Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Summary

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Abstract

As proteínas de superfície celular medem uma ampla gama de funções. Em muitos casos, sua atividade é regulada por processos endocíticos que modulam seus níveis na membrana plasmática. Aqui, apresentamos protocolos detalhados para 2 métodos que facilitam o estudo de tais processos, ambos baseados no princípio da biotinilação de proteínas de superfície celular. O primeiro é projetado para permitir a determinação semi-quantitativa dos níveis relativos de uma proteína particular na superfície celular. Nele, os resíduos de lisina das proteínas da membrana plasmática das células são primeiro marcados com uma porção de biotina. Uma vez que as células são lisadas, estas proteínas podem então ser precipitadas especificamente através da utilização de estreptavidina imobilizada em agarose, explorando a afinidade natural destes últimos com a biotina. As proteínas isoladas de tal maneira podem então ser analisadas através de uma abordagem padrão de Western Blot. O segundo método fornece um meio de determinar a taxa endocítica de umaAr alvo da superfície celular durante um período de tempo. As proteínas de superfície celular são primeiro modificadas com um derivado de biotina contendo uma ligação dissulfureto clivável. As células são então deslocadas de volta para condições de cultura normais, o que provoca a absorção endocítica de uma proporção de proteínas biotiniladas. Em seguida, as ligações dissulfureto de grupos de biotina não internalizados são reduzidas usando o agente redutor impermeável à membrana glutationa. Através desta abordagem, as proteínas endocitadas podem assim ser isoladas e quantificadas com um alto grau de especificidade.

Introduction

As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram interna....

Protocol

1. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular em astrocitos por biotinilação

NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula da molécula da matriz extracelular na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais ).

1. Usando o método descrito em Noel et al. ¹² , preparar culturas de astrocitos corticais aproximadamente 2 semanas ante....

Results

Usando a biotinilação de superfície celular para avaliar a expressão da membrana plasmática de AQP4 em astrocitos
As culturas de astrocitos tratados com laminina e células de controlo não tratadas foram sujeitas a biotinilação de superfície celular usando os métodos descritos. As proteínas biotiniladas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose e depois separadas via SDS-PAGE. As frações de superfície celular foram avaliadas para AQP4 e β-dystroglyc.......

Discussion

Modificações:
Como esses métodos foram projetados para uso com células aderentes, especificamos o uso de PBS contendo 100 mg / L de MgCl ₂ ∙ 6H ₂ O e

100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para os passos de lavagem e como base de certos tampões de modo a garantir que as células permaneçam ligadas à superfície da cultura e que as junções célula-célula não sejam interrompidas. No entanto, os protocolos também podem ser aplicados a tipos de células não aderen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de amônio (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
Azul de bromofenol	Bio-Rad	#1610404
cOmplete protease inibidor coquetel	Sigma-Aldrich	11697498001
Etilenodiamina tetraacetato dissódico di-hidratado ( EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Ditiotreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotina	Thermo Fisher Scientific	#21331
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamida	Bio-Rad	# 163-2109
Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020	Descongele no gelo.
L-glutamina	Gibco / Thermo Fisher Scientific	25030-081
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-actina (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-distroglicano (43DAG1 / 8D5)	Leica Biosystems	B-DG-CE
Penicilina / estreptomicina	Gibco / Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
Glutationa reduzida	Sigma-Aldrich	G6529
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Dodecyl Sulfato de Sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
Resina de agarose estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	#20347
Anticorpo anti-AQP4 policlonal de coelho	Alomone	AQP-004
Tris base (Trizma base)	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500