Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Resumo

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Resumo

Terapias baseadas em células autólogas tem um passo mais próximo da realidade com a introdução de células-tronco pluripotentes induzidas. Células-tronco fetais, tais como o líquido amniótico e membrana células-tronco mesenquimais, representam um único tipo de células indiferenciadas com promessa em engenharia de tecidos e para reprogramação para iPSC para futuras intervenções pediátricas e células-tronco bancário. O protocolo aqui apresentado descreve um processo otimizado para a extração e cultivo primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco e gerando epissomal induzida por células-tronco pluripotentes dessas células em cultura totalmente quimicamente definida condições utilizando vitronectina recombinante humana e o meio de E8. Caracterização das novas linhas através da aplicação de métodos rigorosos – citometria de fluxo, imagem latente confocal, formação de teratoma e criação de perfil transcricional – também é descrita. As linhas recém-gerado expressam marcadores de células-tronco embrionárias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – Apesar de ser negativa para o marcador SSEA-1. As linhas de células-tronco formam os teratomas em camundongos scid-bege em 6-8 semanas e os teratomas contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas. Perfil transcricional das linhas através da apresentação de dados de microarray de expressão global para um algoritmo de avaliação de pluripotência bioinformatic considera-se todas as linhas pluripotentes e, portanto, esta abordagem é uma alternativa atraente à experimentação animal. As novas linhas de iPSC prontamente podem ser usadas em experimentos a jusante, envolvendo a otimização da diferenciação e da engenharia de tecidos.

Introdução

A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) traz sobre potenciais terapias de substituição de células, doença e modelagem do desenvolvimento e drogas e triagem toxicológica^1,2,3. Terapias de substituição conceitualmente pode ser alcançadas por injeção de célula, in vitro diferenciadas implantação de tecido (como patches cardíacas), ou guiada de regeneração por meio da engenharia de tecidos. O líquido amniótico (AFSC) e células-tronco da membrana (AMSC) também são uma excelente fonte de células para estas intervenções diretamente^4,5,6,7 ou como uma população inicial de célula para reprogramação em pluripotência^8,9,10,11,12.

Abordagens iniciais utilizados sistemas de cultura indefinido ou reprogramação métodos que exigem integração genômica de sucessão legal de constrói^9,10,11,12. Um estudo mais recente empregado um meio livre de xeno, apesar de uma matriz de acessório de membrana basal menos definida (BMM) foi usada, para gerar iPSC de células epiteliais de líquido amniótico. No entanto, o ensaio de formação de teratoma não foi incluído no estudo junto com uma riqueza de dados moleculares e in vitro. Células epiteliais de líquido amniótico foram encontradas para ter um rendimento aproximadamente 8 vezes maior reprogramação quando comparado aos fibroblastos neonatais¹³. Em outro estudo, células-tronco mesenquimais do líquido amniótico também foram encontradas para ser reprogramado para iPSC com muita eficiência maior¹².

Células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em representante de tecidos de todas as 3 camadas do germe e, portanto, têm o potencial mais amplo. Pacientes pediátricos poderiam beneficiar a colheita, reprogramação e engenharia de tecidos de suas células-tronco autólogas amnióticos fluidas pré-natal e haste de membrana amniótica células perinatal. Além disso, o nível relativamente baixo de diferenciação de células-tronco fetais (menores que as células estaminais adultas^14,15) poderia teoricamente ajuda na abordando a observada retenção de viés epigenéticas de células de origem em iPSC¹⁶.

Aqui nós apresentamos um protocolo para reprogramação de líquido amniótico e membrana células-tronco de pluripotência em quimicamente definidos xeno-free E8 médio na recombinação vitronectina¹⁷ (VTN) usando plasmídeos epissomal¹⁸. A principal vantagem das células líquido e membrana amnióticos como fonte de células para reprogramação reside na sua disponibilidade pré e perinatal e, portanto, esta abordagem beneficiaria principalmente pesquisa em engenharia de tecidos pediátrica.

Protocolo

O protocolo segue as orientações institucionais do Comitê de ética para a investigação humana. Consentimento por escrito do paciente foi obtido usando o líquido amniótico para pesquisa.

Este protocolo segue as políticas do Comité de uso da Universidade do Sul do Alabama e institucional Cuidado Animal.

1. isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais amniótica primária

1. Chapeamento de células de líquido amnióticos
   1. Obter um mínimo de 2,5 mL de líquido amniótico colhido no processo de amniocentese por um médico.
      Nota: Todos os manipulação de células vivas e tecido deve ser executada em um gabinete de tecido-cultura estéril e deve ser utilizado equipamento de proteção pessoal apropriado. Familiaridade com a cultura de célula básica e técnica estéril é necessária.
   2. Preparar amniótico fluido e membrana celular (AFMC) meio de cultura: meio basal EBM-2, 15% de soro fetal bovino (FBS), 20 ng/mL de bFGF, 25 ng/mL de EGF, 10 ng/mL do IGF. Para cultura de células-tronco principal membrana amniótica de fluidos, bem como amniótico, o médio deve ser complementado com solução de antibiótico antimicótico.
   3. No dia 0, misture 2,5 mL de líquido amniótico com 3,5 mL de meio de cultura AFMC e placa em um frasco T25. Incube a 37 ° C e 5% CO₂ pelo menos 48 h intacta antes de verificar a presença de colônias.
   4. No dia 5, colônias de células aderentes devem estar presentes. Suavemente agitar o frasco para desalojar as células que totalmente não aderir ao fundo e detritos e vácuo-Aspire a mistura de fluido amniótico/médio gastava com uma pipeta Pasteur. Substitua com 5 mL de meio fresco AFMC.
   5. Cultura por mais 5 dias. Médio de mudança todos os dias, conforme descrito na etapa 1.1.4.
2. Isolamento de células-tronco mesenquimais primárias de âmnio humana
   1. Obter a placenta logo que possível após o nascimento, no prazo de 24 h, o mais tardar, para maximizar a integridade celular. Cortar um segmento de² cm 9 do âmnio, remover coágulos e lave em um tubo de centrífuga de 50 mL com 30 mL de PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico.
   2. Pique as membranas usando um par de bisturis multar os pedaços em um prato de cultura de tecidos estéreis de 10 cm. A digestão das membranas e a extração das células serão alcançados através de um sistema de dissociação de tecido. Siga o protocolo do fabricante.
      Nota: as peças as mais finas do tecido após picagem, quanto maior o número de células recuperado após a digestão.
   3. Transferir a massa de tecido de membrana picada usando as lâminas de bisturi no tubo de dissociação de um tecido e misture com 4,7 mL de meio RPMI 1640. Misture as enzimas de dissociação (ver Tabela de materiais).
   4. Montar os tubos para o Dissociador de tecido e execute o programa "h_tumor_01". Incube os tubos a 37 ° C em uma plataforma de balanço por 30 min.
   5. Além disso, diluir as suspensões com 35 mL de RPMI 1640 e aplicar um filtro de µm 70 colocado sobre um tubo de centrífuga de 50 mL coleção.
   6. Centrífuga para min 5 a x 200 g à temperatura ambiente, descarte sobrenadante, resuspenda o pellet em 5 mL de RPMI 1640, contar as células usando um hemacytometer e placa em uma densidade de 10.000 células/cm² nos vasos de cultura de tecidos tratados com recém preparada AFMC suplementado com solução de antibiótico antimicótico.
      Nota: Em caso de digestão incompleta, pequenos pedaços de tecido estará presentes e células únicas será escassas. Spin para baixo novamente e a pelota toda a placa para um balão aferido de T75.
3. Cultura de primário AFSC e AMSC
   1. Colônias de passagem de AFSC/AMSC aspirando vácuo gasto médio com uma pipeta Pasteur e adicionar 2 mL de enzima de desprendimento de célula para o balão. Incube a 37 ° C, durante 5-8 min.
   2. Toque no frasco para ajudar a desalojar as células e misturar a suspensão com igual volume de meio AFMC (antibiótico-antimicótico suplemento não deve ser necessário a partir de agora). Centrifugar a 200 g de 4-5 min.. remover o sobrenadante usando ou um pipeta Pasteur de vidro ou simplesmente através da inversão do tubo e o esvaziamento-lo em um recipiente de resíduos.
   3. Apertar a parte inferior do tubo de centrífuga para quebrar acima a pelota em uma suspensão de célula única na gota de líquido restante e misture com meio AFMC de chapeamento. Placa T-balões em uma densidade entre 2.500 e 5.000 células/cm².
   4. Médio de mudança todos os dias. Não as linhas de celular, além da passagem 6 cultura. Para fins de reprogramação, use como baixa uma passagem possível.
   5. Prepare estoques congelados de AFSC e AMSC como back-ups usando meio de congelação. Colheita de culturas usando uma enzima de desprendimento de célula, centrifugar 200g por 4 ° C por 5 min.
   6. Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e apertar a parte inferior do tubo para singularizar as células a pelota. Resuspenda em meio de congelamento completo em uma densidade de 1 × 10⁶/mL e alíquota em cryovials. Guarde em um recipiente frio durante a noite a-80 ° C. Mova para o nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

