Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.
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Artigo de método
Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.
Neste artigo
Resumo
Resumo
Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.
Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.
Introdução
Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.
O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.
O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.
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Protocolo
1. HFD alimentação protocolo
tabela 1. Receita de comida de mosca.
Esta tabela resume os diferentes ingredientes usados para preparar nosso controle alimentar. Uma vez feita, 10 mL do alimento é vertido em frascos, refrigerado e estocado a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Preparação HFD
- para fazer 1 kg de alimento gordo alto, pesa 700 g de comida de mosca normal pre-feita (ver tabela 1) e 300 g de óleo de coco em dois recipientes separados usando uma balança analítica.
- Calor cada recipiente individualmente no microondas, até que o conteúdo derrete completamente. Despeje o óleo de coco o recipiente de alimento de voar. Mexa com um batedor até que o óleo é bem misturado a comida da mosca.
Nota: Não há pedaços de comida ou óleo devem ser visíveis. Quando a comida de mosca está derretendo no microondas, parar em intervalos de 1 minuto para misturar os alimentos e evitar ferver. - Re-pesar o alimento de gordura alto. Se o peso total é inferior a 1 kg (700 g de comida + 300 g de óleo de coco), adicionar água (cerca de 10 mL) para compensar a evaporação durante o aquecimento e para trazer de volta o peso de 1 kg...
- Pour cerca de 10 mL bem misturado alta gordura comida por frasco (cerca de 25% do volume do frasco). Em seguida, cubra com gaze para evitar moscas ' contaminação. Deixe esfriar por 1h à temperatura ambiente, em seguida, transferir os frascos a 4 ° C para armazenamento acima de 4 semanas.
Nota: A comida Normal (NF) é usada como um alimento de controle. Também despeje 10 mL (cerca de 25% do volume do frasco) de NF por frasco. Para a comida HFD, substitua 30% da comida NF com óleo de coco. Para controle e condições experimentais, as moscas receberam a mesma quantidade de NF e HFD (10ml de comida por frasco).
Figura 1 . HFD alimentação em Drosophila.
O esquema mostra as diferentes etapas de alimentação para as moscas em um alimento de controle (dieta normal sem adição de óleo de coco-NF) ou HFD (com a adição de óleo de coco). O processo todo leva 10 dias após a coleta inicial de moscas adultas. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- HFD alimentação de d. melanogaster
Nota: Este protocolo inclui controle alimentar e HFD alimentando os procedimentos que são compatíveis com qualquer linha de voar. Controle e experimentais moscas são colocadas em frascos contendo a mesma comida de quantidade (NF ou HFD).- Uso de CO 2 para anestesiar moscas.
Nota: Para os neófitos, por favor leia referência 21 para uma visão geral sobre criação e manipulação de d. melanogaster. - Recolher 0-5 moscas dia velho de frascos e transferência (lançando) as moscas em novos frascos contendo NF (previamente aquecido à temperatura ambiente). Deixe a idade de moscas por 5 dias adicionais no 21 ° C.
- No final dos 5 dias, retire os frascos que contêm HFD e NF de 4 ° C.
Nota: como temperaturas frias podem salientar vivos moscas, deixe os frascos descansar por 30 min à temperatura ambiente para se aquecer antes de usar. - Usando lenços, limpar e remover o excesso de líquido dos lados dos frascos.
- Inserir um pequeno pedaço de papel de filtro, sobre 1 cm x 3 cm, a comida da alta gorda para absorver todo o líquido excedente.
Nota: Este passo é essencial para prevenir as moscas de degola para a comida HFD. - Em seguida, transferir as moscas sobre os alimentos de alta gordura (lançando). Colocar os frascos horizontalmente do lado deles, (não permanente) em 21-22 ° C durante 5 dias.
Nota: Evite temperaturas mais altas, como isto pode parcialmente derreter a comida gorda alta, fazendo com que as moscas manter os alimentos e morrer. - Depois de 5 dias, transferir (lançando) as moscas de NF e HFD dentro dos frascos de novos sem comida para permitir que a sua coragem de vazio durante 30 min. Em seguida, proceder à pesagem moscas.
