Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.
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Artigo de método
Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hepatectomy parcial é um método versátil e pode ser reproduzido para estudar a regeneração hepática e o efeito da terapêutica de célula com base em várias condições patológicas. Hepatectomy parcial também facilita a enxertia aumentada e proliferação das células transplantadas por neovascularização acelerada e migração de células para o fígado. Aqui, descrevemos um protocolo simples para executar hepatectomy 30% e o transplante de células no baço de um não-obesos diabéticos/grave combinado NOD imunodeficientes. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) rato.
Neste procedimento, são feitas duas pequenas incisões. A primeira incisão é expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado, e outra pequena incisão para expor o baço para o transplante intrasplenic de células. Este procedimento não requer nenhuma habilidade cirúrgica especializada, e pode ser completado em 5-7 minutos com menos estresse e dor, recuperação mais rápida e melhor sobrevivência. Nós demonstramos que o transplante de hepatócitos isolados de uma proteína verde fluorescente (GFP), expressando o rato (transgénico C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), bem como hepatócito como células de origem humana (NeoHep) em parcialmente hepatectomized NOD. Ratos SCID.
Introdução
Atualmente, transplante de hepatócitos é proposto como uma alternativa ao transplante de órgão inteiro para tratar pacientes com distúrbios hepáticos graves. Acredita-se que ele pode ponte pacientes de transplante de órgão inteiro1. Além dos hepatócitos alogênico2, hepatócitos xenogénica3 e hepatócitos derivados de células-tronco4 também estão sendo investigados em modelos animais. Neste contexto, a orientação e enxertia potencial das células transplantadas no receptor é um critério importante para a terapia de célula com base na insuficiência hepática aguda (AHF).
Para investigar o transplante de hepatócitos ou células hepatócito5, AHF é criada em um modelo animal por cirúrgica6 ou procedimentos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Tornar-se um modelo animal de AHF por reagentes farmacológicos, hepatotoxinas muitos como d-galactosamina8, paracetamol9, tetracloreto de carbono10, tioacetamida11, Concanavalina A12, lipopolissacarídeo13 , etc., têm sido utilizados. Desta lista, cada reagente gera um conjunto único de características para AHF, mas infelizmente não reagente único imita as AHF humana. Além disso, a AHF induzida por hepatotoxinas leva um longo tempo, o que coloca os animais sob estresse crônico, e obter resultados reprodutíveis são difíceis de obter.
Por outro lado, o procedimento cirúrgico de hepatectomy parcial (PHx) é dependente de habilidade, e obter resultados reprodutíveis são fáceis de obter depois de desenvolver as habilidades necessárias. Para induzir AHF por intervenção cirúrgica sozinha, ressecção de mais de 70% do fígado é necessária; no entanto, menos do que um hepatectomy 70% ainda pode ser utilizado para estudar a enxertia e proliferação de transplantadas células no fígado para analisar sua capacidade terapêutica durante dano hepático14. O transplante de hepatócitos foram realizados post hepatectomy através do peritônio15, cauda veia16, veia hepática17ou o baço18. Atualmente, infusão de veia hepática e transplante intrasplenic dos hepatócitos são os procedimentos preferenciais, porque são mais fáceis de reproduzir.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento para uma hepatectomy parcial de 30% na NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos em que o lobo esquerdo do fígado é extirpado. Ele é seguido por transplante de hepatócitos de rato (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expressando GFP 0,2 milhões, bem como origem humana NeoHep19 no baço. Este procedimento leva a enxertia das células transplantadas no fígado. Este procedimento é menos invasivo e uma técnica minimamente dolorosa.
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Protocolo
Os procedimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética institucional Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de série de referência da aprovação é IAEC #319/13.
Nota: Existem excelentes recursos em procedimentos de cirurgia geral20 e protocolos específicos para a cirurgia do roedor21. Para aqueles que fazem a cirurgia animal pela primeira vez, é aconselhável extensivamente em prática procedimentos cirúrgicos em bonecos antes de operar em animais.