2. reprogramação em pluripotência

1. Obter os plasmideos reprogramação
   1. Compra os plasmideos reprogramação através de um repositório de plasmídeo sem fins lucrativos. É necessário um contrato de transferência de Material.
   2. Transformar os plasmideos em células competentes de Escherichia Coli e isolar o plasmídeo usando um kit de extração comercial do plasmídeo. Siga as instruções do fabricante.
   3. Medir a concentração de Plasmideo DNA utilizando um espectrofotômetro. Aponta para uma alta concentração de plasmídeo resultante, idealmente cerca de 1 µ g / µ l para evitar a diluição da amostra durante do transfection.
   4. Medir as concentrações dos Plasmideos individuais usando um espectrofotômetro UV e alíquota-los individualmente.
   5. Misture 3 µ g, 3 µ g e 2 µ g de EN2K, ET2K e M2L plasmídeos, respectivamente. Esta é a solução de plasmídeo a reprogramação. A quantidade de solução de plasmídeo é suficiente para transfect 1 x 10⁶ células. Prepare vários tais alíquotas.
   6. Armazenar todas as alíquotas a-80 ° C.
2. Preparar as placas de cultura de destino
   1. Revestir uma placa de 6 com vitronectina – adicione 1 mL de tampão de diluição vitronectina em cada poço e misturar em 40 µ l de solução-mãe VTN (1 µ g/cm²). Deixe em temperatura ambiente (RT) ou na incubadora a 37 ° C por 1h.
   2. Vácuo-Aspire a solução com uma pipeta Pasteur e substitua por 2 mL do meio AFMC em cada poço. Armazenar a 37 ° C até que as células estão a ser chapeado.
      Nota: Importante: médio a AFMC utilizado nesta etapa não deve conter qualquer antibióticas ou antimicótico soluções.
3. Culto de colheita principal AFSC/AMSC
   Nota: Expanda AFSC/AMSC na cultura suficiente para fazer estoques congelados em um número de passagem baixa e escreve um balão T-75 para reprogramação. Desde como poucos como 100.000 células são suficientes para um experimento, visam colheita cerca de 500.000 células para compensar as perdas e se otimização dos parâmetros de transfeccao ou as condições de cultura diferentes devem ser testados.
   1. O mais cedo possível em uma passagem baixa, colha a AFSC/AMSC usando mistura de enzima de desprendimento celular conforme descrito na etapa 1.3.1 a 1.3.2. Depois que as células têm sido centrifugadas, prossiga para a próxima etapa.
   2. Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS e misture bem para lavar os componentes do soro. Conte as células usando um hemacytometer. Ajuste a densidade da célula a 100.000/mL de PBS e alíquota para tubos de 1,5 mL microcentrifuge. Isso garante apenas um mínimo tempo de contato entre as células e o buffer usado para transfeccao.
   3. Coloque o tubo de microcentrifugadora em cima de tubos de poliestireno de 5ml (como adaptadores, permitirá centrifugação em um rotor de balanço regulares) e centrifugar x 200g por 4 min à temperatura ambiente. Inverter os tubos e descartar o sobrenadante para um contentor de resíduos. Não utilize um rotor de ângulo fixo.
   4. Execute uma etapa de centrifugação adicional a 200 x g por 3 min à temperatura ambiente. Isso permitirá que o restante líquido das paredes do tubo para coletar no fundo. Aspire cuidadosamente com tudo isso usando uma pipeta de 200 µ l.
4. Transfecção com reprogramação plasmídeos
   1. Para reprogramação experimentos, um sistema de transfeccao (ver Tabela de materiais) será usado para entregar a reprogramação plasmídeos dentro das células. Coloque dicas de transfeccao, tubos de transfeccao, buffer de ressuspensão e eletrolítica reserva dentro do gabinete de cultura de tecidos. Os reagentes são mantidos em RT até que eles são abertos, em seguida, eles são armazenados a 4 ° C.
      Nota: Nós usamos a versão de 10 µ l do kit.
