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Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

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DOI:

10.3791/56035

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1 de fevereiro de 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Neste artigo

Resumo

Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.

Resumo

A criação de linhas de mutante editando genoma está acelerando a análise genética em muitos organismos. CRISPR/Cas9 métodos foram adaptados para o uso na africana Xenopus, Xenopus, um organismo de longa data modelo para investigação biomédica. Os regimes tradicionais de reprodução para criar linhas mutantes homozigotos com mutagénese CRISPR/Cas9-alvo têm várias etapas demoradas e trabalhosas. Para facilitar a criação de embriões mutantes, particularmente para superar os obstáculos associados a bater para fora os genes que são essenciais para a embriogênese, foi desenvolvido um novo método chamado saltos. Esta técnica utiliza a robustez dos embriões de Xenopus "cortar e colar" métodos embriológicos. Saltos utiliza a transferência de células germinativas primordiais (PGCs) de embriões de doador de forma eficiente-mutagenized em sua PGC-ablated irmãos. Este método permite a eficiente mutação de genes essenciais criando animais quiméricoes com sua células somáticas que carregam uma mutante da linha germinal. Quando dois animais de0 F carregando "saltar transplantes" (isto é, células germinativas mutante) são intercrossed, eles produzem homozigotos, ou compostos heterozigotos, nulos F1 embriões, economizando assim um tempo de geração completo para obter dados fenotípicos. Saltos também fornece uma nova abordagem para a análise de genes de efeito materno, que são refratários à análise fenotípica de0 F seguindo CRISPR/Cas9 mutagênese. Este manuscrito detalha o método dos saltos, com especial ênfase em como executar com sucesso o transplante de PGC.

Introdução

Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século1, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid, X. laevis, mas mais recentemente, devido à sua Diploidia, X. tropicalis desenvolveu-se como um modelo genético de anfíbios. Foram montadas sequências do genoma completo de ambas as espécies de Xenopus 2,3. A comunidade de"sapo" é agora um ponto de viragem onde tecnologia de modificação do genoma básicos permite o estudo da função do gene, praticamente à vontade. Programável CRISPR/Cas9 endonucleases fizeram o mutagenesis de genes altamente eficiente, com biallelic mutação possível na maioria das células do animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Estes estudos, sublinhados por Bhattacharya et al 12 e Shigeta et al 13, têm mostrado que a função de muitos genes pode ser estudada por mutagênese em animais de mosaico F0 . Esta abordagem tem muitas vantagens; no entanto, Cas9-sgRNA-injetadas embriões frequentemente exibem fenótipos variáveis devido a perda incompleta da função (LOF). Mais significativamente, a geração de linhas mutantes é altamente vantajosa para alguns aplicativos — em especial, ao estudar os genes que têm uma contribuição materna do mRNA. MRNAs maternos e proteínas e suas influências na epigenética, persistirem por um período prolongado na embriogênese14,15,16, tornando as contribuições do desenvolvimento precoce de muitos genes refratários para análises de F0 . Portanto, outras abordagens LOF são necessárias.

Quando pretendem criar linhas mutantes, o caminho para obtenção de embriões LOF homozigotos tem vários obstáculos. Mutagênese em primeiro lugar, eficiente para produzir mutações biallelic pode ser desvantajoso porque a perda das funções essenciais do gene resulta em falha para sobreviver à maturidade sexual, interferindo com a produção de uma linha viável. Uma solução comum é a titulação cuidadosa da quantidade de Cas9-sgRNA entregado. Aqui, o objetivo é alcançar um equilíbrio entre reduzir letalidade enquanto também maximiza a eficiência de mutagénese germline. Um segundo problema surge a partir do esquema de reprodução padrão, onde análises fenotípicas são diferidas até à geração2 de F. Usando a abordagem padrão, sexualmente maduras animais de0 F que transmitem mutante alelos através do germline são outcrossed para produzir F1 heterozigoto "transportadoras", que em seguida são cultivadas para a maturidade sexual. Dois heterozigotos de1 F são então intercrossed para produzir embriões mutantes de F2 com uma frequência mendeliana esperada de 25%. Assim, duas gerações de reprodução são necessárias para a análise de fenótipos mutantes. Animais mutantes poderiam ser homozigotos ou heterozigotos compostos (ou seja, a descendência que contém dois alelos mutantes diferentes, que depende dos genótipos dos animais parentais utilizados em intercross de1 a F).

