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Artigo de método

Cavitação de nitrogênio e centrifugação diferencial permite o monitoramento da distribuição de proteínas de membrana periférica em culturas de células

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DOI:

10.3791/56037

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18 de agosto de 2017

 , 
1Langone Medical Center, New York University

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos os protocolos para homogeneização de detergente livre de células de mamíferos cultivadas com base no azoto cavitação e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Este método é ideal para monitorar o particionamento de proteínas de membrana periférica entre solúvel e fracções de membrana.

Resumo

As células cultivadas são úteis para estudar a distribuição subcelular de proteínas, incluindo proteínas periféricas da membrana. Geneticamente codificado fluorescente etiquetadas proteínas revolucionou o estudo da distribuição Subcellular da proteína. No entanto, é difícil quantificar a distribuição com microscopia fluorescente, especialmente quando as proteínas são parcialmente citosólica. Além disso, muitas vezes é importante estudar proteínas endógenas. Bioquímicos ensaios tais como immunoblots permanecem o padrão ouro para quantificação da distribuição de proteínas após fracionamento subcelular. Embora existam jogos comerciais que visam isolar citosólica ou certas fracções de membrana, a maioria destes jogos é baseada na extração com detergentes, que podem ser inadequados para o estudo de proteínas de membrana periférica que facilmente são extraídas de membranas. Aqui nós apresentamos um protocolo livre de detergente para celular homogeneização por cavitação de nitrogênio e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Podemos confirmar a separação de organelas subcelulares em solúvel e pelota frações através de diferentes tipos de células e comparar a extração de proteínas entre vários métodos de homogeneização mecânica não baseados em detergente comum. Entre várias vantagens de azoto cavitação é a eficiência superior de ruptura celular com o mínimo de danos físico e químico para organelas delicados. Combinado com ultracentrifugação, cavitação de nitrogênio é um excelente método para examinar a mudança das proteínas de membrana periférica entre citosol e membrana fracções.

Introdução

Proteínas celulares podem ser divididas em duas classes: aqueles que estão associados com membranas e aqueles que não são. Non-membrana proteínas associadas são encontradas no citosol, nucleoplasma e lumina de organelas como o retículo endoplasmático (ER). Existem duas classes de proteínas de membrana-associado, integrais e periféricas. Proteínas integrais da membrana são também conhecidas como proteínas transmembrana porque um ou mais segmentos da corrente do polypeptide atravessa a membrana, normalmente como um composto de aminoácidos hidrofóbicos α-hélice. Proteínas transmembrana co-translationally são inseridas em membranas no decorrer de sua biossíntese e permanecem assim configuradas até que eles são catabolizados. Proteínas periféricas da membrana secundariamente são levadas a membranas, geralmente como consequência de modificação pós-traducional com moléculas hidrofóbicas, tais como lipídios. Em contraste com as proteínas integrais de membrana, a associação de proteínas de membrana periférica com membranas celulares é reversível e pode ser regulada. Função de proteínas de membrana periférica muitas em vias de sinalização e regulamentada associação com membranas é um mecanismo para ativar ou inibir um caminho. Um exemplo de uma molécula de sinalização que é uma proteína de membrana periférica é a pequena GTPase, RAS. Após uma série de modificações borne-translational que incluem modificação com um lipídico farnesil, modificado C-terminal de uma proteína RAS maduro insere-se no folheto da citoplasmático da membrana celular. Especificamente, a membrana plasmática é onde o RAS envolve sua jusante efetoras RAF1. Para evitar a ativação constitutiva do mitogen-ativado proteína quinase (MAPK) via, vários níveis de controle de RAS estão no lugar. Além de renderização RAS inativo por hidrólise de GTP em GDP, RAS ativo também podem ser liberados da membrana plasmática, modificações ou interações com fatores para inibir a sinalização de solubilizing. Embora fluorescente imagens ao vivo proporciona biólogos de célula a oportunidade de observar a Localização subcellular de proteínas da membrana periférica com tag proteína fluorescente1, ainda há uma necessidade crítica para avaliar a associação de membrana de proteínas endógenas semi-quantitativamente com simples abordagens bioquímicas.