   2. Mova o dispositivo de transfeccao fechar para que a sua estação de tubo pode ser colocada diretamente dentro do gabinete. Encher um tubo de transfecção com 3 mL de tampão eletrolítica e montar o tubo para a estação, empurrando-a até dentro da ranhura.
   3. Leve o plasmídeo reprogramação alíquotas de solução preparadas na etapa 2.1.5 fora do armazenamento-80 ° C e permitir-lhes a descongelar no RT na cultura do armário.
   4. No dispositivo de transfeccao, selecione os seguintes parâmetros de transfeccao: 950 V, 40 ms e 1 pulso.
   5. Resuspenda o pellet contendo 100.000 células no buffer de ressuspensão 10 µ l. Trabalhar rapidamente deste ponto desde ressuspensão buffer é ligeiramente tóxico e um tempo de exposição maior resulta em uma menor viabilidade celular.
   6. Misture em 1/10 da solução de reprogramação do plasmídeo (a alíquota de solução foi preparada para um total de 1 x 10⁶ células).
   7. Monte uma ponta de transfeccao na pipeta do transfection.
   8. Aspire a suspensão de células para a ponta do transfection cuidadosamente, evitando a formação de bolhas de ar. Se observam-se bolhas, expulsar a suspensão e repita a aspiração. Bolhas de ar impedirá do transfection.
   9. Insira a pipeta de transfeccao transfeccao e pressione o botão "START" na tela do dispositivo do transfection. Aguarde a mensagem de tela informando sobre o sucesso do transfection e retire a pipeta do tubo imediatamente.
   10. Expulse a suspensão em 1 bem da placa-alvo 6-bem preparada na seção 2.2. Misture no meio de uma vizinha bem e distribuir a suspensão igualmente em ambos os poços (a densidade celular resultante será 50.000/poço).
   11. Repita o transfeccao para todos os tubos de microcentrifuga contendo AFSC/AMSC individualmente. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.
5. Cultura da AFSC/AMSC transfectada
   1. Cultura das células transfectadas para 2-5 dias. Em seguida, alterne para reprogramação médio consistindo de E8 suplementado com 100 µM de butirato de sódio no dia 3.
      Nota: Passagem secundária pode ser realizada para evitar o crescimento excessivo da fonte AFSC/AMSC. No entanto, a passagem irá desativar a opção para calcular a eficiência de reprogramação corretamente se este parâmetro for de interesse.
   2. Altere o meio de reprogramação todos os dias para todos os dias por 10 dias. Mude o meio todos os dias do dia 10.
6. Colheita manual das colônias totalmente reprogramadas para expansão clonal
   1. Totalmente reprogramadas colônias aparecem em torno do dia 14. Permita colônias expandir em tamanho e se tornar compacto. Eles podem ser manualmente e transferidos para placas frescas logo em dia 15 e 16.
   2. 1 h antes do procedimento de colheita, revestimento de placas de 24 poços com 8 µ l de VTN em 300 µ l de tampão de diluição vitronectina por alvéolo (1 µ g/cm²) e incube a RT ou 37 ° C. Substitua a solução E8 meio sem butirato de sódio.
   3. Selecione colônias de tamanho suficiente (idealmente mais de 400 µm de diâmetro) em uma cultura estéril do armário. Pode ser usado um microscópio de contraste de fase ou um estereomicroscópio.
   4. Para a colheita, será usado um microscópio de imagem LCD colocado no armário desde que seu monitor elimina a necessidade de oculares. Esterilize o estágio de microscópio com etanol a 70%.
   5. Usando um microscópio de cultura de células de contraste de fase regular, selecione, marque e anote o número de colónias a ser escolhido. Isso é importante ter certeza de que o tempo não é desperdiçado para este processo durante a colheita real.
   6. Preencha um número de tubos PCR que é igual ou maior que o número de colónias a ser escolhido com 30 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) em PBS. Colónias serão colocadas para estes tubos para dissociação parcial antes do chapeamento.