Estes obstáculos podem ser superados por confinar programável mediada por nuclease mutagênese de células germinativas, que está subjacente a um novo método chamado saltando17. Saltos tem dois componentes principais: (1) a microinjeção de mRNA Cas juntamente com sgRNA, ou sgRNA-nuclease complexos (ou, em princípio, TALENs ou zinco nucleases de dedo) na fase de célula única para eficientemente mutagenize embrionárias genomas, seguido por (2) o transplante de PGCs em embriões de sua irmã, onde os PGCs endógenos foram removidos. Quando os dois passos são germline eficiente, completa substituição com mutantes de células germinativas pode ser obtido. Blackler demonstrado na década de 1960 que Xenopus PGCs poderiam ser transplantadas entre embriões no neurula atrasado e cedo tailbud fases18,19. Para saltos, abordagem do Blackler foi modificada por realizar os transplantes para o estágio de blástula17, quando PGCs são localizadas no polo vegetal do embrião20,21. Transplante antes gastrulação tem duas vantagens principais. Primeiro, a enxertia de transplantes e o subsequente desenvolvimento normal foi encontrada para ser mais eficiente quando o transplante é realizado na fase de blástula (observações não publicadas). Em segundo lugar, realizando transplantes de blástula-palco logo após a transcrição zigóticos começou, um pode evitar a letalidade decorrentes do desenvolvimento gene mutações que interrompem a gastrulação ou que caso contrário levar ao neurulae tarde malformado. PGC transplante-rolamento ("leapfrogged") embriões são cultivados a maturidade sexual, e inter-cruzamentos entre estes animais de0 F têm demonstrado que, em muitos casos, 100% da descendência F1 exibir o fenótipo LOF (a maioria sendo composto heterozigotos), indicando a substituição completa do germline com as mutações específicas.

Espera-se que saltos acelerará abordagens genéticas em Xenopus. Saltos também fornece uma alternativa para o método de "transferência de acolhimento"22 para a análise LOF dos genes maternos-efeito (observações não publicadas). Na atual publicação, uma descrição detalhada do método, concentrando-se especialmente na transplantação de PGC, é apresentada em X. tropicalis (com pequenas modificações para X. laevis). O transplante de PGCs é demonstrado aqui para facilitar uma mais rápida transferência desta tecnologia para outros laboratórios que trabalham com Xenopus. Os princípios deste método devem ser bem sucedidos em outros anfíbios (por exemplo, urodeles), e modificações do organismo específico na metodologia permitir aplicação para muitos outros animais na qual mutagênese eficiente pode ser realizado e PGCs são prontamente para transplante.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Irvine e institucional Cuidado Animal.

