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Artigo de método

Um modelo de mouse de engenharia genética de câncer colorretal esporádico

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DOI:

10.3791/55952

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6 de julho de 2017

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1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2Department of General, Gastrointestinal and Transplant Surgery, University of Heidelberg, 3Department of Pathology, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4German Cancer Consortium (DKTK), 5German Cancer Research Center (DKFZ)

Neste artigo

Resumo

É apresentado um protocolo para o estabelecimento de um modelo de ratinho geneticamente modificado de câncer colorretal por infecção segmentar adeno-cre e sua vigilância através de colonoscopia de alta resolução.

Resumo

Apesar das vantagens da aplicabilidade e da relação custo-eficácia, os modelos de ratos de câncer colorretal baseados na injeção de células tumorais apresentam limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse geneticamente modificados foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos grandes, como o cólon, no qual apenas um único tumor é desejado.

Como resultado, desenvolveu-se um modelo de câncer colorretal imunocompetente, geneticamente modificado, que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. O desenvolvimento de tumores é iniciado por infecção cirúrgica segmentar do cólon distal com vírus adeno-cri em murganhos condicionalmente mutantes compostos. Os tumores podem ser facilmente detectados e monitorados via colonoscopia. Aqui descrevemos a técnica cirúrgica da infecção segmentar de adeno-creO cólon, a vigilância do tumor através de colonoscopia de alta resolução e apresentar os tumores colorretais resultantes.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) continua a ser uma das principais causas de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. 1 Embora o prognóstico de pacientes com doença em estágio inicial seja bom, muitos tumores são diagnosticados em estágios posteriores em que, apesar das numerosas opções de tratamento, o prognóstico é limitado. 2 , 3 , 4 , 5

A maioria dos modelos de ratos atuais de CRC baseia-se na implantação de células tumorais derivadas de linhas celulares ou tumores de pacientes em camundongos imunodeficientes. 6 , 7 , 8 Isso leva ao local e, dependendo do local da injeção e das células tumorais usadas para injeção, às vezes tumores metastáticos. 9 , 10 No entanto, os modelos de xenoenxerto resultantes têm majoLimitações. Eles devem ser estabelecidos em camundongos imunodeficientes, eliminando assim a interação complexa entre o tumor e o sistema imune do hospedeiro. Além disso, como o estroma do tumor é derivado de células hospedeiras, a interação entre o parênquima do tumor humano eo estroma murino é defeituosa e, portanto, não é representativa da doença. Essas deficiências podem ser evitadas pelo uso de linhas celulares murinas para injeção. No entanto, apenas algumas linhas celulares CRC murinas estão disponíveis e, semelhantes às linhas celulares humanas de CRC, são monoclonais e altamente anaplásticas. 11 Em resumo, a maioria dos modelos de ratos CRC actualmente disponíveis são altamente artificiais e não são totalmente representativos da doença humana.

Os modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) do CRC podem evitar essas desvantagens, pois apresentam tumores de mouse genuínos que são criados através da indução de mutações-chave do CRC no cólon. 12 , 13 ,14 Isso pode ser conseguido pela ativação de mutações germinais condicionais (floxed) pela recombinase cre dentro da mucosa colorretal. Enquanto em GEMMs de muitas outras entidades tumorais, a expressão de cremes germinativas (indutíveis) conduzida por promotores específicos de tecidos é usada, o credo germinal não pode ser usado no cólon, pois isso leva a um grande número de adenomas em todo o cólon causando a morte por carga tumoral benigna em Uma idade muito jovem. Portanto, no modelo descrito aqui, um credo que expressa o vetor adenoviral é usado para infectar um curto segmento do cólon. Isso leva à indução de tumorigênese dentro deste segmento da mucosa em um ponto de tempo definido pelo investigador, resultando em adenomas em última instância, progredindo em carcinoma invasivo e metastático. Os tumores são tumores de ratos genuínos, crescem em um microambiente intacto e, portanto, são capazes de simular a totalidade da oncogênese colorretal, incluindo a interação tumor-hospedeiro e a cascata metastática. Este modelo éPortanto, uma plataforma atraente para estudos de biologia do câncer e ensaios terapêuticos pré-clínicos.

