Artigo de método

Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina

DOI:

10.3791/56013

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6 de julho de 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo baseado em filtração para isolar núcleos de alta qualidade do músculo esquelético do mouse reticulado em que removemos a necessidade de ultracentrifugação, tornando-o facilmente aplicável. Mostramos que a cromatina preparada a partir dos núcleos é adequada para a imunoprecipitação com cromatina e prováveis ​​estudos de sequenciação de imunoprecipitação com cromatina.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é um método poderoso para determinar a ligação da proteína ao DNA da cromatina. O músculo esquelético rico em fibra, no entanto, tem sido um desafio para ChIP devido a dificuldade técnica em isolamento de núcleos de alta qualidade com mínima contaminação de miofibrilas. Protocolos anteriores tentaram purificar núcleos antes da reticulação, o que incorre no risco de alteração da interação DNA-proteína durante o processo de preparação de núcleos prolongados. No protocolo atual, primeiro cruzamos o tecido do músculo esquelético coletado de camundongos e os tecidos foram picados e sonicados. Uma vez que descobrimos que a ultracentrifugação não foi capaz de separar núcleos de miofibrilos usando tecido muscular reticulado, elaboramos um procedimento de filtração seqüencial para obter núcleos de alta qualidade desprovidos de contaminação significativa por miofibrilas. Posteriormente, preparamos a cromatina usando um ultra-som, e os ensaios ChIP com anticorpo anti-BMAL1 revelaram uma ligação circadiana robustaPadrão de BMAL1 para direcionar os promotores de genes. Este protocolo de filtração constitui um método facilmente aplicável para isolar núcleos de alta qualidade do tecido do músculo esquelético reticulado, permitindo um processamento de amostra consistente para estudos circadianos e outros estudos sensíveis ao tempo. Em combinação com sequenciação de próxima geração (NGS), nosso método pode ser implantado para vários estudos mecanicistas e genômicos com foco na função do músculo esquelético.

Introdução

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O músculo esquelético desempenha papéis importantes na fisiologia e no comportamento. A fibra muscular multi-nucleada consiste em miofibrilas onde a actina e a miosina formam unidades funcionais chamadas sarcomeres para gerar força contrátil. O músculo esquelético é também o maior órgão metabólico do corpo, representando> 80% de glicose pós-prandial e regulando a resposta da insulina e a homeostase metabólica 1 , 2 . A fisiologia muscular e o metabolismo são rigorosamente regulados pelo relógio circadiano, um temporizador biológico intrínseco 3 , 4 , 5 , 6 . Por exemplo, a deleção específica de músculo esquelético de Bmal1 , um dos componentes do relógio circadiano central, resultou em resistência à insulina e diminuição da captação de glicose no músculo esquelético, e os animais desenvolveram diabetes tipo 2 7 . EuAlém disso, o músculo esquelético também é cada vez mais apreciado como um órgão endócrino 8 , secretando as mioquinas para regular o metabolismo sistêmico e a fisiologia. Estudos mecânicos são necessários para entender completamente essas funções reguladoras no músculo esquelético.

O ChIP é uma abordagem poderosa para delinear o recrutamento do promotor de proteínas de ligação ao DNA. O ChIP foi inicialmente desenvolvido para identificar a organização dos nucleossomas no DNA da cromatina 9 , 10 . Desde então, uma variedade de métodos foram relatados para reticular proteínas e DNA de cromatina usando formaldeído, sulfato de dimetilo ou irradiação ultravioleta (UV) 11 , 12 . A reticulação do formaldeído é a mais utilizada, preservando a estrutura da cromatina e as interações DNA-proteína 9 , 13 , 14 . Cromatografia cruzadaIn é cortado por sonicação e imunoprecipitado com anticorpo contra a proteína de ligação de DNA particular 15 , 16 . Nos últimos anos, a sequenciação de ChIP (ChIP-seq), um método que combina ChIP com NGS, foi desenvolvido para interrogar a ligação ao fator de transcrição do genoma 17 e, em alguns casos, monitorar mudanças dinâmicas ao longo de um curso de tempo 18 , 19 , 20 . Por exemplo, os estudos circadianos de ChIP-seq revelaram uma sequência altamente orquestrada de ligação genômica de componentes do relógio circadiano e marcadores de histonas, o que impulsiona a expressão de genes temporalmente precisa ao longo do ciclo circadiano de aproximadamente 24 h 18 .