1. os preparativos para o transplante de PGC

  1. Prepare ferramentas de dissecação com antecedência, como descrito anteriormente,23.
    Nota: Facas de sobrancelha cabelo são usadas para fazer incisões com o auxílio de um laço de cabelo para estabilizar o embrião durante a realização das cirurgias. Os pelos da sobrancelha e cabelo loops são colados no vidro de borosilicato pipetas Pasteur que ter sido desenhado pela primeira em uma chama e quebrados na porção diluída (ver figura 1A, ponta de seta) para criar uma ponta menor, mais estreita (figura 1B) para maior destreza ao realizar cirurgias.
  2. Gere sgRNAs usando os procedimentos descritos anteriormente24 .
    Nota: Brevemente, curtos modelos de DNA que codifica para sgRNAs são criados usando sobreposição deoxyoligonucleotides contendo 5' promotores do bacteriófago T7, que são recozidos e "preenchido" por uma DNA-polimerase termoestável, livre de erros. Reações da síntese in vitro sgRNA são incubadas durante várias horas durante a noite (dependendo do kit usado). As reações são DNAse-tratada para remover o modelo. Os sgRNAs são purificados por métodos padrão de fenol/clorofórmio extração e amônio acetato/isopropanol precipitação, de acordo com instruções24 do fabricante kit.
  3. Logo antes de executar microinjeções, preparar Cas9-sgRNA complexos pela primeira desnaturação ~ 250 ng de sgRNA em um volume total de 3 µ l de RNAse-livre (diethylpyrocarbonate-tratada) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de resfriamento rápido no gelo por 5 min. Centrifugue a sgRNA por alguns segundos, adicionar 1 µ l de 1 proteína de Cas9 µ g / µ l e incubar durante 10 minutos a 37 ° C, para promover a formação do complexo.
    Nota: Após esta incubação, o tubo pode ser mantido no gelo enquanto prepara os embriões para o microinjection.
  4. Obter X. tropicalis de embriões, fertilização in vitro usando métodos padrão, como descrito anteriormente,25. Geleia de25,26 os embriões na pós-fertilização 10 min.
    Nota: O tempo de fertilização é considerado o tempo após a suspensão de esperma é adicionada para os ovos e o prato é inundado com 1/9thX modificado Ringers (MMR)26 de Marc. X. tropicalis25, ao contrário de X. laevis, realizar a eliminação jellying em 1/9 x MMR contendo 3% base cisteína livre (não o sal de HCl), pH ajustado para 7,8-8.0, seguido por várias lavagens em 1/9 x MMR. Transferir os embriões para um agarose (1%)-prato revestido contendo 1/9 x MMR à temperatura ambiente.
  5. Transferir imediatamente os embriões deve ser injetado para um prato revestido de agarose 1%, contendo 1 x MMR com uma pipeta Pasteur.
  6. Injete na fase 1-célula. Ver referências26,27 para obter descrições detalhadas de métodos de microinjeção de Xenopus .
    1. Injetar cada embrião em um único local no polo animal, com 4 nL do complexo Cas9-sgRNA (quantidade final = 1 ng de Cas9 e ~ 250 pg de sgRNA; ver a discussão)24. Após 10-20 min de injeção local de cura, transferir os embriões para um prato de agarose-revestido contendo 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. Também crie um prato de uninjected irmão embriões que servirão como destinatários do enxerto.
  7. Prepare-se placas de Petri (60 mm) que contêm um mm ~ 5-camada espessa de agarose a 1% em 0,3 x MMR, se fazer transplantes em X. tropicalis, ou 1 x MMR para X. laevis.
    1. Criar depressões ~ 3-4 mm de profundidade através da inserção de um 3-x 4-poço molde (criado por um corte de uma placa PCR de 96 poços) no agarose derretido quando deitar as placas (ver Figura 1 e D). Segure o molde vários milímetros acima do fundo da caixa de Petri usando uma pinça anexada a um carrinho de anel até a agarose endureceu.
    2. Além disso, fazer uma placa de 24 para embriões individual casa revestindo as cavidades com uma fina camada de agarose a 1% em 1/9 x MMR.
      Nota: O meio de cultura adicionado a esses poços é 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL.

