Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

Resumo

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Resumo

O ideal posição cromossômica (ões) de um determinado elemento de DNA foi/foram determinada por inserção aleatória mediada por transposon seguida pela seleção de aptidão. Em bactérias, o impacto do contexto genético na função de um elemento genético pode ser difícil de avaliar. Vários mecanismos, incluindo efeitos topológicos, interferência transcricional de genes vizinhos e/ou dosagem de gene associada a replicação, podem afetar a função de um determinado elemento genético. Aqui, descrevemos um método que permite a integração aleatória de um elemento do DNA no cromossomo da Escherichia coli e selecione os locais mais favoráveis, usando uma competição simples crescimento experimentar. O método aproveita-se de um sistema baseado em transposon bem-descrito de inserção aleatória, juntamente com uma seleção de clone(s) os mais aptos, pela vantagem de crescimento, um procedimento que é facilmente ajustável às necessidades experimentais. A natureza da clone(s) mais apto pode ser determinada pelo sequenciamento do inteiro-genoma sobre uma população clonal multi complexo ou pelo gene fácil caminhar para a rápida identificação de clones selecionados. Aqui, a região de DNA não-codificante DARS2, que controla a iniciação da replicação do cromossomo em e. coli, foi usada como um exemplo. A função de DARS2 é conhecida por ser afetado pela dosagem de gene associada a replicação; o mais perto DARS2 Obtém-se a origem da replicação do DNA, torna-se mais ativo. DARS2 foi inserido aleatoriamente o cromossomo de um DARS2-excluído estirpe. Os clones resultantes contendo inserções individuais foram agrupados e competiu contra o outro por centenas de gerações. Finalmente, os clones mais aptos foram caracterizados e encontrados para conter o DARS2 inserido em estreita proximidade com o local original de DARS2 .

Introdução

A função de qualquer elemento genético pode ser afetada pela sua localização no genoma. Em bactérias, isto principalmente resulta da interferência pela transcrição dos genes vizinhos, topologia de DNA local, e/ou dosagem de gene associada a replicação. Em particular, os processos de replicação de DNA e segregação são controlados, pelo menos em parte, pelas regiões cromossômicas não-codificantes¹e o funcionamento destas regiões depende de localização/contexto genômico. Em e. coli, exemplos são o site dif , necessário para a irmã de resolução do cromossomo²; Sequências KOPS, necessárias para segregação de cromossomo³; e dados, DARS1e DARS2 regiões, necessárias para o controle adequado de replicação cromossômica (abaixo; ⁴). apresentamos um método permitindo a realocação aleatória, seleção e determinação do contexto genético ideal de qualquer elemento genético determinado, exemplificado aqui o estudo da região não-codificante DARS2 .

Em e. coli, DnaA é a proteína de iniciador responsável pela cadeia de DNA, abrindo a única replicação origemoriquee para o recrutamento do helicase DnaB^5,6,7. DnaA pertence a AAA⁺ (i.e., ATPase associados com diversas atividades) proteínas e pode vincular tanto ATP e ADP com alta semelhante afinidades⁵. O nível de DnaA^ATP picos no início⁸, onde DnaA^ATP forma um multimer na orique que aciona o DNA abertura frente e verso⁹. Após a iniciação, orique feita temporariamente indisponível para re-iniciação devido ao sequestro por um mecanismo que envolve a ligação da proteína SeqA a hemimethylated orique^10,11. Durante o sequestro, o nível de DnaA^ATP é reduzido pelo menos dois mecanismos: a inactivação regulamentar de DnaA (RIDA)^12,13 e dados-dependente DnaA^ATP hidrólise (DDAH)^{14 ,15}. Tanto RIDA e DDAH promovem a conversão de DnaA^ATP DnaA^ADP. Antes de uma nova rodada de iniciação, DnaA^ADP é re-ativado para DnaA^ATP em sequências específicas de DnaA-reativando (DARS): DARS1 e DARS2^16,17. Os cromossomas dados, DARS1, regiõese DARS2 são não-codificantes e agir em uma maneira semelhante ao acompanhante para modular DnaA^ATP/DnaA^ADP interconversão. Nestas regiões, localizadas fora a origem de replicação, permitem a montagem de um complexo de DnaA para qualquer a inactivação (dados; ¹⁴) ou ativação (DARS1 e DARS2; ¹⁷) de DnaA. Exclusão de DARS2 em uma célula não altera massa dobrando tempo mas resultados em replicação assíncrona iniciação^15,16,18. No entanto, DARS2-células deficientes têm uma aptidão custo comparado a uma sua outra forma isogénicas durante ambas as competição de contínuo crescimento em meio rico, ou durante o estabelecimento da colonização do intestino de rato¹⁸. Isso indica que mesmo pequenas alterações na concentração de assincronia/origem tem um efeito negativo na aptidão bacteriana. Em e. coli, há uma pressão seletiva para manter a simetria (ou seja, dois braços de replicação de comprimento quase igual) de cromossomo¹⁹. Os dados, DARS1e DARS2 regiões têm a mesma distância relativa à orique em todas as e. coli estirpes sequenciadas¹⁸, apesar das grandes variações no tamanho do cromossoma.