   7. Plano para escolher 5 colônias de cada vez as chapas com uma pipeta de 10 µ l definida como 2 µ l. colocar a ponta da pipeta na posição inclinada na borda de colônia e cuidadosamente e gradualmente raspar toda a colônia fora da superfície. Imediatamente, aspirar toda a colônia para a ponta da pipeta e transferi-lo para um dos tubos de PCR preparados com EDTA.
   8. Repita com as restantes 4 colônias. Incube a RT por 4-6 min.
   9. Pipetar a suspensão e descer suavemente usando uma ponta de pipeta maior para a colônia se dividem em grupos menores. Evite a criação de uma suspensão de célula única.
   10. A suspensão da placa diretamente em um alvo bem de uma placa de 24 preparado na etapa 2.6.2. Repeti com as restantes colónias.
   11. Repita as etapas 2.6.6 através de 2.6.10 se mais de 5 colônias são para ser escolhido mas não escolher mais de 5 colônias de cada vez. Incube a 37 ° C e 5% de CO₂.
7. Expansão clonal e maturação de iPSC
   1. Permita colônias crescer e tornar-se compacto. 3-6 dias são suficientes. O meio de cultura mudam diariamente. Use entre 400 µ l e 1 mL de meio de E8 com base na densidade celular.
   2. Poços da placa de 24 poços com uma densidade suficiente de colônia serão expandidos em placas 6-boas. 1 h antes de passagem, revestir as placas de 6-poços com VTN (como na etapa 2.2.1). Em seguida, substitua a solução no poço com 2 mL do meio de E8 por bem.
   3. Aspirar o gasto médio dos poços de fonte usando uma pipeta de 1 mL e substituir com 300 µ l de 0,5 mM EDTA para lavar. Aspirar imediatamente usando a mesma ponta da pipeta e substituir com 300 µ l de 0,5 mM EDTA novamente e, em seguida, incubar a RT por 5 min. Aspire utilizando uma pipeta de 1 mL de líquido.
   4. Definir a pipeta de 1 mL de capacidade, montar uma dica de largo diâmetro 1 mL nele e aspire o meio E8 do alvo bem na ponta. Lave a cultura de iPSC de fonte com um fluxo de médio porte.
   5. Transferi a suspensão para o destino bem e pipetar subindo e descendo várias vezes para quebrar acima colônias em aglomerados de células de 20-50. Certifique-se que ser distribuídos uniformemente no poço pelo suave balançar e tremer a placa e incubam a 37 ° C e 5% de CO₂.
   6. Mude o médio diariamente e passagem a cada 3 a 4 dias. Qualquer diferencia colônias podem ser marcadas sob o microscópio de contraste de fase e removido usando a ponta da pipeta na cultura do armário. Isto permite a propagação seletiva da cultura de iPSC puro de alta qualidade.
   7. 1 h antes de passagem, revestir os poços de uma placa de 6-poços com VTN como na etapa 2.2.1. Em seguida, substitua a solução com 2 ml do meio de E8 por bem.
   8. Rotina de passagem é semelhante a inicial passagem feito usando 0.5 mM EDTA (etapas 2.7.2 para 2.7.5). Substitua o gasto médio em um poço de uma placa de 6 com 1 mL de EDTA para lavar e descartar.
   9. Adicione 1 mL de EDTA e incubar a RT por 5-7 min para dissociação parcial. Otimizar o tempo de incubação se necessário, certificando-se de uma suspensão de ao redor 20 - a 50-célula aglomerados é produzido. Evite a dissociação em células únicas.
   10. Descartar a solução de EDTA e aspirar 1 mL do meio de E8 usando uma pipeta de 1 mL do alvo em uma ponta da pipeta de largo diâmetro.
   11. Lavar a cultura de iPSC de fonte com um fluxo do meio de E8 repetidamente até que uma parte desejada dele foi lançada da superfície e transferir para o alvo bem. Esta parte representa a proporção de divisão (por exemplo, 1/8 da cultura podem ser transferidos para um rácio de 1:8.)
   12. Passagem a cada 3-4 dias. Permitir que as linhas de iPSC amadurecer-se pelo cultivo-os pelo menos 15 passagens antes de usá-los em experimentos a jusante