2. transplante de PGCs

  1. Quando os embriões só chegar Nieuwkoop e Faber28 blástula fase 9 (Figura 2A), ~4.5 h pós-fecundação (hpf) para X. tropicalis, removê-los da incubadora a 25 ° C e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente por um período adicional 0,5 h.
  2. Para começar o transplante em 5 hpf (Figura 2B), usar uma pipeta Pasteur para transferir um embrião de doador PGC (injetado com Cas9-sgRNA) para o prato de agarose 60mm contendo depressões (criadas na etapa 1.7) em 0.3 x MMR (ou 1 x MMR se usando X. laevis). Também transferi um embrião do irmão uninjected, o destinatário do enxerto, para este prato.
    Nota: É fundamental que as identidades de cada um destes embriões não são confundidas.
  3. Manualmente remover os vitelínico envelopes de cada embrião usando fórceps e girar ambos os embriões, de modo que seus polos vegetal estão no modo de exibição e acessível para a cirurgia.
    Nota: Uma descrição de-vitellination manual de embriões já havia sido descrito26.
  4. Usando a ponta afiada da faca de cabelo sobrancelha, faça quatro incisões rasas em forma de um quadrado no polo vegetal do embrião destinatário, dentro da zona onde o futuro garrafa células que marcam o Blastóporo irão formar. Fazer as incisões por inserir a ponta da faca sobrancelha cabelo do embrião, logo abaixo da superfície e fazer movimentos de corte para cima enquanto estabilizando o embrião com o laço de cabelo.
    Nota: A Figura 2 mostra vegetais vistas de um embrião em intervalos médios de 4.5-7.0 hpf para mostrar o tamanho da célula e para fornecer um guia para estimar onde as células de garrafas formarão (círculo branco tracejado). O objectivo é fazer incisões onde caixa tracejada de preto é indicada.
  5. Uma vez que os quatro lados do quadrado são delineados por incisões, aprofunde cada incisão com a faca de sobrancelha cabelo usando movimentos de corte semelhante para chegar a uma profundidade de aproximadamente 1/3 a 1/2 da distância até o chão blastocoel.
  6. Livre o explante de tecido vegetal do embrião do destinatário (Figura 3A e B) fazendo uma horizontal (paralela à superfície vegetal) cut(s) na região profunda vegetal.
    Nota: O tamanho do explante vegetal contendo PGC é aproximadamente 0,4-0,45 mm por lado e 0,25-0.3 mm de profundidade. Este vegetal explante de embrião o destinatário não é mais necessária e, portanto, deve ser anulado para serem descartados.
  7. Trabalhando rapidamente, repita este procedimento (etapas 2.4-2.6), sobre o embrião de doador do PGC para criar um fragmento de tecido vegetal similarmente feito sob medida para transplante.
    Nota: É importante realizar esta segunda dissecação com pequeno atraso para minimizar o tempo para o embrião do destinatário curar sua ferida aberta.
  8. Uma vez que o tecido contendo PGCs é retirado do embrião doador, use o sobrancelha cabelo faca e cabelo laço para mover este explante em posição na abertura criada no embrião destinatário.
    Nota: A superfície interior do enxerto doador deve estar virado para o interior do embrião do destinatário. Não é necessário corresponder as orientações dos eixos dorso-ventral e direitas do enxerto com o embrião do destinatário.
  9. Use a borda longa do eixo da faca sobrancelha cabelo, mantida paralelamente à superfície do enxerto, pressione suavemente o enxerto na abertura na superfície vegetal do embrião destinatário.
  10. Uma vez que o enxerto foi colocado, use um hairloop ou o eixo de uma faca de cabelo de sobrancelha para deslizar suavemente a "carcaça" do embrião doador através da superfície de agarose e em uma depressão de agarose. Certifique-se de que a ferida aberta da carcaça está enfrentando o líquido em massa. Se não, use a faca de cabelo de sobrancelha para girar o embrião para alcançar esta orientação.
  11. Deslize o embrião do destinatário, com o enxerto de cura no lugar, em uma depressão adjacente e do mesmo modo certifique-se de que o tecido transplantado polo vegetal está enfrentando o líquido em massa.
  12. Repita este procedimento (passos 2.1-2.11) usando um outro par de doador e receptor embriões para criar outro par de transplante/carcaça; transferi a estes a depressões vazias.
    Nota: É fundamental que faz anotações para manter o controle de pares correspondentes de carcaças e rolamento de transplante de embriões. As carcaças do doador serão usadas como um proxy para a eficiência de Cas9 sgRNA-induzida mutagênese nos PGCs transplantados, o que não pode facilmente ser analisada até os transplante-rolamento animais atingem a maturidade sexual (ver passo 3.3, abaixo e a discussão ).
  13. Continuar a fazer transplantes de embriões alcançará aproximadamente gástrula precoce 10, que é aproximadamente 6.5 hpf em X. tropicalis (ver Figura 2E).

3. pós-cura de embriões

Nota: Enxertos curam no lugar dentro ~ 30 min, e é normal observar alguns destroços yolky de lise celular exsudação do embrião (Figura 3).

  1. Uma vez curada, use uma pipeta Pasteur para suavemente de transferência de embriões desde as depressões individuais aos poços de uma placa de 24 Poços revestidos de agarose. O exsudato será removido (figura 3D) pelo fluido durante a transferência de mistura.
    1. Gire os embriões para que são colocados vegetal-polo acima, enfrentando a solução em massa. Novamente, coloque as carcaças de doador e enxertar destinatários em poços adjacentes para ajudar a manter o controle dos pares do embrião; grave esta informação.
  2. Transferi a placa de 24 contendo embriões para uma incubadora de 25 ° C para a cultura durante a noite.
    Nota: No dia seguinte, os embriões terá atingido estágios tailbud.
  3. Mova os destinatários de enxerto para limpar placas com revestimento em agarose 6-poços contendo 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL, com 1 embrião por bem. Manter um registro claro de carcaças de doador que correspondam a estes destinatários do enxerto.
  4. Para avaliar a eficiência de mutagénese sequenciamento PCR amplicons5,17,24 ou usando outros métodos que dependem de PCR amplicons (veja a discussão), mova as carcaças individuais para 0,2 mL tira da polimerase. Remover a maioria do meio e homogeneizar em 100 µ l do lysis buffer24 contendo proteinase K (PK) por repetidas pipetagem altos e baixos, com uma pipeta P200.
  5. Execute o embrião lise24 a 56 ° C, durante 6 h durante a noite para permitir a digestão de PK. Inactivar PK aquecendo a 90-95 ° C por 10 min, seguido de rápido resfriamento a 4 ° C. Use lysates sem outras medidas de limpeza para propagar as reações de PCR para obter amplicons curto para direto de sequenciamento Sanger DNA24. Armazenar os lysates a-20 ° C.
    Nota: Dentro de alguns dias, os girinos vão chegar a fases de alimentação (fase aproximadamente 45-46) e podem ser alimentados a uma suspensão de pó planctônico (sera Micron).
  6. Depois de ~ 1 semana, com alterações diárias de meio de cultura para manter a limpeza e minimizar o crescimento microbiano excessivo, mova girinos para tanques pequenos em um sistema aquático circulante com fluxo de gotejamento. Use os dados de sequenciamento para segregar os girinos com PGCs altamente eficiente mutagenized de girinos com menor eficiência de mutagénese. Uma vez que a metamorfose é completa, mova o froglets para o sistema aquático adulto no laboratório.
    Nota: Regimes desenvolvidos pelo recurso de Xenopus nacional (laboratório de biologia marinha, Woods Hole, MA) fornecem um guia para alimentação29 e sapo adulto manutenção30de girino.