Aqui, usamos a região de DARS2 de e. coli como exemplo para a identificação da posição cromossômica ideal para sua função. DARS2 foi inserido o transposon NKBOR e o resultante NKBOR::DARS2 transposon posteriormente inserido aleatoriamente no genoma de MG1655 ΔDARS2. Assim, geramos uma coleção de células, cada possuidor DARS2 colocados em um local diferente no cromossomo. Em vitro concorrência experimento, onde todas as células na coleção foram agrupadas e competiam entre si durante o crescimento contínuo em LB para um número estimado de 700 gerações, foi realizado. O resultado da experiência de competição foi monitorado/determinado usando o Southern blot, gene fácil caminhar e sequenciamento do genoma inteiro (WGS; A Figura 1). Clones de ponto de extremidade, resolvidos por gene fácil andar foram caracterizados por citometria de fluxo para avaliar parâmetros do ciclo celular. Em uma análise de fluxo cytometric, tamanho da célula, conteúdo de DNA e sincronia de iniciação podem ser medidos por um grande número de células. Durante citometria de fluxo, um fluxo de células únicas passa um feixe de luz de comprimento de onda apropriado para excitar o DNA manchado, então simultaneamente registado por photomultipliers que coletam a fluorescência emitida, uma medida do conteúdo de DNA, desde o as células são coradas para DNA. A luz difusa é uma medida da massa de célula²⁰.

O experimento concorrência em vitro que apresentamos aqui é usado para abordar questões relacionadas com a importância da posição cromossômica e contexto genômico do elemento genético. O método é imparcial e fácil de usar.

Protocolo

1. coleção da biblioteca do Transposon

Nota: O locus DARS2 cromossômico foi clonado para o Tn mini 10-baseado transposon, NKBOR (na pNKBOR) ²¹, resultando em NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pode ser obtido on-line de ²². pNKBOR é um vetor de suicídio baseado em R6K que requer a π de proteínas do iniciador para replicação ²³. Plasmídeo pJFM1, portanto, é capaz de replicar em uma cepa de Escherichia coli (por exemplo, Dh5α λ pir) contendo uma cópia cromossômica do gene do pir. No entanto, quando pJFM1 é transformado a sua deficiente em Pir MG1655, pJFM1 não pode replicar, levando à seleção de clones resistentes canamicina gerado pelas inserções aleatórias das NKBOR:: DARS2 para o cromossomo bacteriano. Para simplificar, estes são referidos como DARS2 inserções. Veja a Figura 1 para uma apresentação esquemática da metodologia.