A adequada avaliação bioquímica de proteína particionamento entre a membrana e frações solúveis é criticamente dependente de dois fatores: homogeneização celular e separação eficiente de membrana e frações solúveis. Embora alguns protocolos, incluindo os kits comercializados mais amplamente utilizados, dependem de homogeneização de detergente à base da célula, estes métodos podem ofuscar análise pela extração de proteínas de membrana para a fase solúvel2. Por conseguinte, detergente não-mecânicos, baseado em métodos de rompimento da pilha fornecem resultados mais limpos. Existem vários métodos de ruptura mecânica das células cultivadas em cultura ou colheita de sangue ou órgãos. Estes incluem homogenizacao homogeneização, rompimento de agulha fina, homogeneização do rolamento de esferas, sonication e cavitação de nitrogênio. Aqui podemos avaliar cavitação de nitrogênio e compará-lo com outros métodos. Cavitação de nitrogênio depende de nitrogênio que é dissolvido no citoplasma das células sob alta pressão. Depois de equilibração, a suspensão de eritrócitos é abruptamente exposta à pressão atmosférica tal que formam-se bolhas de nitrogênio no citoplasma que rasgue a célula como consequência de sua efervescência. Se a pressão for suficientemente elevada, efervescência de nitrogênio pode interromper o núcleo3 e membrana limite organelas como lisossomos4. No entanto, se a pressão é mantida baixa o suficiente, a descompressão vai interromper a membrana plasmática e ER mas não outras organelas, desse modo, derramando tanto citoplasma e organelas citoplasmáticas intactas para o homogenate designado o cavitate5. Por esta razão, cavitação de nitrogênio é o método de escolha para isolar organelas como lisossomos e mitocôndrias.

No entanto, também é uma excelente maneira de preparar um homogenate que pode ser facilmente separada em membrana e frações solúveis. O vaso de pressão (doravante denominado "a bomba") usado durante a cavitação consiste de um invólucro de aço inoxidável espesso que resiste a alta pressão, com uma entrada para a entrega do gás nitrogênio de um tanque e uma porta de saída com uma válvula de descarga ajustável.

Cavitação de nitrogênio tem sido usada para homogeneização de célula desde a década de 1960,6. Em 1961, Hunter e Commerfold7 estabeleceu cavitação de nitrogênio como uma opção viável para o rompimento de tecidos de mamíferos. Desde então, pesquisadores adaptaram-se a técnica de várias células e tecidos com sucesso, e cavitação de nitrogênio tornou-se um grampo em vários aplicativos, incluindo preparação de membrana8,9, núcleos e organela preparação de10,11e extração bioquímica lábil. Atualmente, biólogos da célula mais frequentemente empregam outros métodos de homogeneização de celular porque os benefícios de homogeneização de nitrogênio não têm sido amplamente divulgados, bombas de nitrogênio são caras e há um equívoco que é um número relativamente grande de células Necessário. Protocolos para cavitação de nitrogênio alcançar homogenates livre de células com núcleos intactos não tenham sido publicados, e em avaliações publicadas mais volumes de 20 mL da suspensão de células foram usados. Para adaptar esta técnica clássica para atender às necessidades atuais de trabalhar com amostras em pequena escala, apresentamos um protocolo modificado de cavitação de nitrogênio projetado especificamente para pilhas cultivadas. Após a cavitação de nitrogênio, o homogeneizado é separado em solúveis (S) e frações de membrana (P) por centrifugação diferencial, primeiro com uma rotação de baixa velocidade para remover núcleos e células ininterrupta e depois com uma rotação de alta velocidade (> g x 100.000) para separar membranas da fracção solúvel. Podemos analisar a eficiência da separação com immunoblots e comparar a cavitação de nitrogênio com outras técnicas de ruptura mecânica. Também investigamos o efeito osmótico de tampão de homogeneização durante a cavitação de nitrogênio.

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Protocolo

1. buffer e preparações de equipamento

  1. Chill 45 mL célula rompimento bombas, tubos de 15 mL e tubos de ultracentrifugação em 4 ° C.
  2. Preparar e relaxar 25 mL de tampão de homogeneização por 2 x 10 7 células em 4 ° C. adicionar uma protease inibidor tablet imediatamente antes da utilização.
    Nota: Buffers de homogeneização normalmente contêm KCl ao invés de NaCl para melhor refletir a composição intracelular de sal. Tampão de homogeneização utilizado neste protocolo consiste de 10 mM HEPES pH 7,4, 10 mM KCl e 1,5 mM de MgCl 2 (adiante designado como tampão de homogeneização hipotônica). A maioria dos amortecedores podem ser adaptados para cavitação de nitrogênio (ver discussão).
  3. Preparar e relaxar 6 mL de tampão de Phosphate-Buffered salino (PBS) por amostra em 4 ° C. Adicionar protease inibidor comprimidos frescos antes de usar 1x.
    Nota: Tampão PBS utilizado neste protocolo consiste de 10 mM Na 2 HPO 4 em pH 7,4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl.
  4. Preparar e relaxar 4 mL de tampão de solubilização por amostra em 4 ° C. adicionar uma protease inibidor em comprimidos imediatamente antes da utilização.
    Nota: O buffer de solubilização usado neste protocolo é 1 x Radioimmunoprecipitation buffer de ensaio (RIPA), que consiste de 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, Deoxycholate do sódio de 0,5% e 1% NP-40. Ver nota 4,6.