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Resultados

Após o transplante, a determinação qualitativa da eficácia de mutagénese CRISPR/Cas9 deve ser executada antes de despender o esforço na pecuária de crescer e manter os animais a maturidade sexual. Porque animais portadores leapfrog transplantes são somaticamente sua e do germline é difícil acesso para medições directas, salvar os cadáveres de embriões de dador torna-se importante. Análise de DNA de carcaças serve como um proxy para a extensão de mutagênese que ocorre no germline transplan...

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Discussão

Este relatório fornece um protocolo detalhado para o transplante de tecido vegetal contendo PGCs. transplante de PGCs é usado em conjunto com tecnologias de edição de genoma (por exemplo, CRISPR/Cas9) para modificar o germline de um animal enquanto mantendo a quase todos os tecidos somáticos como geneticamente tipo selvagem. Para saltos para ser bem sucedido, há um número de fatores críticos a considerar antes de realizar a execução de transplantes.

Para garantir a completa substituiç...

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Divulgações

O autor não tem nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado com o apoio de uma subvenção, 5R21HD080684-02, do Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano. O autor deseja agradecer a Ken Cho para seu contínuo entusiasmo e apoio. O autor também gostaria de reconhecer Bruce Blumberg para uso da sua câmera, Rebekah Charney, para a leitura crítica do manuscrito e Sean McNamara e Marcin Wlizla o recurso de Xenopus nacional (RRID:SCR_013731), para o valioso conversas sobre X. tropicalis alimentar e regimes de cuidados com animais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pinça Dumont #5Ferramentas de Ciência Fina11252-20 ou 11252-30
Facapara
Caseiro LoopPipetas
caseiras de Pasteur, vidro borossilicatoFisher Scientific13-678-20A
Krazy Glue (à base de cianoacrilato)Elmer's Products, Inc.KG581Para fixar pêlos de sobrancelha e alças de cabelo em pipetas Pasteur, outras colas semelhantes podem ser usadas.
Oligodesoxinucleotídeos, ordenados sob medidaTecnologias de DNA integradasOligos de modelo personalizados para síntese de sgRNA, consulte Nakayama et al., 2014 para detalhes do projeto.
Kit Megascript T7Ambion/ThermoFisherAM1334Ou use o kit Megashortscript T7 (AM1354)
Fenol, Tris tamponadoFenol destilado de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial
ClorofórmioClorofórmio de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial
EtanolEtanol de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma Chemical Co.Proteína D5758-50ML
Cas9, com sinal de localização nuclearPNA Bio, Inc.CP01Reconstituído com água tratada com DEPC de acordo com as recomendações do fabricante
Solução de RingersCaseira. A receita (ref 26) para 1X MMR (sem EDTA) é 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. A solução é ajustada em pH para 7,4.
AgaroseQualquer agarose de grau de Biologia Molecular é suficiente
60 placas de Petri X15 mmFalcon351007
placas de 24 poçosFalcon3047
L-CisteínaSigma Chemical Co.C7352-100GBase livre, não sal HCl
Proteinase K Roche03 115 828 001Normalmente ~20mg/ml de Roche
sera MicronseraAlimento para girinos. Ressuspender em meio de crescimento. Pode ser comprado em uma variedade de varejistas on-line
de cabelo sobrancelhas de cabelo Modificada 10X Marc

Referências

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