A maioria dos protocolos ChIP disponíveis são projetados para tecidos moles ( por exemplo , fígado, cérebro, etc. ), e muito poucos foram publicados para tecidos duros, incluindo esqueletoMuscular. É tecnicamente desafiador homogeneizar o músculo esquelético rico em fibras e isolar núcleos de alta qualidade 21 , especialmente para experiências ChIP que requerem reticulação. Em um recente estudo muscular ChIP 22 , as células satélites foram separadas das miofibras e os núcleos foram preparados a partir de ambos os tipos de células através de um procedimento prolongado envolvendo digestão tecidual. Todo o processo demorou aproximadamente três horas para completar antes que a reticulação de formaldeído fosse realizada em núcleos isolados. Embora este procedimento tenha evitado a fibra muscular de reticulação, o que torna o tecido muscular ainda mais refratário a uma homogeneização eficiente e foi capaz de produzir núcleos de alta qualidade, o tempo significativo de retirada de tecido para reticulação de núcleos incorre o risco de DNA alterado - interação protéica. Em contraste, a maioria dos estudos realizou reticulação imediatamente após o tratamento experimental ou a coleta de tecido para preservar o DNA-protei em tempo realN vinculativo 12 . Uma segunda desvantagem do isolamento de núcleos antes da reticulação é que ele impede aplicações sensíveis ao tempo, como a coleta de amostras circadianas, que normalmente ocorre em intervalos de 3 a 4 h. Sem reticular os núcleos, o isolamento precisa prosseguir imediatamente após a dissecção, enquanto que as amostras reticuladas podem ser processadas juntas após completar o curso inteiro, garantindo assim uma maior consistência experimental.

Outros protocolos para o isolamento de núcleos de músculo esquelético não reticulado também foram relatados. Dois estudos descreveram o uso de ultracentrifugação em gradiente para separar núcleos de miofibrilos e detritos celulares 23 , 24 . Enquanto a sacarose ou a ultracentrifugação de gradiente coloidal é eficaz com tecidos musculares não cruzados, nossas experiências revelaram que após a reticulação, a ultracentrifugação em gradiente não conseguiu separar os núcleos da célula dEbris no gradiente.

Por isso, desenvolvemos um procedimento para isolar núcleos de alta qualidade usando tecidos de músculo esquelético de rato reticulado. Ao invés de ultracentrifugação em gradiente, inventamos um método de filtração em série para separar separadamente núcleos de detritos. Após a ultra-sonografia, as amostras de cromatina foram aplicadas com sucesso para estudos de ChIP, que mostraram um padrão circadiano de ligação da proteína BMAL1 aos promotores alvo. Nosso método pode ser amplamente aplicável a vários estudos mecanicistas de tecidos musculares.

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Protocolo

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O cuidado de animais foi realizado sob as diretrizes do Comité de Uso Institucional de Animais (IACUC) e os procedimentos foram conduzidos de acordo com um protocolo animal aprovado pelo Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Houston.

1. Isolamento de núcleos do músculo esquelético reticulado

  1. Pesar e minar o músculo esquelético dos membros posteriores, isolado de ratos machos C57BL / 6 de aproximadamente 20 semanas de idade, em solução salina tamponada com fosfato (PBS), como descrito em detalhes anteriormente 22 .
    NOTA: Geralmente, obtemos 1,0 a 1,5 g de músculo esquelético de um mouse.
    1. Coloque o tecido do músculo esquelético moído em um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de PBS em gelo.
  2. Centrifugar a 300 xg a 4 ° C durante 5 min.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante de PBS por aspiração.
  4. Estimar o volume de pelota em cada tubo de 50 mL usando tubos de referência com 1, 2, 3 e 4 mL de água.
  5. Adicione 7 volumes de1% de formaldeído gelado em PBS e homogeneizar as amostras em gelo usando um homogeneizador de tecido de sonda (ver Tabela de Materiais ).
    NOTA: Opcional: o procedimento de homogeneização pode ser realizado em uma sala fria.
  6. Reticular a amostra incubando à temperatura ambiente durante 10 min.
  7. Acrescente a reação de reticulação pela adição de glicina 1 M até uma concentração final de 0,125 M e incube durante 5 min à temperatura ambiente.
  8. Centrifugar as amostras a 3.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante por aspiração.
  9. Enxaguar com 10 mL de tampão de base gelado (HEPES-KOH 10 mM a pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM) contendo inibidores de protease adicionados recentemente (fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF) , E 10 ug / mL de leupeptina). Centrifugar a 3.000 g durante 5 min a 4 ° C e remover cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.
  10. Ressuspender o sedimento em 6 mL de tampão de lise (10 mM de HEPES-KOH em pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton X-100 a 1%) contendo inibidores de protease adicionados recentemente (PMSF 0,2 mM e leupeptina 10 μg / mL).
  11. Transfira a amostra para um homogeneizador pré-arrefecido de 15 mL Dounce e incube durante 10 minutos em gelo. Done homogeneizar cada amostra no gelo com 15 cursos lentos usando pilão solto seguido de 15 golpes com pilão apertado para liberar os núcleos.
  12. Filtre o homogeneizado (6 mL) através de filtro celular (tamanho de poro: 100 μm) e enxágue com 4 mL de tampão de lise. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Ressuspenda-se em 5 mL de tampão de base gelada e densa 10 vezes com pilão apertado para libertar núcleos.
    1. Remova uma alíquota de 20 μL para a medição da concentração de DNA com um espectrofotômetro (OD260 / OD280) e observação microscópica com azul de tripano se necessário (veja abaixo) ( Figura 1 A ).
  13. Filtra a suspensão através deUm filtro de célula (tamanho de poro: 70 μm), enxague o tubo e filtre novamente com 2 mL de tampão de base como acima.
  14. Repita a filtração como no passo 1.13 com filtros de células de tamanho de poro gradualmente reduzido (40 μm, 30 μm, 20 μm e 10 μm).
    NOTA: No total, foram utilizados filtros de 6 tamanhos de poros nos passos 1.12-1.14.
  15. Centrifugar a 1000 g a 4 ° C durante 10 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento em 500 μL de tampão de base.
  16. Medir a concentração de DNA como acima.
    NOTA: Aproximadamente 200 μg de DNA nucleico foram obtidos da combinação de ambos os membros traseiros de um animal. Opcionalmente, salve 20 μL para observação microscópica com coloração com azul de tripano (concentração de estoque 0,4%, diluição 1: 5); Os núcleos vão manchar o azul ( figura 1 B ).
  17. Centrifugar a 1000 g a 4 ° C durante 10 min e descartar o sobrenadante. Armazene o sedimento a -80 ° C.