Uma grande desvantagem dos modelos de mouse geneticamente modificados da CRC é a sua complexidade técnica. A entrega de crema local usando enemas de adeno-creativo rectal em camundongos com alelos de Apc floxed foi descrita anteriormente; No entanto, a incidência, a multiplicidade ea localização dos tumores intestinais podem ser altamente variáveis ​​com esta técnica. 15 Portanto, a técnica de confinamento da infecção adeno-creativa pelo aperto cirúrgico do segmento a induzir foi desenvolvida. 13 Alteramos este procedimento para melhorar o bem-estar dos animais, bem como reduzir a mortalidade e o número de tumores resultantes. Com este protocolo, todos os laboratórios com experiência em cirurgia de roedores pequenos devem poder reproduzir o modelo e produzir tumores altamente reprodutíveis e de fácil acesso à colonoscopia. Dependendo do condicional mUsos utilizados para a tumorigênese, o espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo e metástases podem ser observados. À medida que os tumores estão localizados no cólon distal, a avaliação endoscópica em série é facilmente possível neste modelo.

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Protocolo

Os experimentos com animais apresentados aqui foram revisados ​​e aprovados de forma independente por um Comitê de Uso e Cuidados de Animais institucional e governamental e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA). Todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar o sofrimento, incluindo anestesia e analgesia ou, se necessário, eutanásia prematura.

1. Indução local do tumor através da infecção cirúrgica Adeno-cre

  1. Preparação de animais para cirurgia
    NOTA: Virtualmente qualquer mutação condicional ("floxed") pode ser induzida através do método aqui descrito. É recomendado o uso de mutações em genes relevantes em câncer colorretal, como Apc, Kras ou Tp53. A eficiência da recombinação do creme é dependente do tamanho da construção a ser excisada. As grandes sequências de floxed são excisadas de forma menos eficiente. A recombinação de todos os alelos deve ser confirmada nos tumores por PCR.
    1. Para o desenvolvimento de tumores colorretais, use uma cruz dos seguintes alelos condicionais para um modelo básico de CRC (número de banco de dados MGI entre colchetes):
      Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
      Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
      Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18
    2. Se um alelo repórter de fluorescência for necessário ( por exemplo , para detectar micrometástases), use o seguinte alelo:
      Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
      NOTA: Todas as cepas acima estão disponíveis através do NCI Mouse Repository ou Jackson Laboratory. Não é necessário jejum, pois todas as matérias fecais remanescentes podem ser lavadas antes da infecção adenoviral. O jejum pré-operatório leva a maior mortalidade perioperatória e constitui um tremendo estresse para pequenos roedores.
    3. Use sevoflurano com 3 a 3,5% vol para anestesia geral. Uma perda de tO reflexo de pitada do dedo do pé indica anestesia suficiente.
    4. Antes da primeira incisão, injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea.
    5. Cubra os olhos do mouse anestesiado com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
    6. Coloque o mouse em posição supina em uma pequena mesa. Use fitas adesivas não traumáticas para restringir o mouse.
    7. Raspar o abdômen com uma máquina de barbear elétrica (o creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfetar com cotonete com álcool ou iodo. Use o tempo de contato recomendado pelo fabricante.
    8. Cubra o campo cirúrgico com cortinas estéreis.
      NOTA: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais.
    9. Use instrumentos estéreis de uso único ou esterilizados para todos os procedimentos cirúrgicos.
  2. Laparotomia da linha média e exposição do cólon
    1. Use tesoura (os escalpelos podem ser usados ​​alternativamente) para fazer uma incisão na linha média(~ 15 mm) da pele no abdômen inferior.
    2. Pegue a musculatura da parede abdominal com fórceps e cuidadosamente o incise com uma tesoura, abrindo assim a cavidade abdominal.
    3. Identifique o cólon distal, toque-o apenas com fórceps atraumáticos. Aperte o cólon com um grampo delicado ( por exemplo , uma braçadeira vascular Micro Serrefine) aproximadamente 15 mm proximalmente do ânus.
      NOTA: Dê especial atenção à vulnerabilidade do cólon em todos os momentos. A perfuração leva inevitavelmente a peritonite e sepse e requer eutanásia do animal.
  3. Infecção do cólon segmentar com o vírus Adeno-cre
    1. Insira um tubo de Teflon flexível de forma transanal e avançar cuidadosamente até atingir a oclusão do lúmen alcançada pela braçadeira previamente colocada a 15 mm da largura anal. Não use força excessiva, pois isso pode levar a perfuração.
    2. Cannule o tubo com uma cânula 30G, conecte uma seringa padrão de 1 mL e elimine o coloN com solução salina normal para evacuar a matéria fecal restante. Isso pode exigir vários mL de solução salina.
    3. Uma vez que o cólon distal está vazio, remova o tubo e substitua-o por um tubo de Teflon fresco e novamente posicione-o diretamente distal ao grampo como descrito acima.
    4. Ocultar o cólon com uma segunda braçadeira ~ 3 mm distal ao grampo proximal ( ou seja , sobre o tubo inserido, ~ 12 mm da largura anal), resultando em um segmento isolado de 3 mm para ser infectado.
      NOTA: Para a oclusão distal do segmento, os clipes de artéria coronária de Fogarty se mostraram mais adequados, pois são borrachas, levando a oclusão apertada do cólon, apesar do tubo intraluminal entre os ramos da braçadeira.
    5. Use uma segunda seringa (1 mL padrão com uma cânula 30G) para injetar cuidadosamente 50 - 80 μL de tripsina-EDTA a 0,25% no segmento do cólon apertado e incubar durante 10 min. Deixe a cânula e a seringa ligadas ao tubo de Teflon para evitar que o fluido fique para trás.
      NOTA: O cólon deve ser inflado para quebrar a barreira da mucosa e alcançar as células-tronco da cripta, mas não muito inflado para evitar a perfuração do segmento apertado.
    6. Primeiro remova a braçadeira distal e, em seguida, o tubo de tripsina.
    7. Lavar o cólon distal com ~ 500 μL de solução salina normal para remover a tripsina remanescente.
    8. Insira um novo tubo de Teflon, coloque a braçadeira distal no local e infle o segmento do cólon com 50 a 80 μL de solução adenoviral (10 11 unidades formadoras de placa (PFU) / mL em solução salina tamponada com fosfato) e incube durante 30 min ( Figura 2A ).
      NOTA: Não derrame a solução viral, pois o contato com adeno-cre pode levar ao desenvolvimento de tumores em qualquer tecido de camundongos condicionalmente mutantes.
    9. Remova as braçadeiras e o tubo.
  4. Encerramento do abdômen e recuperação pós-operatória
    1. Feche a parede abdominal com 6-0 de absorção rápida(Por exemplo , polidioxanona (PDS)).
    2. Feche a pele com os clipes da ferida cirúrgica.
    3. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento ajustada para 38 ° C até se recuperar completamente da anestesia.
    4. Administrar outro bolus de 0,05 mg / kg de buprenorfina ip 12 h após a cirurgia, seguido de bolos de buprenorfina adicionais a cada 12 h, se necessário.
    5. Monitore os ratos pelo menos uma vez por dia para detectar sinais de angústia devido ao crescimento do tumor.

