. Determinar a proporção de corante-para-proteína como: tintura/anticorpo = absorção máxima em 750 nm / 200.000 / (absorção máxima em 280 nm - 0,11 x absorção máxima em 750 nm) / 170.000.
      8. Manter a solução de anticorpo a 4 ° C e protegido da luz, para evitar o branqueamento antes da injeção.
    2. Carrega o volume de solução de anticorpos necessários em uma seringa estéril imediatamente antes da injeção e escudo de luz até que ele é usado.
    3. Determine o momento ideal de injeção de sonda e o procedimento de digitalização, dependendo da farmacocinética de traçador.
    4. Anestesiar os ratos utilizando isoflurano 1,5-2,5% inalado em oxigênio ou colocá-los de forma segura em uma retenção dedicada para a injeção de veia de cauda dos anticorpos etiquetados.
    5. Para anticorpos completos, injete o anticorpo marcado pelo menos 24 h antes da digitalização, tais como visualização de macrófago F4/80 anti-rato na colite murino. Injectar ratos por via intravenosa (IV) através da cauda da veia com anticorpo marcado em montante correspondente a 2,0 nmol de corante.
    6. Uso igualmente rotulado anticorpos inespecíficos (por exemplo, rato IgG ou outro isotipo correspondente à herança do anticorpo primário) como um isotipo controle em doses equivalentes da sonda específica.
      Nota: Os resultados in vivo scans após injeção do controle composto pode servir como uma referência para a interpretação da sonda específica dados de imagem.
    7. Use um barbeador elétrico para depilar o pelo de animal na região abdominal para minimizar a reflexão da luz e absorção.

2. técnico equipamentos

  1. Use um dispositivo de tomografia computadorizada mediada por fluorescência veterinária (FMT) do pequeno animal fluorescência ( Figura 4).
  2. Criar um novo estudo para cada projeto, clicando em "novo estudo" botão e incluir na descrição do estudo, os marcadores pertinentes, incluindo os parâmetros de imagem e doses para referência futura.
  3. Dentro deste estudo, criar grupos de estudo, de acordo com o respectivo estudo de projeto (por exemplo, para o tracer específico e inespecíficos do isotipo controle), clicando em "novo grupo de estudos" botão. Equipe cada grupo de estudo com o respectivo número de animais.
  4. Calibre o sistema para as construções de traçador.
    1. Execute a calibração para cada lote de traçadores para normalizar para a variação na rotulagem e permitir a medição quantitativa de dados da OI.
    2. Siga a orientação do fabricante instrumento para a calibração de cada sistema individual; a selecção de "Adicionar novo tracer", o sistema dará um guia através dos passos. Fornece a diluição da solução anticorpo aplicada e a concentração absoluta calculada do tracer a sonda.
    3. Para FMT, use um tecido-imitando fantasma de características definidas de espessura e absorção (lembrando tecido vital) e preenchê-lo com um volume específico de solução anticorpo utilizado. Esta medida no dispositivo FMT.
      Nota: O sistema usará a medição de referência da sonda fornecida, juntamente com a concentração determinada, para calcular as concentrações do marcador absoluto de medições futuras na vivo .
  5. Use uma gaveta de exame Aquecível com uma temperatura de 42 ° C.
    Nota: Isso impede que os ratos se tornando hipotérmico durante o exame.

3. animal anestesia

  1. Usar um fluxo contínuo de 1,5-2% vol % de isoflurano ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) e 1,5 L de O2/min para anestesiar os ratos.
Utilize sistemas de inalação especialmente concebidos para roedor anestesia (isoflurano vaporizador) para controlar facilmente a profundidade anestésica e para minimizar a exposição pessoal.
  • Posicione o mouse na câmara de indução à prova de vazamento e ligue o vaporizador para fornecimento de isoflurano (100% (v/v), vol. 5% de oxigênio, 3 L/min). Monitore o mouse até que seja reclinada e inconsciente.
  • Coloque-o na gaveta exame por tomografia computadorizada, com inalação de isoflurano contínua através do cone de nariz na dose de 100% v/v, 1,5% de vol no oxigênio, 1,5 L/min para minimizar os artefatos de movimento durante o exame. Para procedimentos de duração superior a 5 min, aplique pomada para os olhos de rato para não danificar a córnea.
  • Avalie profundidade anestésica, verificando os reflexos. Coloque o mouse em sua parte traseira; se a anestesia é suficiente, o mouse não deve virar. Aperte o mouse suavemente entre seus dedos; se a anestesia é suficiente, a perna não será retirado (fase de tolerância cirúrgica).