1. Prepare electrocompetent MG1655 Δ DARS2 de crescimento activo em caldo lisogenia (LB), crescido a 37 ° C ²⁴ células.
2. Electroporate pJFM1 em electrocompetent MG1655 Δ DARS2, de acordo com Gonzales et al. ²⁴
   1. Adicionar 1 µ g de pJFM1 (em 1 µ l de água) para 40 µ l de Δ de electrocompetent MG1655 de e. coli DARS2 e transfira esta mistura para uma cubeta do pre-refrigerados e estéril intervalo de 0,2 cm. Inserir a cubeta na câmara de eletroporação. Electroporate em 18 kV, Ω 500 e 25 µF; a constante de tempo deve ser ~5.0 ms, e não há formação de arco deve ocorrer.
   2. Recuperar rapidamente a suspensão bacteriana por resuspending-lo em 1 mL de caldo LB pré-aquecido e transferir para um tubo de ensaio de 15 mL.
   3. Deixa as células recuperar incubando sob condições de crescimento aerado a 37 ° C por 30 min, sem seleção de antibiótica. As bactérias em placas de ágar LB suplementadas com canamicina 50µg/mL a placa e incubar a 37 ° C durante a noite.
3. Contar as colônias da eletroporação: uma colônia é considerada igual a uma inserção cromossômica transposon.
   Nota: As colónias podem ser contadas pelo olho ou com um contador de colônia. O número de colônias é inversamente proporcional a distância média que separa os transposões localizados no cromossomo de cada clone.
4. Adicionar 1 mL de caldo LB para cada placa e lave todas as colônias; 1 mL de caldo LB deve ser suficiente para lavar fora ~ 100.000 colônias. Re-utilize o mesmo 1 mL de caldo LB para aumentar a concentração bacteriana. Piscina de todas as colônias no mesmo tubo 50 mL.
5. Vortex o tubo e congelar o material de início (t = 0). Para congelá-lo, misture 1 mL de suspensão de células com 1 mL de glicerol a 50% no gelo. Transferi os tubos para secar gelo durante 10 minutos. Uma vez que as culturas estão congeladas, transferi-los para um freezer-80 ° C.
   Nota: Espera-se uma concentração de células de um mínimo de 50.000 UFC/mL neste passo.

2. Experiência de competição em LB

1. Thaw a biblioteca transposon de-80 ° C no gelo. Mix pipetando.
2. Transferir 100 µ l da biblioteca transposon a 10 mL de LB em um tubo de ensaio de 15 mL.
3. Crescer as células, ventiladas por agitação contínua (250 rpm), para 8 h a 37 ° C, a fase estacionária (ou seja, OD ₆₀₀ = ~ 4.0). Ajustar esses parâmetros para as condições de crescimento diferentes, conforme desejado.
4. Propagar a população bacteriana por transferências contínuas em meio fresco escaldada cada ~ 10 gerações. Para fazer isso, a transferência de 10 µ l da cultura anterior fase estacionária para 10 mL de LB fresco e crescendo para outro h 8 para a fase estacionária (ou seja, OD ₆₀₀ = ~ 4.0).
   Nota: Como a densidade óptica inicial e final são iguais, uma 1,000-fold diluição corresponde a ~ 10 gerações de crescimento (2 ¹⁰ = 1.024). A população bacteriana pode ser propagada diretamente no meio fresco escaldado ou salvos em 0-4 ° C (no gelo) e propagadas no dia seguinte. LB foi usado aqui para garantir tantos doublings celulares em tão curto tempo possível (uma vez dobrando perto 22 min).
5. Após cada 100 gerações de competição, salvar cinco amostras de 1 mL a-80 ° C (conforme descrito na etapa 3.3).
6. Se as diferenças de aptidão entre células contendo inserções transposon individuais deverão ser pequenas, manter a duração da competição longa; aqui, 700 gerações (t = 700) foram utilizados.