2. Colonoscopia

NOTA: Dependendo das mutações condicionais utilizadas, a infecção adenoviral leva a tumores endoscopicamente visíveis dentro de 2 a 4 semanas. Portanto, realize a primeira colonoscopia pós-operatória 2 semanas após a indução adenoviral e repita a cada 2 semanas. Um sistema comercialmente disponível é recomendado para colonoscopia murina. 20

  1. Preparação de animais para colonoscopia
    NOTA: Não é necessário jejumEd. A matéria fecal restante geralmente está bem formada no cólon distal e pode ser empurrada para além do tumor durante a colonoscopia, tornando desnecessário o processo estressante do jejum repetido.
    1. Use sevoflurano com 3 a 3,5% vol para anestesia geral. Uma perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
    2. Cubra os olhos dos ratos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
    3. Limite os camundongos em posição supina numa mesa pequena.
  2. Colonoscopia
    1. Insira o escopo (diâmetro 1,9 mm, comprimento 10 cm) no trato intestinal através do ânus e cuidadosamente insufa ar sob controle visual para distender o cólon. Não insufie mais ar do que o necessário para o exame.
      NOTA: Para a insuflação de ar, a bomba de ar anti-nevoeiro do sistema de colonoscopia pode ser utilizada. Se nenhuma bomba de ar anti-neblina estiver disponível, qualquer outra bomba de ar com configurações de pressão muito baixa pode ser usada, ou préAr ssurizado com uma delicada válvula de redução de pressão. O dióxido de carbono (CO 2 ) facilmente conduz a acidose em pequenos roedores e, portanto, deve ser evitado.
    2. Pressione cuidadosamente o escopo até que uma lesão da mucosa no cólon distal possa ser identificada ( Figura 1A - 1D ).
    3. Salve imagens endoscópicas para avaliação posterior. Um sistema endoscópico de pontuação para tumores intraluminais já foi descrito anteriormente. 20
    4. Remova cuidadosamente o escopo e coloque o mouse na almofada de aquecimento ajustada para 38 ° C até que ele tenha sido totalmente recuperado da anestesia.