2. Sonication

  1. Degelo amostras em 500 μL de tampão de lise SDS e ressuspender com pipetagem suave.
  2. Transfira a suspensão de DNA dos núcleos para um frasco de vidro no gelo.
  3. Execute a sonicação com rajadas focadas de energia acústica ultra-sônica a partir de um transdutor em forma de prato. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes do equipamento. Use a seguinte configuração: ciclos por explosão: 200; Intensidade: 5; Ciclo de trabalho: 20; Temperatura 4 - 6 ° C; 30 s ligado / desligado.
    NOTA: Um exemplo para avaliar a eficácia da sonicação é mostrado na Figura 2 .
  4. Transfira a cromatina sonicada para um tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 12.000 xg por 15 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Transferir 50 μL de amostras sonicadas (~ 7 - 10 μg / amostra muscular) para um novo tubo de 1,5 mL para reticulação reversa durante a noite a 65 ° C. Congele as amostras restantes a -80 ° C.

3. Avaliação da Sonicação e Quantificação

  1. Adicionar 1.0ΜL de RNase A (500 U / mL RNase A: 20 000 U / mL RNase T1) para as amostras saneadas de 50 μL salvas e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  2. Adicionar 8 μL de protease K (10 mg / mL) e incubar 30 min a 55 ° C.
  3. Colher o DNA usando um kit de extração de DNA.
    1. Adicione 5 volumes de buffer de ligação, aplique-o na coluna de centrifugação e centrifugue a 4.000 xg, 10 min.
    2. Aplique o pass-through na mesma coluna e centrifugue novamente.
    3. Lavar com tampão de lavagem duas vezes a 13,000 xg, 1 min.
    4. Centrifugue novamente a 13.000 xg, 1 min para secar a coluna.
    5. Adicionar 50 μL de H 2 O e centrifugar a 13,000 xg, 1 min para eluir o DNA.
    6. Aplique o pass-through na mesma coluna e centrifugue novamente.
  4. Quantifique a quantidade de DNA com um espectrofotômetro (OD260 / OD280). Execute amostras em 0,8% de géis para avaliar o tamanho e quantidade (1 μg) dos produtos sonicados ( Figura 2 ).
    NOTA: O rendimento médio da cromatina é de aproximadamente ~ 20%.