2. Colheita de células

meios de cultura
  1. Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 células de cultura de tecidos com a recomendada para o tipo de célula. Normalmente, um prato de 15 cm rende 2 x 10 7 células HEK-293 cultivadas em DMEM em confluência de 90% ( Figura 1).
  2. Remover o meio de crescimento por vácuo.
  3. Para as células aderentes, coloque os pratos de cultura no gelo, lavar as células diretamente sobre os pratos de cultura suavemente com tampão de homogeneização refrigeradas duas vezes (10 mL de tampão por prato 15 cm por lavagem) e colher as células com um raspador de grandes células em um volume adequado de tampão de homogeneização; Para células de suspensão, recolher e lavar o centrifugado homogeneização refrigerados reserva duas vezes (10 mL de tampão por cultura de 50 mL por lavagem) com rotação de 500 x g a 4 ° C por 5 min e resuspenda o pellet celular lavados em um volume adequado de tampão de homogeneização no gelo.
    Nota: O volume deve basear-se sobre os requisitos para a concentração de proteína em experimentos pretendidos, bem como o volume mínimo/máximo permitido na bomba de rompimento celular. A regra geral é de 2-10 x 10 7 células/mL, ou cerca de 10 volumes da célula de Pelotas. Este protocolo é otimizado para três pratos de 15 cm de células HEK-293 em 2 mL de tampão de homogeneização.

3. Cavitação de nitrogênio

  1. a suspensão de células de transferência para uma bomba limpa e refrigerada em banho de gelo em um rebuliço placa.
    Atenção: A bomba tem alta pressão, baixa temperatura, gás nitrogênio – usar proteção pessoal apropriada .
  2. Colocar uma barra de agitação magnética micro interior da bomba e ligar a placa de agitação para manter a homogeneidade de suspensão.
  3. Adicionar um comprimido de inibidor de protease à suspensão e feche a bomba por fabricante ' instrução de s.
  4. Gradualmente pressurizar a bomba com um tanque de gás nitrogênio por fabricante ' instrução s até o calibre de pressão de bomba lê 300 a 600 libras por polegada quadrada. Fechar todas as válvulas e desconectar o tanque de nitrogênio.
    Nota: A pressão necessária pode variar com o tipo de célula. Aqui realizamos cavitação em 350 a 400 psi para células HEK-293, NIH-3T3 e Jurkat.
  5. Espera por 20 min permitir que o nitrogênio para dissolver e atingir o equilíbrio dentro das células.
  6. Remover o excesso de água ao redor da válvula de descarga, usando uma toalha de pano. Abra a válvula de descarga suavemente para alcançar uma liberação gota a gota do homogeneizado e recolher em um tubo de 15ml pré-refrigerada.
    Nota: Perto do fim da coleção haverá um surto de homogeneizado e gás vão surgir com um som sibilante. Certifique-se de que o gás não causa anteriormente recolhida cavitar para atirar fora o tubo (daí o uso de 15 mL de tubos em vez de tubos de 1,5 mL). Uma vez que começa o jorro, fechar a válvula de descarga e abrir a válvula de entrada de nitrogênio abruptamente para despressurizar a bomba e alcançar a cavitação das restantes células na bomba. Abrir a bomba para cavitar recuperação e limpeza profunda.
    Nota: O cavitate final deve ter um aspecto leitoso com espuma na parte superior. Misture delicadamente com a ponta da pipeta para permitir que a espuma diminuir antes da centrifugação.
    Nota: Examine o cavitate por microscopia de contraste de fase para determinar a eficiência de homogeneização. Adicionar uma gota de 15 µ l de cavitar à superfície de uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela. Repita a etapa 3.4-3.6 somente se muitas células ininterrupta são detectadas com um objectivo de 20 X.
    Nota: Se o buffer de homogeneização não contém EDTA ou EGTA, adicioná-lo para o coletados cavitar em uma concentração final de 1 mM dentro de 5 min após a alta hospitalar.