1. preparação
- Antes do experimento, manter estéril tampão fosfato salino (PBS) ou salino pronto.
- Monte um kit de cirurgia contendo tesouras, pinças serrilhadas, fórceps do tecido, algodão, cotonetes, fios de nylon e porta agulhas micro diferentes. O kit de cirurgia de autoclave. Cuidado especial deve ser tomado se um aceno imunológico comprometido. Rato SCID é incluído no protocolo.
- Executar todo o procedimento experimental, desde a preparação para o fim da cirurgia, da bio-segurança classe I do armário.
- Pese um aceno. Rato SCID de 6-8 semanas antes da cirurgia. Ratos com peso entre 14-18 g são utilizados neste estudo.
- Barba superior central e hipocondríaco região abdominal do mouse com o aparador de cabelo. Aplica o cabelo removendo o creme uniformemente em toda a região com uma espátula para remover completamente os pelos aparados. Remova os pelos suavemente com a ajuda de um pedaço de algodão estéril após 2-5 min.
- Posicione o mouse na câmara de isoflurano e desbloquear a válvula do cilindro de oxigênio. Manter o fluxo de oxigênio à taxa de 4 L/min e a vaporização de isoflurano em 4% para induzir anestesia.
- Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado corretamente beliscando suave do dedo do pé.
- Coloque uma placa de cirurgia dentro uma biossegurança do armário. Coloque o animal no quadro de cirurgia, tal que a porção ventral do mouse é voltada para cima e a porção anterior do rato é colocada dentro do cone de nariz ligado à alimentação de isoflurano e oxigênio.
- Reduzir a vaporização de isoflurano para 2% e mantê-lo durante todo o procedimento cirúrgico.
- Desinfectar a pele do rato e esterilize-limpando com algodão estéril embebida de etanol a 70%.
2. ato cirúrgico
-
Hepatectomy parcial
- Fazer uma incisão transversa de cerca de 1 cm na pele logo abaixo do esterno, perpendicular ao processo xifoide e paralelo da caixa torácica, com a ajuda de uma tesoura reta de funcionamento.
- Separe suavemente a pele anexada com a camada muscular abdominal nas imediações da zona da incisão com pinça ou dicas de algodão umedecido estéril para distinguir entre a pele e a camada muscular abdominal. Molhe a região intradérmica com PBS usando dicas de algodão estéril para evitar a dessecação.
- Expor a área do lobo esquerdo suavemente, fazendo uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do xifoide. Use duas dicas de algodão umedecido para expor e levantar o lobo esquerdo do fígado.
- Coloque uma das pontas do algodão do lado abdominal do corte e coloque a outra ponta de algodão do lado do diafragma. Delicadamente pressione a ponta colocada para o diafragma e dar um empurrão deslizando pela outra ponta para levantar o lobo esquerdo do fígado.
- Passar um fio de nylon com um loop através do lóbulo esquerdo levantado e deslize o loop em direção à base do lobo esquerdo perto do hilo, com a ajuda das dicas de microfórceps ou algodão. Empurre para baixo o loop de fio de nylon na base do lobo esquerdo.
- Amarre duas extremidades do fio de nylon por cima do lobo esquerdo usando um porta-agulha microcirurgia e o micro fórceps. Faça dois nós adicionais do outro lado.
- Disse para fora o lóbulo amarrado com a ajuda de uma tesoura. Não tente cortar muito perto o thread. No caso do procedimento dura mais de 5 min, mantenha a cavidade peritoneal e órgãos úmido com PBS estéril para evitar a desidratação devido à perda de líquidos.
- Costure o peritônio por sutura contínua usando uma sutura de Catgut 4-0. Subsequentemente, feche a pele por sutura descontínuos tão rapidamente quanto possível.