3. Análise de borrão do Sul para controlar o experimento sobre tempo de concorrência

1. prepara a sonda para o sul do borrão (seção 1-kb da NKBOR), realizando a amplificação de reação em cadeia (PCR) de polimerase utilizando primers específicos: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
   1. Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturação inicial. Em seguida, executar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s. Para a extensão final, use a 72 ° C durante 10 min.
      Nota: O modelo para a reação de PCR foi um de plasmídeo purificado pNKBOR ²¹.
   2. Etiqueta o fragmento resultante de PCR com dATP [α - 32P] usando o sistema aleatório da primeira demão, de acordo com Smith ²⁵.
2. Preparar o DNA celular total, de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben ²⁶ para t = 0 e selecionados tempo pontos até t = 700 estimado gerações de competição.
3. Digerir o ADN celular total com Pvu I, que corta o NKBOR que contém a região de interesse, uma vez só em uma região não coberta pela sonda; 1 unidade de Pvu pode ser usado para completamente digest 1 µ g de substrato DNA.
   Nota: A sonda vai reconhecer fragmentos contendo parte do transposon, juntamente com o DNA cromossômico de vários comprimentos, dependendo do local de inserção.
4. Realizar um borrão do Sul usando um gel de agarose de 0,7% de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben ²⁶.

4. Identificação dos Clones mais aptos

gene de fácil de utilização

1. andando, como descrito por Harrison et al. ²⁷, para identificar locais de inserção DARS2 de clones único (isoladas em placas LB) após 700 gerações estimadas da concorrência; as bandas mais no Southern blot, os mais isolados são necessárias para cobrir todas as inserções de transposon.
   1. Isolar o DNA genômico para modelo de PCR. Espalhar as bactérias em uma placa de ágar LB contendo 50 canamicina µ g/mL e incubar a 37 ° C durante a noite. Crescem colônias única pernoite no caldo LB a 37 ° C e posteriormente transferir 20 µ l em 200 µ l de água destilada esterilizada (ou usar purificação de DNA, como no passo 3.2).
      1. Vortex para misturar. Aqueça a mistura a 100 ° C por 10 min e centrifugar a velocidade máxima por 5 min. salvar o lisado a-20 ° C para uso futuro celular.
   2. Desenha três primers aninhados para recozer dentro o transposon de escolha (ver Figura 2 para uma representação gráfica da estratégia da PCR).
      Nota: Projetar Primers aninhada deve garantir que aninhados Primer 3 se encontra mais próximo a 5 conhecido ' final do transposon DNA, seguido de Nested Primers 2 e 1. O espaçamento entre aninhados Primer 3 e o 5 ' final do conhecido transposon DNA deve ser suficiente para uma leitura de sequência de DNA conhecido ao DNA desconhecido (para encontrar o local de inserção do transposon cromossômicas específicas). Para NKBOR foram utilizados os seguintes primers aninhados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. As primeiras demão aleatórias contendo os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição conhecidos também são usadas. Para garantir um resultado, deve-se usar pelo menos dois primers aleatórios diferentes. Os locais de restrição para as enzimas de restrição (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) deverá situar-se nos 3 ' final e precedido por dez bases aleatórias então que 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' e 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' são os primers contendo um Sau 3AI site (GATC) e um site de dIII Hin (AAGCTT), respectivamente, onde N = A, T, G ou C.
   Reação de PCR
   3. uso 200 ng de DNA genômico em 20 µ l. Incubar a 98 ° C por 30 s para a desnaturação inicial. Realizar 25 ciclos a 98 ° C por 30 s, 50 ° C, por 15 s e 72 ° C por 4 min. Para a extensão final, use a 72 ° C para min. 10 pares da primeira demão de uso consistindo de aninhados Primer 1 e um dos primers aleatórios.
   4. Usar pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 2 e o mesmo primer aleatório da segunda amplificação, usando 1 µ l de sua reação anterior como um modelo.
   5. Repita o passo 4.1.4 com pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 3 e o primer aleatório mesmo.
   6. Executar os produtos da reação de PCR a final em um gel de agarose 1,5% e mancha com brometo de etídio. Cortar uma banda na faixa de 100-800 bp e isolar o DNA usando qualquer gel ADN comercial, extraindo o kit de acordo com o fabricante ' direção de s. Resuspenda o DNA em 15 µ l de água.
      Nota: cuidado. Brometo de etídio é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
   7. a banda isolada na etapa anterior (etapa 4.1.6), com 3 de Primer aninhados como o primer de sequenciamento, usando Sanger de sequências de sequenciamento em um provedor comercial.
2. Executar WGS.
   1. WGS executar sobre o total de DNA extraído de selecionado amostras coletadas durante o experimento de competição, como descrito por Frimodt-Møller et al. ⁴.
3. Realizar a análise do sequenciamento.
   1. Align emparelhado-final lê a 150 Ns contíguos ao NKBOR, 1.904 AF310136.1 … 2.204 usando Bowtie2 ²⁸ com um intervalo entre subsequências de sementes (S, 1, 1.15) e um número máximo de caracteres ambíguos (L, 0, 0.9).
   2. Selecione o lê alinhado e então re-alinhar a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 usando blastN ²⁹
   3. atribuir transposição posições de inserção nos cruzamentos MG1655-NKBOR.

