Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.
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Artigo de método
Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de eletroconvulsoterapia, o tratamento mais eficaz para a depressão severa. ECS induz convulsões tônico-clônica generalizadas com baixa mortalidade e morte neuronal e é um modelo utilizado para droga anti-epiléptica de tela. Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em que uma corrente de 55-mA breve é entregue para 0,5 s para macho ratos 200-250 g de peso através de eletrodos de orelha-clip. Tal estimulação bilateral produzida estágio 4-5 convulsões Clônicas que durou cerca de 10 s. Após a cessação da ECS aguda ou crônica, a maioria dos ratos recuperados para ser comportamentalmente indistinguível de sham a ratos "nenhuma apreensão". Porque ECS globalmente eleva a atividade cerebral, ele também serviu para examinar alterações de atividade-dependente de proteínas sinápticas e seus efeitos na força sináptica, usando vários métodos. Em particular, fraccionamento subcelular da densidade pós-sináptica (PSD) em combinação com mancha ocidental permite a determinação quantitativa da abundância de proteínas sinápticas nesta estrutura sináptica especializada. Em contraste com um método de fracionamento anterior que exige grande quantidade de cérebros de roedores, descrevemos aqui um método de fracionamento de pequena escala para isolar o PSD do hipocampo de rato único, sem centrifugação gradiente de sacarose. Usando esse método, mostramos que a fração isolada do PSD contém proteínas de membrana pós-sináptica, incluindo PSD95, GluN2B e GluA2. Sinaptofisina marcador pré-sináptica e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina foram excluídas a fração PSD, demonstrando bem sucedido isolamento do PSD. Além disso, a ECS crônica diminuiu GluN2B expressão no PSD, indicando que o nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala pode ser aplicado para detectar as alterações no hipocampo proteínas PSD de um único rato após tratamentos genéticos, farmacológicos ou mecânicos .
Introdução
Eletroconvulsoterapia tem sido usada para tratar pacientes com distúrbios depressivos major, incluindo depressão severa resistente a medicamentos, depressão bipolar, a doença de Parkinson doenças e esquizofrenia1,2. Esta terapia, convulsão é gerado pelo estímulo eléctrico entregado na cabeça de pacientes anestesiados através de sub-fascial eletrodos1,2,3. Administração repetitiva de ECS tem sido clinicamente benéfica para transtornos depressivos resistentes1,2....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign e cuidado de animais institucionais.
1. manter uma colônia de rato
- Raça de ratos Sprague-Dawley (consulte a Tabela de materiais) e mantê-las em condições normais, com um ciclo de 12 h claro-escuro e ad libitum acesso à comida e água.
- Desmamar os filhotes de rato no dia pós-natal (P) 28 e colocá-los em grupos de 2-4 machos ou fêmeas littermates.
- Marca as caudas dos ratos machos com um marcador preto permanente de tóxicos para identificação.
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Resultados
Usar o procedimento detalhado apresentado aqui, um choque elétrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) entregues via orelha-clip eletrodos induzidos não recorrente estágio 4-5 convulsões tônico-clônicas em ratos (Figura 1A-B). Um total de 8 de ratos recebeu aguda indução ECS e exibido convulsões tônico-clônicas fase 4-5. As convulsões duraram cerca de 10 s e todos os ratos recuperados dentro de 1-2 min de cessação de apreensão. Sham "nenhuma apr.......
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Discussão
Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em ratos que provoca a estimulação global da atividade neuronal em seu hipocampo. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia, que clinicamente é usada para tratar transtornos depressivos refratários de drogas em seres humanos1,2,3. Apesar do uso da terapia electroconvulsive para tratar a depressão grave, o mecanismo preciso subjacente permanece obscuro. Porque ECS induz comporta.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Os autores agradecer Dr. Eric C. Bolton por nos permitir usar sua centrífuga para fracionamento e Dr. Graham H. Diering no laboratório do Dr. Richard L. Huganir Universidade de John Hopkins, nos fornecer o protocolo de pequena escala para o fraccionamento do PSD.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Rato Spargue-Dawley | Charles River Laboratories | ECS fornece | |
| um gerador de pulsos | Ugo Bsile, Comerio, Itália | 57800 | ECS fornece |
| sistema de purificação de água MilliQ | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Sacarose | Em ciência | SX 1075-3 | Suprimentos |
| de fracionamento subcelularNa4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Ácido ocdaico | TOCRIS | 1136 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Inibidor de protease Halt | Thermo Scientific | 78429 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| EMD Millipore Sterito Filtros estéreis de fracionamento a vácuo | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Tesoura de íris | WPI (World Precision Instrumentos) | 500216-G | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Placa de cultura de tecidos de 30 mm | Fisher Scientific | 08-772B | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Homogeneizador de vidro e um pilão de Teflon | VWR | 89026-384 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Centrífuga Sorvall Legend XT/XF | Thermo Fisher | 75004521 | Suprimentos de fracionamento subcelular |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot fornece |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot fornece |
| gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot fornece |
| Running Buffer | Feito no laboratório | Suprimentos de Western blot. | |
| Célula de Eletroforese Vertical Mini-PROTEAN Tetra para Géis MiniPrecast, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot fornece |
| membrana de difluoreto de polivinila (PVDF) | blot | Milipore | IPVH00010 |
| Buffer de Transferência | Feito no laboratório | Suprimentos de Western blot. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Suprimentos de Western blot |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Suprimentos de Western blot |
| Sódio dodecyl sulfato | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Suprimentos de Western blot |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot fornece |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergente para isolamento PSD |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Suprimentos de Western blot |
| Leite seco instantâneo desnatado | Ótimo valor | Suprimentos de Western blot | |
| Multiuso | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot fornece |
| filme de autorradiografia Hyblot CL | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot fornece |
| substrato de quimiofluorescência aprimorado | Thermo Scientific | 32106 | Western blot fornece |
| um processador de filme Konica SRX-101A | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot fornece |
| Nome do Anticorpo | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 ° C, Espécie Hospedeira = Sinalização |
| Sinaptofisina | de | #4329 | Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 &graus; C, Espécie Hospedeira = |
| Alfa-Tubulina | Santacruz | SC-5286 | Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 ° C, Espécie Hospedeira = Camundongo |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 ° C, Espécie hospedeira = Camundongo |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 ° C, Espécie Hospedeira = Coelho |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Diluição do anticorpo = 1:200 - 500, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 &graus; C, Espécie Hospedeira = |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Diluição de anticorpos = 1:2.000-5.000, tempo = 1 h, Temperatura de Reação = RT, Espécie Hospedeira = Burro |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Diluição de anticorpos = 1:2.000-5.000, tempo = 1 h, Temperatura de Reação = RT, Espécie Hospedeira = Burro |
Referências
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al.
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Reimpressões e permissões