Nota: Uma das etapas críticas neste HFD protocolo de alimentação é preparar um HFD bem misturado, livre de quaisquer pedaços de comida de mosca ou óleo condensado. Mistura homogênea e refrigerar o HFD 45-30 ° c é aconselhável, antes de derramar dentro dos frascos e armazenar os alimentos na idade adequada de 4 ° C. correspondência de controle e experimentais moscas é importante, assim como prior de condições nutricionais e ambientais controladas para a alimentação de HFD. Durante a fase de alimentação, controle e experimentais moscas devem ser dada a mesma quantidade de NF e HFD. Nunca colete moscas de superlotadas frascos ou garrafas (para evitar efeitos de transgeracional). Sempre coloque um máximo de 25 moscas por frasco durante NF e HFD alimentação para evitar restrição dietética ou outros efeitos crowding. O HFD é composto de 30% de óleo de coco, assim, temperaturas acima de 22 ° C parcialmente podem derreter o HFD, fazendo com que as moscas enfiar a comida oleosa e morrer. Antes de colocar as moscas o HFD, limpe os frascos para remover qualquer resíduo de óleo e inserir um filtro de papel para absorver qualquer excesso de líquido no alimento. Durante a incubação das moscas em HFD, os frascos são colocados em seus lados para fornecer uma superfície horizontal sem gordura para as moscas.
- Uso de CO 2 para anestesiar moscas.
- Pesando as moscas
- para cada genótipo e gênero a ser testado, usar uma escala ultra sensível para registrar os pesos de tubos de vazio, previamente rotulado 1,7 mL.
- Usando anestésico voar ou CO 2, anestesiar e recolher 36 moscas com o mesmo genótipo, sexo, e alimentar o status com um pincel em um pre-pesava 1.7 tubo mL.
- Pesa o tubo contendo moscas com a mesma escala ultra-sensíveis.
- Determinar o peso médio de voar esta fórmula a seguir:
Nota: O número de moscas neste protocolo é 36. - Flash congela os tubos de 1,7 mL contendo moscas por mergulhar no nitrogênio líquido por 2 min. coletar e colocar os tubos em caixas. Em seguida, transferir as caixas a-80 ° C (temperatura preferível) para o armazenamento até o uso com o ensaio de TAG.
Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa. Por favor, use equipamento de proteção pessoal apropriado.
2. TAG ensaio
- preparação das concentrações padrão TAG
- preparar 500 mL de PBT (PBS 1x, 0.05% Triton).
- Usando tubos de 0,5 mL e a solução de TAG (Tabela de materiais), preparam-se 100 µ l de espaço em branco (apenas PBT) e 100 µ l de seis concentrações de TAG padrão (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0,125 µ g / µ l; 0.0625 µ g / µ l) com o PBT.
- Coloque os tubos no gelo e prosseguir com as moscas de moedura.
- Moagem as moscas
- tirar as moscas congeladas de-80 ° C (etapa 1.3). Transferir os tubos contendo as moscas no gelo
- Primeiro, coloque o metal de 2 milímetros, bolas de moagem em um dispensador de bola 96 poços, use um pincel pequeno para remover bolas extras. Placa de
- lugar da moagem de 96 poços de cabeça para baixo em cima do dispensador de bola e flip transferir as bolas de metal directamente para a placa de moedura. Deve haver uma bola por alvéolo.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 600 µ l de PBT em cada linha da placa de 96 poços moedura.
- Com fórceps, adicionar 3 voa por bem. Indicar a condição de genótipo, sexo e comida das moscas em cada linha/poço da placa de 96 poços moedura.
- Firmemente Coloque as tampas para a placa de moedura de 96 poços. Fita pode ser colocada na parte superior para assegurar que não há nenhum escapamento.
- , Corretamente, colocar as placas de 96 poços moagem para a máquina de moer. Ajuste a máquina para a velocidade mais alta e pressione " executar " para moer as moscas por 3 min.
- Após 3 min, parar a moagem e proceder com centrifugação de placa: centrifuGE para 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Após a centrifugação, gerenciar a placa de moedura cuidadosamente para evitar misturar o sobrenadante com a pelota.
- Carregamento de amostra e determinação de conteúdo de TAG
- tomar uma nova placa de 96 poços Espectrofotômetro. Usando uma pipeta multicanal, carregar 200 µ l de reagente a TAG em cada linha da placa.