5. Citometria de fluxo

1. coletar amostras para citometria de fluxo.
   1. Equilíbrio cada cultura por mantê-lo em fase de crescimento exponencial pelo menos 10 gerações. Verifique o OD ₆₀₀ e certifique-se de que nunca excede 0.3.
   2. Recolher dois tipos de amostras de fluxo.
      1. Para RIF-excentricidade, transferir 1 mL da cultura para um tubo de 15 mL contendo 30 µ l de RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cefalexina 36 µ g/mL dissolvido em 12,5 mM NaOH). Deixá-lo a 37 ° C por um período mínimo de 4h de tremer.
         Observação: Rifampicina indiretamente bloqueia a iniciação da replicação do cromossomo permitindo para rondas em curso de replicação para continuar a rescisão. Cefalexina impede a divisão celular, o que resulta em desvio de replicação (RIF-excentricidade) e o acúmulo de células com cromossomos totalmente replicados. O número de cromossomos totalmente replicados é igual ao número de origens no momento do tratamento com rifampicina e cefalexina ²⁰.
      2. EXP-no exemplo, transferência de 1 mL de crescimento exponencial de cultura para um tubo de 1,5 mL no Ice.
2. Consertar as células como segue. Recolher as células por centrifugação a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C. resuspenda o pellet em 100 µ l de pH de gelada 10mm Tris 7.5 e adicione 1 mL de etanol gelado de 77%. Armazenar as amostras em 4 ° C até o uso.
3. Mancha as células como segue. Colheita de 100-300 µ l de células fixas por centrifugação a 15.000 x g, durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 130 µ l de " solução de coloração de DNA " (90 mithramycin µ g/mL, 20 brometo de etídio µ g/mL, 10 mM MgCl ₂ e 10 mM Tris pH 7,5). Colocar as amostras no gelo e no escuro; as amostras estão prontas para análise de citometria de fluxo após 10 min.
   Nota: Outro DNA manchas do que o brometo de etídio e mithramycin também podem ser usados ^{30 , 31}.
4. Determinar a origem por célula, a massa relativa da célula e o conteúdo de DNA relativo por análise de citometria de fluxo.
   1. Perform citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente, ³². Executar o RIF-excentricidade e EXP-amostras usando o fabricante de citômetro de fluxo ' instruções de s . Para mithramycin - e ethidium células manchadas de brometo, usar excitação comprimentos de onda 395 e 440 nm e coletar a fluorescência acima 565 nm.
      1. Para determinar o conteúdo de DNA em massa e relativo de célula relativa, executar as EXP-amostras para obter a dispersão de luz para a frente single-parâmetro contra histogramas de número de celular e intensidade de fluorescência contra histogramas números de celular para um mínimo de 30.000 eventos correspondente ao sinal de celular.
      2. Uso difusa single-parâmetro distribuição de luz para medir a média relativa de célula Mass.
         Nota: Luz difusa é uma medida da massa celular média ²⁰.
      3. Distribuições de single-parâmetro de intensidade uso da fluorescência para medir o DNA médio conteúdo ²⁰.
      4. Obter a concentração de DNA, como a relação do teor médio de DNA para a célula média massa ²⁰.
   2. Determinar o número de origens por célula.
      1. Amostras de RIF-desvio de execução para obter a intensidade de fluorescência do único-parâmetro contra celular números histogramas para um mínimo de 30.000 eventos correspondentes para o sinal de celular.
      2. Distribuições de single-parâmetro de intensidade de fluorescência de uso para determinar o número de cromossomos em cada célula ²⁰.
5. Calcular o índice de assincronia (Ai).
   1. Calcular o Ai, como descrito por Løbner-Olesen et al ³², utilizando as distribuições de único parâmetro de intensidade de fluorescência das amostras de RIF-excentricidade e a fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 e f7) / (f2 + f4 + f8), onde fx é as células de fração com x número de cromossomos totalmente replicados. Considere a iniciações assíncrono quando A > 0.1.