    • 4. tomografia computadorizada mediada por fluorescência Scan

    Nota: Adaptar os seguintes detalhes, que são específicos para o sistema FMT utilizado neste estudo (ver a Tabela de materiais) para dispositivos de imagem de reflectância de fluorescência alternativos ou sistemas FMT, conforme necessário.

    1. Coloque o mouse anestesiado em suas costas na gaveta exame.
    2. Execute o procedimento de digitalização.
      1. Introduza a fita do sistema da imagem latente e fechá-lo imediatamente para garantir anestesia contínua. Selecione a amostra adequada do grupo de estudo criado anteriormente. Selecione o traçador administrado no menu suspenso para garantir que os valores de concentração de traçador são calculados corretamente.
      2. Adquirir a imagem de reflectância de fluorescência no comprimento de onda adequado (720 nm para Cyanine7) para o planejamento de varredura e contorno do campo de varredura clicando no botão "obter imagens".
      3. Verá que o campo de verificação aparece como uma sobreposição na imagem de reflectância de fluorescência. Ajustá-lo para a região de interesse (por exemplo, dois-pontos ou abdômen), evitando o ar ou áreas de pele restante. Dependendo do destino da imagem, defina o número de imagem pontos de dados dentro do campo de varredura escolhendo o grosseiro para a resolução de digitalização-campo média e fina no menu à direita.
        Nota: Tenha em mente que um campo de varredura bem pode oferecer melhor resolução espacial, à custa de uma digitalização significativamente mais tempo.
      4. Iniciar a aquisição de dados/imagens no comprimento de onda selecionado clicando em "verificar".
        Nota: O tempo de verificação para uma varredura de médio-fino do abdômen inteiro será em torno de 5 min; nesta época, cada ponto de dados separadamente é iluminado pelo laser da excitação, e a fluorescência resultante é gravada.
      5. Retire a gaveta de imagem no final da varredura do animal e permitir que o animal se recuperar completamente antes de colocá-lo de volta para a jaula.
      6. Repita a FMT, se consideradas necessárias em vários pontos de tempo durante o experimento (e.g., dias, 0, 5 e 9-10 (final do experimento)), mas considerar a acumulação de anticorpo no organismo, aumentando assim o sinal de fluorescência do fundo.

    5. pós-scan

    1. Coloque o mouse em uma gaiola separada em uma toalha de papel sob uma lâmpada de aquecimento infravermelha e monitorar o mouse para sinais de desconforto ou sofrimento até recuperação completa. Coloque o mouse volta para seu respectiva jaula quando totalmente acordado.
    2. Eutanásia o ratos no final do experimento pela entrega de CO2 para o isolador na dose de 100% (v/v), 100% vol e 3 L/min. Não pre-encha a câmara com CO2, como uma súbita exposição a altas concentrações de CO2 pode causar desconforto. Verificar a morte depois que o mouse parou de respirar por um modo secundário subsequente de eutanásia como rápido deslocamento cervical.
    3. Explantes de cólon por laparotomia abdominal e realizar uma varredura ex vivo do cólon explantado, conforme explicado nas etapas 4.2.1 - 4.2.4. Abra cada cólon longitudinalmente usando a tesoura de Metzenbaum cirúrgica e enxaguar com solução salina antes de prepará-lo para posterior análise.
    4. Use um bisturi para cortar um fragmento de 0,5 cm do cólon distal e imediatamente colocá-lo em um tubo de 1,5 mL criogênico. Congelá-lo em nitrogênio líquido e loja a-70 ° C até nova utilização (por exemplo,mieloperoxidase (MPO) medições).
    5. Use uma vara de madeira e arregaçar o restante longitudinalmente abriu dois pontos da distal à extremidade proximal, para o exterior a mucosa ("técnica de rocambole"), para análise histológica. Coloque a preparação em um fixador (consulte a Tabela de materiais) e congelar a-80 ° C14.