-
Transplante de células
Nota: Os hepatócitos expressando GFP foram isolados de ratos transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), de acordo com o procedimento descrito por Lee et al. 22 e Shen et al. 23 hepatócitos células (NeoHep) de origem humana diferenciada de monócitos24 também foram utilizadas para transplante. No entanto, as células derivadas de outras fontes podem também ser utilizadas no protocolo.- Suspenda a 0,2 milhões de células viáveis em cerca de 50 µ l de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) e Aspire-lo em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G. Não deixar a seringa, colocando-o no gelo.
- Coloque o mouse em uma forma que a parte lateral esquerda enfrenta até em direção a pessoa que realizar a cirurgia. Identificar a área esplênica e transversalmente dissecar a pele perto da região hipocondríaca, seguida por uma incisão pequena através da camada peritoneal apenas para expor o baço.
- Delicadamente Levante o baço e mantenha que fora da cavidade com a ajuda de dois PBS umedecido com pontas de algodão.
- Segure o baço cuidadosamente com duas pontas de algodão com uma mão e coloque a agulha da seringa exatamente vertical para o baço. Delicadamente, perfuram o baço e empurra a agulha muito lentamente por dentro; a agulha não deve ter mais que 2 mm.
- Empurre o êmbolo da seringa lentamente para injetar as células no baço. Após transplante, manter a agulha da seringa estável e retire lentamente o baço para evitar sangramento ou perda de células.
- Depois de colocar o baço volta para a cavidade peritoneal com as pontas de algodão, feche a camada peritoneal por sutura contínua com uma sutura de Catgut 4-0. Costure a pele descontinuamente com a sutura do mesma. Evite usar clipes de ferida para o fechamento da pele; em vez disso, feche-a uma sutura de 4-0. Os clipes de ferida restringem o movimento natural do mouse, e muitas vezes clipes afrouxar-se e sair rapidamente.
3. no pós-operatório cuidados
- Depois de fechar a pele, limpe os arredores de ambos os sites de sutura com solução de iodo (betadine) usando uma ponta de algodão estéril.
- Injetar uma dose de antibiótica cefotaxima como 600 mg/kg de peso (tipicamente 12 mg cefotaxima em 100 µ l de solução salina/rato) de corpo intraperitonealmente com uma seringa de 1 mL.
- Dar doses diárias de analgésico Meloxicam como 1 mg/kg peso corporal (tipicamente 12 µ g Meloxicam em 100 µ l de solução salina/rato) ao animal intraperitonealmente, por até três dias após a cirurgia.
- Após a conclusão da cirurgia, interromper o fluxo de gás de isoflurano e posicione o mouse de volta na gaiola ventilada individualmente.
4. eutanásia e caracterizações
- Após os pontos experimentais (1 dia e 10 dias pós cirurgia), eutanásia os ratos de acordo com as orientações institucionais de ética animal.
- Colete sangue por terminal sangria dos animais, puncionando o plexo terminal ocular.
- Isole o soro do sangue.
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Resultados
Proliferação hepatocyte após hepatectomy parcial de 30%: A proliferação dos hepatócitos nos restantes fígada após 30% hepatectomy foi examinada por imuno-histoquímica (IHC) mancha para um marcador de proliferação celular, Ki-67. Post um dia hepatectomy, os ratos foram sacrificados, os lóbulos de fígado restantes foram extirpados e cortes de parafina foram obtidos. As seções foram coradas com anticorpo Ki-67, seguido de rotulagem com anticorpo secundário conjugado de horseradish peroxidase (HRP). Di-Amino...