Resultados

Um borrão do Sul foi feito para verificar o que DARS2 foi distribuídas aleatoriamente o cromossomo na biblioteca transposon (t = 0) e que os clones mais aptos que persistem ao longo do tempo. O borrão do Sul foi realizado no DNA extraído do pool do transposon inicial (em t = 0) e cada 100 estimado de 700 gerações de concorrência (Figura 3). Aqui, o DNA celular total de cada time ponto foi digerido com o Pvuenzima de restrição, conhecida por ...

Discussão

A metodologia utilizada aqui aproveita-se de técnicas de estado-da-arte para responder a uma pergunta difícil em relação a posição ideal de genômica de um elemento genético. A inserção aleatória do elemento genético (mediada pelo transposon) possibilita a coleta fácil e rápida de milhares de clones, que então podem ser feitas para competir uns contra os outros para selecionar para a posição ideal do elemento genético investigada (ou seja, o clone mais apto).

Aqui, o DARS2 foi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	autoclavada Mili-Q	Nenhum
Cuvetes de Eletroporação, 0.1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser Sistema de Eletroporação	Bio-Rad	165-2100
LB Caldo	Thermo Fisher Scientific	12780029
Ágar LB, pó (Ágar Lennox L)	Thermo Fisher Scientific	22700025
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	17904
Marca Fisher  Placas de Petri de Plástico	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc  Tubos CryoTubes	Sigma-Aldrich	V7634
DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (2 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µ Kit	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II	Thermo Fisher Scientific	AM1455
Espectrofotômetro  SF/MBV/03.32	Centrífuga Pharmacia
Hermle      SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich Centrífuga  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1,5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2,0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
Cloreto de Sódio	Merck	6404
96% Etanol	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
Fenol Ultra Puro	BRL	5509UA
Clorofórmio	Merck	2445
Ribonuclease A tipo II	A Sigma-Aldrich	R5000
Sódiododecilsulfato (SDS)	Merck	13760
Lisozima	Sigma-Aldrich	L 6876
Isopropanol	Sigma-Aldrich	405-7
0,5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
Sulfato de canamicina	Sigma-Aldrich	10106801001
PvuI (10 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-Borato-EDTA tampão	Sigma-Aldrich	T4415
Brometo de etídio	Sigma-Aldrich	E7637
Ácido	clorídricoSigma-Aldrich	433160
Hidróxido de Sódio	Sigma-Aldrich	71687
Whatman  3MM papéis	Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrado	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN119B
Ficoll  400	Sigma-Aldrich	F8016
Polivinilpirrolidona	Sigma-Aldrich	PVP40
Soro Bovino Albumina - Fração V	Sigma-Aldrich	85040C
Ácido desoxirribonucléico sal de sódio de testículos de salmão	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak   BioMax   filme leve	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute   Kit de Extração de Gel	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute   Kit de Limpeza PCR	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Termociclador	Bio-Rad
SmartSpec Plus Espectrofotômetro	Bio-Rad
Rifampicina	Serva	34514.01
Cefalexina	Sigma-Aldrich	C4895
Mitramicina	Serva	29803.02
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	246964
Instrumento Apogee A10	Apogee