4. ChIP

  1. Destilar a cromatina previamente guardada a -80 ° C e alíquota da cromatina a ~ 100 - 120 μg por tubo. Diluir 1:10 com tampão de teste de radioimunoprecipitação (RIPA) (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, cofre inibidor de protease 1x (PIC), 0,1% Na-desoxicolato ( P / v), 1% Triton X-100).
    1. Se houver múltiplas amostras em cada grupo, combine quantidades iguais de DNA de cromatina com a quantidade final de ~ 100 - 120 μg / amostra. Economize 10% como entrada.
  2. Adicionar 40 μL (suspensão a 50% v / v no tampão RIPA) de blocos de agarose Protein A / G pré-bloqueados com BSA (~ 2 h, 4 ° C) (anticorpo não-Frango) ou IgY (anticorpo de frango) e incubar em Um rotador durante 3 h a 4 ° C.
  3. Centrifugar a 1000 xg, 10 min e transferir cuidadosamente o sobrenadante para tubos novos.
  4. Adicionar anticorpos a 1 μg de anticorpo por ~25 - 100 μg de ADN de cromatina.
  5. Gire suavemente a 4 ° C durante a noite a aproximadamente 15 rpm.
  6. Adicione 10 μL de anticorpo de proteína A / G pré-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) pré-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) ou IgY (anticorpo de frango) e gire na sala fria durante 2 h.
  7. Lave os grânulos da seguinte forma. Lavar com 1 mL de tampão RIPA durante 3 min duas vezes, lavar com 1 mL de tampão salino alto (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 a 1%) durante 3 min duas vezes , Lavar com 1 mL de tampão LiCl (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), LiCl 250 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Na-desoxicolato a 1%, NP40 a 0,5%) durante 3 minutos duas vezes.
    1. Lavar com 1 mL de tampão Tris-EDTA (TE) (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM por 3 minutos uma vez. Em seguida, eluir DNA com tampão de eluição (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM e SDS a 0,5%).
  8. Centrifugar a 1.000 g, 1 min e remover cuidadosamente o sobrenadante.
  9. Ressuspender o talão com 50 μL de tampão de eluição.
  10. Incube por 10Min a 65 ° C.
  11. Centrifugar a 12,000 g por 5 min.
  12. Transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione mais 50 μL e centrifugue novamente a 12.000 g durante 5 min. O volume final de eluição será de 100 μL.
  13. Reticulação reversa e eluição de DNA.
    1. Incubar a cromatina eluída durante a noite a 65 ° C.
    2. Adicionar 1,0 μL de RNase A e incubar durante 30 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 8 μL de protease K (10 mg / mL) e incubar 30 min a 55 ° C.
    4. Colhe o DNA usando um kit de limpeza de PCR com volume de eluição a 50 μL de acordo com o protocolo do fabricante.
  14. Analise os perfis por qPCR em tempo real como descrito anteriormente 25 , 26 .
    NOTA: As sequências do iniciador estão listadas na Figura 3 Legend . Os dados são apresentados como média ± SEM ( Figura 3 ).

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Resultados

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Aqui realizamos reticulação de formaldeído imediatamente após a coleta de tecidos para preservar a interação DNA-proteína em tempo real. Contudo, descobrimos que a sacarose ou gradiente coloidal, comumente usado para o isolamento de núcleos 23 , 24 , não era eficaz na separação de núcleos de miofibrilas (dados não mostrados). A razão pode ser que a reticulação conferiu gravidade semelhante aos núcleos e miofibrilas. Portanto, des...

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Discussão

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Aqui descrevemos um método robusto onde os tecidos do músculo esquelético reticulado foram usados ​​para isolar núcleos de alta qualidade. A filtração sequencial foi realizada para efetivamente separar os núcleos dos detritos, e a energia acústica ultra-sônica do transdutor em forma de prato cortou a cromatina para análise de ChIP. Os resultados mostraram a ligação circadiana específica do tempo de BMAL1 aos promotores alvo.

O ChIP pode ser empregado para capturar a ocupação de proteína em t...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos Karyn Esser, Nobuya Koike e Noheon Park por conselhos úteis. Este trabalho foi parcialmente suportado por NIH / NIGMS (R01GM114424) para S.-HY, e a Fundação Robert A. Welch (AU-1731) e NIH / NIA (R01AG045828) para ZC

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
Solução de formaldeídoSigma AldrichF8775 
GlicinaFisher ScientificBP381-5
Solução de azul de tripano (0,4%)Fisher Scientific15250061
RNase ASigma Aldrich10109142001
Protease KSigma Aldrich3115887001
Frango Anti-BMAL1 anticorpoGerado em frango (Cocalico Biologicals) contra o antígeno aa 318 - 579, e IgY foi purificada por afinidade usando o mesmo antígeno.
Resina Precipitante IgY para GalinhasGenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  Homogeneizador de Bancada Polytron PT2100Fisher Scientific08-451-178
15 mL Moedor de Tecidos DounceWhearton357544
Filtros de Células Falcon 100 µ mFisher Scientific08-771-19
Filtros de Células Falcon 70 µ mFisher Scientific08-771-1
Filtros de Células Falcon 40 µ mFisher Scientific08-771-2
pluriStrainer 30 µ mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 µ mPluriSelect43-50020-03
pluriFiltro 10 µ mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Ultrasonicator Focado-ultrassônicoCovarisModelo S2
Labquake Câmerade
Scientific  Leica MicrosystemsDFC3000 Kit
Reagent
DNA kitde extração Thermo ScientificK0691
Buffers
Todos os componentes do tampão são descritos no protocolo. Cada componente foi comprado da Sigma Aldrich
microscópio CCD C415110 da Thermo de reagentes G

Referências

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