3. caracterização e confirmação de pluripotência

Nota: Consulte os arquivos complementares para obter detalhes sobre citometria de fluxo e microscopia confocal.

1. Ensaio de formação de teratoma
   1. Para determinar a capacidade de iPSC de se diferenciarem em tecidos representativos de todas as três camadas germinativas, por ensaio de formação de teratoma, siga as políticas institucionais sobre cuidados com animais e uso, em frente a planear um prazo para a apresentação do protocolo apropriado documentos. A formação de teratoma em ratos leva entre 6-10 semanas.
   2. Cultura 4 poços de uma placa de 6 por linha de iPSC por 4 dias. O número aproximado de células injetadas em um flanco de um rato é de 0,5 a 1 x 10⁶ células. Opcional: um extra bem pode ser dedicado para determinar um número representativo de célula em um poço por meio de dissociação unicelulares com uma enzima de desprendimento de célula e a contar.
   3. Calcular o volume da mistura E8/BMM as touceiras de iPSC serão suspenso em: ambos os flancos do mouse são injetados, cada um com 150 µ l de suspensão de moita. Três ratos são suficientes para testar a formação de teratoma de uma linha de iPSC. Incluem um extra de 150 µ l por agulha no volume resultante para compensar a perda de volume morto. 1 agulha por rato é usada. O volume total é, portanto, 3 * (150 µ l * 2 + 150 µ l) = µ l 1350
   4. Parcialmente dissocia as colônias de iPSC com EDTA como se fossem para ser passadas, conforme descrito nas etapas 2.7.8 para 2.7.10. É importante que as colônias ser dissociadas em aglomerados e não separadas em células únicas.
   5. Lavar fora das colônias de iPSC com 675 µ l de meio E8 (metade do volume calculado da etapa 3.3.3), usando uma dica de largo diâmetro. Transferi a suspensão de moita em um tubo de poliestireno de 5 mL. Coloque no gelo.
   6. Combine com 675 µ l de BMM. Manter a suspensão resultante no gelo até a injeção.
   7. Anestesiar os ratos para imobilizá-los usando o isoflurano. Isto deve ser realizado ou guiado por pessoal qualificado do viveiro.
   8. Vórtice o poliestireno 5ml tubo brevemente e aspire a suspensão de moita (450 µ l por rato) para seringa de um insulina equipado com uma agulha de 22g. 150 µ l de suspensão de célula Injecte por via subcutânea. Este volume contém aproximadamente 1 x 10⁶ células (ver passo 3.1.2).
   9. Injecte 3 ratos por linha de iPSC. Segui a prática de cuidados de animais adequados para todos os procedimentos.
   10. Monitore a saúde dos ratos diariamente.
   11. Quando os teratomas alcançar um diâmetro de ponto de extremidade de 1,5 a 2 cm, eutanásia nos ratos, explantes os teratomas e armazená-los em solução de formalina para fixação de tecido por 24 h.
   12. Trazer os teratomas fixos para uma instalação de núcleo de histologia para hematoxilina eosina (H & E) coloração. Uma patologista vai nota a presença de tecidos de todas as três camadas germinativas.
       Nota para cariótipo: Live iPSC culturas devem ser enviadas para especializada citogenéticos laboratórios para testes da integridade do cariótipo. É recomendável que este teste ser realizado cada 5 passagens.
2. Perfil transcricional
   1. Cultura 2 poços de uma placa de 6 por 3-4 dias para obter uma amostra de RNA. Utilize apenas culturas de alta qualidade, menor contaminação com diferenciação de células pode ser tratada por raspagem-los usando uma ponta da pipeta.
   2. Isole o RNA de culturas de iPSC usando um kit disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante. Enviamos amostras para uma instalação de núcleo especializado de genômica.
   3. Obter os perfis transcriptional globais das linhas de iPSC usando microarrays (ver Tabela de materiais para as opções com suporte) ou sequenciação do ARN.
   4. Envie arquivos de "*.idat" para avaliação de bioinformatic de pluripotência através de uma interface on-line no Instituto Coriell. Alternativamente, apresentar "*. cel" arquivos para identificação de bioinformatic tipo de células, incluindo células-tronco pluripotentes, através de uma interface on-line na Universidade Johns Hopkins. Consulte Tabela de materiais para obter detalhes sobre os tipos de dados, os ensaios individuais bioinformatic aceitam.

Resultados

Consentimento informado por escrito de pacientes foi obtido antes da colheita de líquido amniótico para fins de teste genético e dedicando uma pequena alíquota do líquido para pesquisa. Sem consentimento é necessário para o uso da membrana amniótica na pesquisa como a placenta representa resíduos médicos. Células-tronco de líquido e membrana amnióticos exibir propriedades típicas de mesenquimais, morfologicamente suas células são fusiformes e fase-brilhante. Após reprogramação, as células...