- Carga 20 µ l de PBT dentro do primeiro poço da primeira linha, para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas. Poços de
- carga 20 µ l de cada diluição padrão (da etapa 2.1.2) para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.
- Usando uma pipeta multicanal, transferência de 20 µ l do sobrenadante de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços Espectrofotômetro. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.
- Em seguida, coloque uma folha de gás-permeável sobre a parte superior da placa de 96 poços.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 10 min.
Nota: Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para remover todas as bolhas. A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância. - Leia a absorvância de cada poço da placa em 550 nm, utilizando um leitor de microplacas compatível. Em seguida, traçar a curva-padrão e determinar a concentração [µ g / µ l] das amostras desconhecidas.
- Para determinar a quantidade de conteúdo da marca por médio peso mosca, use a seguinte fórmula:
Nota: neste protocolo, 3 moscas foram picadas em 600 µ l de PBT; em consequência, o volume médio por mosca é 200 µ l.
- Ensaio de Bradford e normalização de conteúdo da marca com conteúdo de proteína
- preparar sete 100 µ l de albumina de soro bovino (BSA) padrão diluições (75 µ g/mL; 100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) com o PBT.
- Tomar uma nova placa de 96 poços e carregar 200 µ l de reagente de Bradford X 1 em cada linha da placa.
- No primeiro bem de primeira linha, adicionar 10 µ l de PBT para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas. Poços de
- Adicionar 10 µ l de cada diluição padrão para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.
- Usando uma pipeta multicanal, transferir 10 µ l do sobrenadante a mosca de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.
- Colocar uma película permeável ao gás por cima da placa de 96 poços.
- Incube a placa na temperatura de quarto por 5 min. Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para removê-los.
Nota: A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância. - Uso de um espectrofotômetro para ler a absorbância do branco, padrões e amostras desconhecidas em 595 nm. Use a curva padrão para determinar as concentrações [µ g / µ l] das amostras em cada linha.
- Normalizar a TAG conteúda com nível de proteína usando a seguinte fórmula:
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Resultados
No d. melanogaster, como é o caso com outras espécies, existe dimorfismo sexual entre machos e fêmeas,22. É sabido que as fêmeas são maiores, com mais gordura em seus abdomens, do que os machos22. Para testar a eficácia do nosso protocolo, realizamos ensaios de TAG para determinar as diferenças de conteúdo da marca entre machos e fêmeas de sua padrão de laboratório (w1118) voa. Os dados mostram que as fêmeas têm ...
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Discussão
Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está em contras...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dispensador de Conta-gotas/Contas Talboys | Talboys | #: 930150 | |
| Homogeneizador de Alto Rendimento Talboys | Talboys | #: 930145 | |
| Bolas de Moagem, Aço Inoxidável | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 bolas |
| Masterblock 96 Microplacas de profundidade de poço | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | caixa de 80 placas |
| Greiner Microplaca de 96 poços fundo plano | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 placas |
| Greiner CapMat para vedação de placas multipoços | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 placas de vedação |
| Reservatórios de Reagentes& nbsp; | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipeta |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipeta |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipeta |
| Multicanal pontas | Denville Scientific Inc | # P3131-S | para pipeta de 10 uL |
| Pontas multicanal | Denville Scientific Inc | # P3133-S | para pipeta de 200 uL |
| Pontas multicanal | Denville Scientific Inc | #P1125 | para pipeta de 100 uL |
| Fórceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Pinça super fina |
| Mettler Toledo Excellence XS Balança Analítica Mfr# XS64 | Especialistas científicos Cole-Parmer | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Balança de carregamento superior | Especialistas científicos Cole-Parmer | # EW-11333-49 | |
| Centrífuga de microplacas de 96 poços | Hettich Zentrifugen | # Microplaca Rotina 420R | |
| Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x corante Reagente |
| Óleo de coco | Nutiva | # 692752200014 | frasco de 15 0z |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Folha permeável a gás | Macherey-Nagel | # 740675 50 | peças |
| de papel de filtro | VWR | # 28317-241 | Pacote de 100 |
| frascos | de DrosophilaGenesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Rápido Albumina de Soro Bovino Padrão | Bio-Rad | # 5000206 | |
| Anestésico FlyNap | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Referências
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Reimpressões e permissões
