Artigo de método

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

DOI:

10.3791/55974

⸱

3 de julho de 2017

 , 
1Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

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São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Resumo

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As proteínas de superfície celular medem uma ampla gama de funções. Em muitos casos, sua atividade é regulada por processos endocíticos que modulam seus níveis na membrana plasmática. Aqui, apresentamos protocolos detalhados para 2 métodos que facilitam o estudo de tais processos, ambos baseados no princípio da biotinilação de proteínas de superfície celular. O primeiro é projetado para permitir a determinação semi-quantitativa dos níveis relativos de uma proteína particular na superfície celular. Nele, os resíduos de lisina das proteínas da membrana plasmática das células são primeiro marcados com uma porção de biotina. Uma vez que as células são lisadas, estas proteínas podem então ser precipitadas especificamente através da utilização de estreptavidina imobilizada em agarose, explorando a afinidade natural destes últimos com a biotina. As proteínas isoladas de tal maneira podem então ser analisadas através de uma abordagem padrão de Western Blot. O segundo método fornece um meio de determinar a taxa endocítica de umaAr alvo da superfície celular durante um período de tempo. As proteínas de superfície celular são primeiro modificadas com um derivado de biotina contendo uma ligação dissulfureto clivável. As células são então deslocadas de volta para condições de cultura normais, o que provoca a absorção endocítica de uma proporção de proteínas biotiniladas. Em seguida, as ligações dissulfureto de grupos de biotina não internalizados são reduzidas usando o agente redutor impermeável à membrana glutationa. Através desta abordagem, as proteínas endocitadas podem assim ser isoladas e quantificadas com um alto grau de especificidade.

Introdução

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As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram interna....

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Protocolo

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1. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular em astrocitos por biotinilação

NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula da molécula da matriz extracelular na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais ).

  1. Usando o método descrito em Noel et al. 12 , preparar culturas de astrocitos corticais aproximadamente 2 semanas ante....

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Resultados

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Usando a biotinilação de superfície celular para avaliar a expressão da membrana plasmática de AQP4 em astrocitos
As culturas de astrocitos tratados com laminina e células de controlo não tratadas foram sujeitas a biotinilação de superfície celular usando os métodos descritos. As proteínas biotiniladas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose e depois separadas via SDS-PAGE. As frações de superfície celular foram avaliadas para AQP4 e β-dystroglyc.......

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Discussão

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Modificações:
Como esses métodos foram projetados para uso com células aderentes, especificamos o uso de PBS contendo 100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O e

100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para os passos de lavagem e como base de certos tampões de modo a garantir que as células permaneçam ligadas à superfície da cultura e que as junções célula-célula não sejam interrompidas. No entanto, os protocolos também podem ser aplicados a tipos de células não aderen.......

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Este projeto foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisas em Saúde PG # 20R47867.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de amônio (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA9647-50
Azul de bromofenolBio-Rad#1610404
cOmplete protease inibidor coquetelSigma-Aldrich11697498001
Etilenodiamina tetraacetato dissódico di-hidratado ( EDTA)Bio-Rad#1610729
Ditiotreitol (DTT)Bio-Rad#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco/Thermo Fisher Scientific11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Fisher Scientific#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-BiotinaThermo Fisher Scientific#21331
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco/Thermo Fisher Scientific16000-044
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlicinaSigma-AldrichG8898 
IodoacetamidaBio-Rad# 163-2109
Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-SwarmSigma-AldrichL2020Descongele no gelo.
L-glutaminaGibco / Thermo Fisher Scientific25030-081
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-actina (AC-15)Sigma-AldrichA5441
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-distroglicano (43DAG1 / 8D5)Leica BiosystemsB-DG-CE
Penicilina / estreptomicinaGibco / Thermo Fisher Scientific15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco/Thermo Fisher Scientific10010-023
Glutationa reduzidaSigma-AldrichG6529
Cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Dodecyl Sulfato de Sódio (SDS)Sigma-Aldrich862010 
Hidróxido de sódio (NaOH)Fisher ScientificS318-100
Resina de agarose estreptavidinaThermo Fisher Scientific#20347
Anticorpo anti-AQP4 policlonal de coelhoAlomoneAQP-004
Tris base (Trizma base)Fisher ScientificBP152-1
Tris-HClFisher ScientificBP153-1
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500

Referências

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  1. Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
  2. Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M.

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Etiquetas

Cell Surface BiotinylationPulse Chase BiotinylationAstrocyte CulturesAquaporin 4 ExpressionEndocytic Rate DeterminationWestern Blot AnalysisStreptavidin Agarose BeadsBiotinylation BufferCleavable Biotin DerivativeGlutathione Reduction

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