Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.
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Artigo de método
Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Dada a natureza altamente previsível do seu desenvolvimento, embriões de Arabidopsis tem sido usados como um modelo para estudos da morfogênese em plantas. No entanto, embriões adiantados de planta de palco são pequenos e contêm poucas células, tornando-os difíceis de observar e analisar. Um método é descrito aqui para caracterizar a formação padrão em embriões de planta sob um microscópio usando o organismo modelo Arabidopsis. Após o afastamento de óvulos frescos usando solução de Hoyer, o número do celular na e morfologia de embriões podem ser observadas, e seu estágio desenvolvente poderia ser determinado por microscopia de contraste de interferência diferencial usando um 100 X lente de imersão de óleo. Além disso, a expressão de proteínas marcador específico marcados com proteína fluorescente verde (GFP) foi monitorada para anotar a especificação de identidade celular durante a padronização do embrião por laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Assim, este método pode ser usado para observar a formação de padrão em embriões de planta selvagem-tipo a nível celular e molecular e caracterizar o papel de genes específicos na padronização do embrião, comparando a formação padrão em embriões de plantas de tipo selvagem e mutantes embrião letal. Portanto, o método pode ser usado para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis.
Introdução
Embriogénese é o evento mais antigo no maior desenvolvimento da planta. Um formas de embrião maduro de um zigoto através de divisão celular e diferenciação sob estrito controle genético1,2. Embriões de Arabidopsis são um modelo útil para estudar o controle da morfogênese, porque a sequência de divisões celulares durante a embriogênese segue um padrão esperado3,4. No entanto, um embrião de Arabidopsis contendo um para várias células é muito pequeno para ser observados e analisados. Além disso, a mutação de certos genes pode causar embr....
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Protocolo
Nota: Este protocolo tem três partes: 1) observando a formação de padrão em embriões de Arabidopsis do selvagem-tipo usando microscopia DIC; 2) caracterizando o embrião padrão formação através da observação da expressão da proteína de marcador usando laser confocal, microscopia; e 3) determinar a função de um gene específico na embriogênese (usando o mutante naa10 por exemplo).
1. ovule clareira
- Preparação de material de planta
Nota: O protocolo descrito aqui é um exemplo sobre como cultivar plantas saudáveis; outras maneiras de crescer plantas saudáveis também funcionam.- ....
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Resultados
O método descrito neste artigo pode ser usado para observar a embriogênese diretamente sob um microscópio, anotar a especificação de identidade de células durante a embriogênese, com marcadores específicos e caracterizar o papel de um determinado gene, durante a embriogênese.
Resultados representativos a partir da análise do embrião padronização (desde a fase de zigoto alongada à fase madura de vara), no selvagem-tipo Arabid.......
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Discussão
Afastamento do ovule é um método útil para a detecção de divisão celular e avaliar morfologia durante a embriogênese em Arabidopsis; usando esta técnica, embriões podem ser observados diretamente sob microscopia DIC5,12. O passo fundamental para a liberação do óvulo é passo 1.3.4. O tempo necessário para o apuramento do ovule na etapa 1.3.4 é variável. Embriões no estágio de 2/4-cell podem ser observados claramente após 2 h na solução do Hoyer, Considera.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Jessica Habashi pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos o Dr. Xianyong Sheng do centro de imagiologia, faculdade de ciências biológicas, Universidade Normal de Capital (Pequim, China), para realizar a localização do ensaio DR5-GFP . Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Municipal de ciência governo de Pequim (CIT & TCD20150102) e da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31600248).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hidrato de Cloral | Sigma | 15307 | |
| Murashige e Skoog Basal Médio | Sigma | M5519 | |
| Fitagel | Sigma | P8169 | |
| Higromicina | Roche | 10843555001 | |
| Câmara de crescimento | Percival | CU36L5 | |
| Microscópio de fluorescência | Zeiss Oberkochen | Zeiss Imagem M2 | câmera: AxioCam 506 |
| microscopia confocal colorida de varredura a laser | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filtros: BP 495 - 555 nm |
| Estereoscópio | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | câmera: AxioCam MRc5 |
| solo rico em nutrientes | KLASMANN, Alemanha | ||
| Tubo de 50 mL | Corning Inc. | ||
| Tubo de 1,5 mL | Corning Inc. | ||
| de hipoclorito de sódio a 10% | Reagente analítico doméstico | ||
| sacarose | Reagente analítico doméstico | ||
| KOH | Reagente analítico doméstico | ||
| glicerol | Placa | ||
| de cultura | |||
| Vermiculita | de suprimentos domésticos | Suprimentos domésticos | |
| corrediça | Suprimentos domésticos | ||
| seringa | Suprimentos domésticos | ||
| pinças | Suprimentos domésticos | ||
| bancada | Equipamento doméstico |
Referências
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev P....
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Embriogênese de ArabidopsisFormação do Padrão do EmbriãoLimpeza do ÓvuloMicroscopia de Contraste de Interferência DiferencialMicroscopia Confocal de Varredura a LaserAnálise de Expressão de GFPPreparação da Solução de HoyerProtocolo de Esterilização de SementesPreparação do Meio MSEstadiamento do Desenvolvimento do Embrião