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Resultados

Se for realizado adequadamente,> 85% dos animais desenvolvem tumores. A mortalidade do procedimento cirúrgico aqui apresentado é <5%, a mortalidade da colonoscopia é praticamente inexistente. Na maioria dos ratos, uma única lesão é detectada; Em cerca de 30% 2 - 3 pequenos adenomas podem ser detectados, que geralmente se fundem em um único tumor dentro de 2 a 3 semanas após a indução do tumor.

O fenótipo eo comportamento...

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Discussão

Embora geralmente sejam fáceis de gerar e manter, os modelos clássicos de ratos CRC baseados na injeção de linha celular são artificiais e não são capazes de recapitular completamente a doença humana. Como conseqüência, os GEMMs foram desenvolvidos. O primeiro CRC GEMM foi o mouse Apc Min , que abriga uma mutação nula heterozigótica no gene Apc, imitando a polipose adenomatosa familiar (FAP) da doença hereditária humana. 21 Contudo, os ratos Apc Min invariavelmente desenvolv...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é dedicado à memória do professor Moritz Koch.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes/consumíveis
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Tripsina-EDTA (0,25%, Vermelho de fenol)Life Technologies GmbH25200072
Solução salina normal 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaB. Braun Melsungen AG235144
Ad5CMV-Cre (adenovírus, c = 2E+11 PFU/mL)Gene Transfer Vector Core
Universidade de Iowa
15 mL, tubos de centrífuga de 50 mLGreiner Bio-One GmbH188271/227270
Eppendorf tubes 1,5 mL/ 2 mLSarstedt AG & Co.72.695.400
Placa de Petri PS 100/15 mm (estéril, Nuclon)Fisher Scientific GmbH10508921/ NUNC150350
Seringa de 1 mL (sem volume morto) - Injekt-F Agulhade injeção 194291661da Braun/neoLab
BECTON DICKINSON304000
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Analgesia / anestesia
Sevoflurano (Sevoflurano AbbVie)AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Medical
oxygenAir Liquide MedicalGmbH-Buprenorfina
(Temgesic)Indivior Eu Ltd.-
Bepanthen - pomada oftálmicaBayer Vital GmbH10047757
Máquina de anestesia de pesquisa de mesa x / O2 Flush w / vaporizador de sevofluranoParkland ScientificV3000PS / PK
strong>Nome< / strong>Empresa< / strong>Número de catálogo< / strong>Comentários< / strong>
Equipamento Cirúrgico
celuloseLohmann & Seringa de insulina Rauscher Deutschland13356
EMG 1 mL (com cânula 30G)B. Braun Melsungen AG9161627S
Tubo de furo fino (furo: 0,28 mm/ diâmetro: 0,61mm)Smiths Medical Deutschland800/100/100
Fine ScienceTools 11018-12
- ToughCutFine Science Tools14058-11
Olsen-Hegar Porta-agulhasFine Science Tools12002-12
Kit AutoClipFerramentas Fine Science12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (sutura cirúrgica)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Braçadeira Vascular Micro Serrefine CurvadaFerramentas de Ciência Fina18055-05
Clipes de Mola FogartyEdwardsCDSAFE 6
Placa Quente 062Labotect13854
Isis - Barbeador de cabeloAesculap - Braun-
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colonoscopia
Fonte de luz fria XENON 175 SCBKarl Storz20132101-1Karl Storz Coloview System Mainz
Cabo de luz de fibra ópticaKarl Storz69495NLKarl Storz Coloview System Mainz
TRICAM Cabeça de Câmera de Três ChipsKarl Storz20221030Karl Storz Coloview System Mainz
TRICAM SLII Unidade de Controlede Câmera Karl Storz20223011-1Karl Storz Coloview System Mainz
15" Monitor de Tela Plana EndoVueKarl Storz9415NNKarl Storz Coloview System Mainz
Telescópio HOPKINS Straight Forward
diâmetro 1,9 mm; comprimento 10 cm
autoclavável
transmissão de luz de fibra óptica incorporada		Karl Storz64301AA
Bainha de proteção e exameKarl Storz61029C
30G <Cotonetes de Pinça Micro-Adson Ferramentas de Íris

Referências

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