Discussão

A fase inicial de geração de iPSC de células estaminais fetais implica a extração de células de origem de tecidos fetais, sua cultura, expansão e introdução dos Plasmideos reprogramação epissomal. Esta fase é seguida de um período de cultura de cerca de 14-18 dias antes das primeiras colônias totalmente reprogramadas podem ser expandidas. A fase final é a maturação dos clones iPSC. A extração inicial de células-tronco membrana amniótica é conseguida por meio de uma digestão mecânica e enzimática combinada do âmnio. Nós a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Dissociação de Tumor, humano	Miltenyi Biotec	130-095-929	sistema de dissociação de tecido, kit de reagentes, inclui tubos de dissociação de tecido e enzimas de dissociação de tecido
gentleMACS Dissociador	Miltenyi Biotec	130-093-235	sistema de dissociação de tecido, dissociador
Thermo Scientific™ Shandon™ Bisturi Descartável No. 10, Estéril, Embalado Individualmente, 5.75 (14.6cm)	Thermo-Fisher	3120032
70 µ filtros de célula m	Corning	10054-456
RPMI 1640 médio	Thermo-Fisher	32404014
plataforma de balanço	VWR	40000-300
Tubos de centrífuga de 50 ml	Thermo-Fisher	339652
15 ml	Thermo-Fisher	339650
EBM-2 meio basal	Lonza	CC-3156	meio basal para meio AFMC
FGF 2 Humano (expresso em E. coli, não glicosilado)	Prospec Bio	CYT-218	bFGF, suplemento para AFMC medium
EGF Human, Pichia	Prospec Bio	CYT-332	EGF, suplemento para meio AFMC
LR3 Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-1 Recombinante Humano	Prospec Bio	CYT-022	IGF, suplemento para AFMC médio
Soro Fetal Bovino, qualificado para células-tronco embrionárias	Thermo-Fisher	10439024	FBS
Antimycotic (100X)	Thermo-Fisher	15240062	para AFSC / AMSC primário, para AFSC / AMSC de rotina não deve ser necessário, não use em meio para células transfectadas!
Solução de desprendimento celular Accutase	StemCell Technologies	07920	enzima de desprendimento celular
CryoStor™ CS10	StemCell Technologies	07930	meio de congelamento completo
PBS, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	10010023
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	para isolamento de plasmídeo
pEP4 E02S EN2K	Addgene	20925	EN2K, fatores de reprogramação Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K	Addgene	20927	ET2K, fatores de reprogramação Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L	Addgene	20926	M2L, fatores de reprogramação c-Myc+LIN28
Espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop 2000c	Thermo-Fisher	ND-2000C	espectrofotômetro
Neon® Sistema de transfecção Sistema de transfecção	Thermo-Fisher	MPK5000	componentes: Pipeta Neon - pipeta de transfecção Dispositivo Neon - dispositivo de transfecção
Neon® Sistema de Transfecção 10 µ Kit L	Kit de consumíveis Thermo-Fisher	MPK1025	para o Sistema de Transfecção de Néon, contém: Ponta de néon - ponta de transfecção Tubo de néon - tubo de transfecção R - tampão de ressuspensão E - tampão eletrolítico
Stemolecule™ Butirato de Sódio	StemGent	04-0005	potenciador de moléculas pequenas de reprogramação
TeSR-E8	StemCell Technologies	05940	E8
Vitronectina XF™	StemCell Technologies	07180	VTN, concentração de estoque 250 µ g/ml, usado para revestimento a 1 µ g/cm2 em tampão de diluição de vitronectina (CellAdhere)
CellAdhere™ Tampão de diluição	StemCell Technologies	07183	tampão de diluição de vitronectina
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo-Fisher	15575020	diluir com PBS a 0.5 mM antes de usar
EVOS® Sistema de Imagem FL	Thermo-Fisher Scientific	AMF4300	Sistema de microscópio de imagem LCD
CKX53 Microscópio Invertido	Microscópio de cultura de células de contraste de fase	Olympus
Pierce™ 16% Formaldeído (w/v), Livre de metanol	Thermo-Fisher	28908	diluir a 4% com PBS antes de usar, diluído pode ser armazenado a 2-8 ° C por 1 semana
Tampão de permeabilização Perm III	BD Biosciences	558050	, resfrie a -20 ° C antes de usar
Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	557782	controle de isotipo para Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	557783	controle de isotipo para Sox2