    6. interpretação e reconstrução de dados

    1. Use a ferramenta de reconstrução do respectivo software de imagem para criar mapas 3D da distribuição da fluorescência a partir dos dados de imagem raw; exames são automaticamente adicionadas à ferramenta de reconstrução, quando, após a digitalização, a função "adicionar à fila de reconstrução" está selecionada.
      1. Caso contrário, selecione os exames no menu suspenso sob o respectivo estudo e grupo de estudo, a verificação com o botão direito e selecione "Adicionar para reconstrução."
    2. Para posterior análise, carrega um conjunto de dados para o software de análise. No menu suspenso na barra superior, selecione o respectivo estudo e, em seguida, selecione o grupo de estudo e cada animal no menu à direita; todos os exames realizados para este animal serão mostrados. Selecione a verificação correta e clique em "carregar".
      Nota: A reconstrução 3D da distribuição do traçador aparecerá à esquerda como uma sobreposição da imagem de reflectância de fluorescência inicialmente adquirida. O modelo pode ser girado e ampliado para análise mais fácil.
    3. Identificar os focos de acúmulo de rótulo inespecíficos (por exemplo, fígado ou a urina da bexiga) em mapas 3D reconstruídos e diferenciar os tecidos-alvo (por exemplo, do intestino ou intestino).
    4. Na barra superior, selecione a forma ROI mais adequada para o destino. Etiqueta tecido-alvo como regiões de interesse (ROI), colocando as respectivas ferramentas de medição do software de análise; o software irá fornecer uma intensidade de fluorescência para o ROI, bem como (pico-) quantidades molares do traçador que foi calibrada para a digitalização.
    5. Selecione a quantidade total de traçador no ROI adequado, normalizado para o tamanho ROI, como o equivalente mais adequado para a avaliação da atividade da doença em correlação com o infiltrado inflamatório (histologia).
      Nota: Outras características do ROI podem ser escolhidas, se apropriado, como representante do modelo específico.

    7.Ex Vivo Análises

    1. Hematoxilina e eosina mancha e mancha da imunofluorescência.
      1. Deparaffinize de seções, colocando-os em 70% etanol (EtOH) por 2 min; Enxágue com água destilada depois. Manchar com solução de hematoxilina por 5 min e posteriormente enxaguar com água morna da torneira por 10 min.
      2. Enxágue com água destilada, corante de contraste com solução de eosina por 2 min e lave novamente com água destilada.
      3. Lugar em 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH e xileno (2 vezes), por 2 min cada para desidratar e limpar as seções. Montar com meio de montagem resinoso.
    2. Mancha da imunofluorescência.
      1. Use os anteriormente obtidos cortes histologicos ("rocambole") para a mancha da imunofluorescência e preparar seções cryo-corte de 7 µm.
      2. Bloquear secções de cólon acetona-fixos e congelados no soro de rato de 5,0% por 10 min e incubar durante uma noite com diluído (1/500 v/v) rato primário anti-rato F4/80 biotinilado. Lave as seções três vezes em tampão salino Tris (TBS) e incube com Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) em PBS/BSA (0,1% w/v) durante a noite a 4 ° C.
      3. Lave as seções em TBS e mancha com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) para alcançar o contraste. Analisar as imagens de fluorescência sob um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais; ampliação de x 40; cubo filtro N2.1 com filtro de excitação 515-560) e contar as células F4/80-positivo por campo de alta potência.
        Nota: Considere o uso de anticorpos do mesmo clone e formato ao combinar na vivo FMT e post-mortem histologia de análise como a imuno-histoquímica ou mancha da imunofluorescência, dependendo o alvo pretendido. Para a detecção de F4/80-positivo macrófagos na vivo e ex vivo, foram utilizados diferentes formatos.
    3. Medições de MPO em amostras de cólon.
      1. Uso recentemente obtidos, amostras de cólon PBS-lavado ou amostras descongeladas para medições de MPO. Pesar todas as amostras e homogeneizar o tecido em tampão de Lise fornecido no ELISA kit (veja a Tabela de materiais) em um volume de 20 µ l de tampão de Lise por mg de tecido.
      2. Proceda à sonicação durante 15 s (frequência sonication: 20 kHz, potência: 70 W) e centrifugar as amostras durante 10 minutos a 200 x g e 4 ° C.
      3. Uso um ELISA comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com a descrição de fabrica. Efectuar o ensaio em duplicatas.