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Discussão
Hepatectomy parcial é uma técnica estabelecida para investigar regeneração hepática e hepatectomy excessiva é relatado para imitar o modelo de AHF. Entre modelos animais de AHF, roedores, sobretudo ratos, são o modelo mais pesquisado. Para obter um modelo de lesão hepática em ratos, até um 70% hepatectomy tem sido relatado com uma taxa de sobrevivência bom25,26. No entanto em nude e outro rato imunodeficientes, um hepatectomy 70% foi relatado como fatal e animais...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela subvenção núcleo recebida do departamento de biotecnologia, governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. Endereço atual do Dr. Bhattacharjee é a divisão de Gastroenterologia, Hepatologia e nutrição, Hospital Los Angeles das crianças.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de Anestesia a Gás | Ugo Basile; Itália | 211000 | |
| Máquina de pesagem | Goldtech ; Gabinete | compras locais | |
| (Classe I) | Kartos internacional; Aparador | de compras locais | |
| , Panasonic; Japão | ER-GY10 | ||
| Tesoura de operação reta com lâminas afiadas / afiadas | Major Surgicals; | de Compras Locais | |
| com Serrilhas | Principais Cirúrgicas; Compras locais da Índia | ||
| Porta-agulhas micro reto e curvo | Mércia; Inglaterra | BS-13-8 | |
| Seringa de insulina de 1 ml com 30G *5/16 agulhas | Dispo Van; Índia | ||
| Seringa de 1 ml com 26 G * 1/2 agulha | BD; EUA | REF 303060 | |
| Fios de Nylon | poderoso; Índia | (1-0) Aquisição Local | |
| MERSUTURES 4-0 Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada | Ethicon, Johnson & Johnson, Índia | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 sutura cirúrgica absorvível | Suturas Índia Pvt. Ltd; Índia | SN 5048 | Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada Catgut Cotonetes Puros |
| Cotonetes Pvt Ltd; Fita | Compras Locais | ||
| 3M Índia ; Índia | 1530-1 | Micropore Surgical Tape Microtome | |
| Histo-Line Laboratories, Itália | MRS3500 | ||
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; Microscópio | ||
| Carl Zeiss; Alemanha | LSM 510 META | ||
| Microscópio de Campo Brilhante | Olympus, Japão | LX51 | |
| Analisador automatizado | Tulip, Alto Santracruz, Índia | Screen Maaster 3000 | Analisador bioquímico para teste funcional hepático |
| Citômetro de fluxo | BD ; EUA | BD FACSverse | Avaliação da presença de células pós-transplante |
| Creme de depilação Veet | Reckitt Benckiser, Índia | ||
| FORANE | Abbott; Isoflurano dos EUA | USP 99,9% | |
| Taxim | AlKem; Injeção de | cefotaxima sódica | |
| Solução de iodo-povidona | Vitória-Medicare; Índia | Betadine | |
| Paraformaldeído | Himedia; Índia | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher científico; US | 12200-036 | |
| Sacarose | Sigma; US | S0389 | |
| Tecido-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T composto |
| DAPI | Himedia; Índia | MB 097 | |
| anti-albumina de cabra Polyclonal | Thermo Scientific, Pierce, US | PA126081 | |
| anti-conexina 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP coelho policlonal | biotecnologia Santa Cruz; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-cabra | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 frango anti coelho | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A21442 | |
| Cabra anti coelho IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; EUA | 65-6120 | |
| anticorpo anti-Ki67 | abcam, Reino Unido | ab15580 | |
| Solução de desmascaramento de antígeno, base de ácido cítrico | Laboratórios de vetores, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond mountant antifade | Life technologies, Thermo Fisher científico; US | P36966 | |
| KIT SGOT (ASAT) | Sistema Clínico de Coral, Índia | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Sistema Clínico de Coral, Kit | ||
| (DEA) | Sistema Clínico de Coral, Solução de | ||
| de Mayer | ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solução, álcool | Sigma ; Montagem DPX HT110132 | ||
| sigma; US | 6522 | ||
| Melonex (analgésico) | Intas Pharmaceuticals Ltd; Índia | Injeção de meloxicam | |
| Sistema de substrato líquido aprimorado DAB tetracloridrato | Sigma ; E.U. | D3939 |
Referências
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Reimpressões e permissões