Mouse anti-humano Oct3/4 (Isoforma Humana A), Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	561628
Mouse anti-humano Nanog, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	560791
Mouse anti-humano Sox-2, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	562139
IgGM de camundongo, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	401617	controle de isotipo para TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	401618	controle de isotipo para TRA-1-81
Mouse anti-humano TRA-1-60, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	330613
Mouse anti-humano TRA-1-81, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	330705
Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	400129	controle de isotipo para SSEA-1
Mouse IgG3, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	401321	controle de isotipo para SSEA-4
Camundongo anti-humano SSEA-1, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	323010
Camundongo anti-humano SSEA-4, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	330407
Affinipure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-camundongo IgG+IgM, Alexa Fluor® 488	Jackson Immunoresearch	115-606-068	use a uma diluição de 1:600 ou otimize ainda mais
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647	Jackson Immunoresearch	115-546-068	use a uma diluição de 1:600 ou otimize ainda mais
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D21490	solução estoque 10 mM, dilua ainda mais para 1:12.000 para uma solução de trabalho
Corning® Matrigel® Fator de crescimento reduzido,	camundongos corning	356231	matriz de membrana basal (BMM)
scid-bege, fêmeas	Taconic	CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)	Qiagen	74134	kit de isolamento de RNA
Frascos T-25,	Thermo-Fisher	156367
T-75 tratados com cultura de tecidos, Thermo-Fisher tratados com cultura de tecidos
Prato de cultura de tecidos Nunc™	Thermo-Fisher	12-567-650	Placa de cultura de tecidos de 10 cm
Placas de 6 poços, tratadas com cultura de tecidos	Câmara de contagem Thermo-Fisher	140675
Neubauer (hemacitômetro)	VWR	15170-173
Mr. Frosty™ Recipiente de Congelamento	Thermo-Fisher	5100-0001	recipiente de congelamento
Tubos FACS, Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo,	Tubos de	352058	5 ml Tubos
Eppendorf, 1.5 ml	Thermo-Fisher	05-402-96	Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml
Tubos de PCR, 200 µ l	Pontas de pipeta Thermo-Fisher	14-222-262
, 100 a 1250 µ l	Thermo-Fisher	02-707-407	pontas estreitas de 1 mL ponteiras
de pipeta, 5 a 300 µ l	Thermo-Fisher	02-707-410
, 0.1 a 10 µ l	Thermo-Fisher	02-707-437
pontas de pipeta de diâmetro largo, 1000 µ l	VWR	89049-166	com pontas de 1 mL de diâmetro largo
	Thermo-Fisher	13-678-20A
etanol, misturador	de vórtice Thermo-Fisher	04-355-451
VWR		10153-842
lamínula com câmara, vidro borossilicato de 8 poços, 1,5 mm	Thermo-Fisher	155409	utensílios de cultura de grau confocal com fundo de vidro
VWR	82002-366		agulhas 22G
	Thermo-Fisher	22-253-260
Solução de formalina, tamponada neutra, fixação de 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	de teratomas explantados
Microarray de expressão Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip	Illumina	BD-103-0204	, suportado por PluriTest, descontinuado pelo fabricante
Placa de matriz do genoma humano PrimeView U219	de expressão de 901605	Thermo-Fisher	(anteriormente marca Affymetrix), em breve será suportado pelo PluriTest
GeneChip™ Genoma Humano U133 Plus 2.0 Array	Thermo-Fisher	902482	microarray de expressão (anteriormente marca Affymetrix), suportado pela CellNet, em breve será suportado pelo PluriTest
PluriTest®	O Coriell Institute		www.pluritest.org, serviço gratuito de avaliação bioinformática da pluripotência, aceita dados de microarray - arquivos *.idat da plataforma HT-12 v4, em breve suportará dados de microarray U133, U219 e sequenciamento de RNA
CellNet	Johns Hopkins University		cellnet.hms.harvard.edu, serviço gratuito para identificação bioinformática do tipo de célula, incluindo células-tronco plutitentes, com base em dados de microarray U133 - arquivos *.cel, em breve suportarão RNA dados de sequenciamento