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    Results

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    Avaliação da colite:

    Colite induzida por DSS é um modelo murino quimicamente induzido de inflamação intestinal que se assemelha a humana IBD e leva à perda de peso, sangramento retal, ulceração superficial e danos na mucosa em camundongos suscetíveis15. É particularmente útil estudar a contribuição do sistema imunológico inato para o desenvolvimento da inflamação intestinal

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Apesar de técnicas de imagem médicas têm evoluído rapidamente nos últimos anos, nós ainda somos limitados em nossa capacidade de detectar processos inflamatórios ou tumores, bem como outras doenças, em seus primeiros estágios de desenvolvimento. No entanto, isso é crucial para o crescimento do tumor de compreensão, invasão, ou desenvolvimento de metástases e processos celulares no desenvolvimento de doenças inflamatórias e doenças degenerativas, cardiovasculares e imunológicas. Enquanto as técnicas tradicionais de imagem...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Agradecemos a Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber e Sra. Klaudia Niepagenkämper pela excelente assistência técnica.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagentes
    dextrano sódico (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SuéciaDB001
    E 4382
    Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, AlemanhaB506
    Hematoxilina                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek composto                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Holanda4583fixador para análises histológicas
    Solução salina tamponada com fosfato, PBSLonza, Verviers, Bélgica4629
    Cloreto de sódio 0,9%Braun, Melsungen, Alemanha5/12211095/0411
    Bicarbonato de sódio em póSigma Aldrich Deisenhofen, AlemanhaS5761
    Dieta padrãoAltromin, Lage, Alemanha1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Holanda4566
    Hemoccult (teste de papel guaiaco)Beckmann Coulter, Alemanha3060
    Biotina rato-anti-camundongo anti-F4/80 anticorpoSerotec, Oxford, Reino UnidoMCA497B
    Biotina rato-anti-camundongo anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg Alemanha553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, AlemanhaS-11225excitação/emissão máxima:  556/573nm
    Anticorpo anti-rato anti-camundongo anti-CD11b TCCalteg, Burlingame, EUAR2b06
    Anticorpo anti-rato purificado F4/80BioLegend, Londres, Reino Unido123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaD9542
    Anticorpo anti-camundongo de rato anti-Ly6C conjugado com FITCBD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha553104
    tampão FACSBD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Europa, Freiburg, AlemanhaPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, AlemanhaK 6631B
    Cy5.5 marcado anticorpo anti-rato F4/80BioLegend, Londres, Reino Unido123127pronto para uso rotulado Anticorpos (alternativa)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, EUA45-4801-80pronto para uso rotulado Anticorpos (alternativa)
    DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha67-68-5
    IsofluranoSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha792632
    EtanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha64-17-5
    Albuminas de soro bovino (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaA4612
    Solução salina tamponada Tris (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaSRE0032
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Equipamento
    FACS Sistema de Citometria de FluxoCalibur BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Alemanha
    Sistema de Imagem In Vivo FMT 2000PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUAFMT2000
    Software de Análise de Imagem True Quant 3.1PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUAincluído no FMT2000
    Microscópio Fluorescente Leica DMLBLeica,  35578 Wetzlar, Alemanha DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlim, AlemanhaHomogeneizador ultrassônicoHD 2070
    Bisturi descartável nº 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaZ692395-10EA
    Metzenbaum tesoura 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Alemanha22398330
    seringa luer lock 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaZ248010
    agulhas de seringaSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemanhaZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Bélgica352070
    Dieta sem alfafa Harlan Laboritories, Madison, EUA 2014 Pomada para os olhos Bepanthen Bayer, Leverkusen, Alemanha 80469764 Sulfato de Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha

    References

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