4. Separação de Cytosolic e fracções de membrana

  1. centrífuga a cavitate em 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover células ininterrupta e núcleos.
    Nota: Repita o passo de centrifugação até nenhum sedimento visível é produzido e recolher o sobrenadante Nuclear Post (PNS), evitando a espuma flutuante por cima. Re-centrifugar a espuma para mais coletar e combinar PNS, se necessário ( Figura 1).
  2. Processo do PNS como desejado para obter fracções de interesse. Com a finalidade de separar citosólico e fracções de membrana, transferir o PNS para um tubo se e executar ultracentrifugação conforme desejado. Este protocolo é otimizado para um < 3,5 mL de amostra em um tubo de se de policarbonato e por ultracentrifugação a 350.000 x g, durante 1 h a 4 ° C.
  3. Recolher o sobrenadante (a fração S) utilizando uma pipeta de 1 mL.
  4. Enxaguar cuidadosamente a pelota com 3 mL de PBS frio sem perturbá-la. Remover a PBS pelo vácuo.
    Nota: Se a contaminação da fração de membrana por proteínas citosólica é uma preocupação maior do que a perda da amostra, resuspenda o pellet em 3 mL de PBS e re-se como na etapa 4.2 frio. Remover a PBS pelo vácuo.
  5. Resuspenda o pellet totalmente em um volume adequado de detergente contendo tampão de solubilização de escolha. Para conseguir a equivalência de célula, use o mesmo volume de buffer de solubilização como a fração citosólica.
    Nota: Sugerimos que usando 1 buffer de x RIPA como buffer de solubilização para extração de proteína de membrana eficiente. Se nenhum ensaio a jusante é exigido para fração de membrana, use 1 amortecedor da amostra x laemmli para extração de proteína de membrana maximal.
    Nota: Sugerimos que desalojar e transferir o sedimento no buffer de solubilização para um tubo limpo em rotacao tubo a 4 ° C para a extração de proteína de membrana maximal.
    Nota: Se a pelota é muito pegajosos (muitos lipídios) para ser eficientemente removido do thtubo da se e no buffer de solubilização, sugerimos snap congelando a pelota em nitrogênio líquido e rapidamente desalojar a pelota do tubo se com uma espátula de metal mini antes da pelota descongela.
    Nota: Como alternativa, pelotas de membrana podem ser apenas resuspended e não solubilizadas em um buffer que contém detergente para produzir uma fração P de suspensão de vesículas de membrana, em que não é necessário caso a centrifugação passo em 4.6. Tais frações de P são úteis quando investigando funções como actividades enzimáticas que dependem da Associação de membrana.
  6. Centrifugar a suspensão totalmente solubilizado pelota da etapa 4.5 a 20.000 x g em uma centrífuga de mesa para 10 min a 4 ° C. recolher o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL (a fração de P) e descartar a pelota (lipídios insolúveis).
  7. Realizar ensaios desejados como mancha ocidental com as frações citosólica e/ou membrana, ou salvá-los a-80 ° C para uso futuro.

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Resultados

A Figura 2 mostra o particionamento de proteínas celulares do PNS na fracção solúvel citosólica (S) ou fração da pelota de membrana (P). Nós examinamos três linhas de celulares representativos de diferentes tipos de células: HEK-293 (epitelial), NIH-3T3 (fibroblasto) e Jurkat (linfócitos). Inibidor de dissociação de guanina Rho (RhoGDI) e o receptor de manose-6-fosfato cação independente (CIMPR) foram usados como controles positivos para citosólico e fracções...

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Discussão

As vantagens da cavitação de nitrogênio sobre outros métodos de ruptura mecânica são múltiplas. Talvez o benefício mais significativo é a sua capacidade para suavemente ainda eficientemente homogeneizar as amostras. Os princípios físicos de descompressão esfria amostras em vez de gerar danos de aquecimento local como ultra-som e fricção/corte com base em técnicas. A cavitação é também extremamente eficiente em rompendo a membrana plasmática. Porque o nitrogênio bolhas são geradas dentro de cada célula individual após a d...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo GM055279, CA116034 e CA163489.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Vaso de Ruptura Celular (45 mL)Instrumento Parr4639Bomba de cavitação de nitrogênio
Homogeneizador Dounce (2 mL)Kontes885300-0002Pilão e tubo Dounce
Seringa de Insulina U-100 28G½Becton Dickinson329461Agulha
Atg12 anticorpoSanta Cruz271688Camundongo anticorpo, uso em diluição 1:1000
β-anticorpo de actinaSanta Cruz47778Anticorpo de camundongo, uso em diluição 1:1000
β-tubulina anticorpoDSHBE7-sAnticorpo de camundongo, uso em diluição 1:5000
Anticorpo CalnexinaSanta Cruz23954Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo de calregulinaSanta Cruz373863Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo catalaseSanta Cruz271803Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo CIMPRAbcam124767Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
Anticorpo EEA1Santa Cruz137130Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
AnticorpoEGFR Santa Cruz373746Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo F0-ATPaseSanta Cruz514419Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo F1-ATPaseSanta Cruz55597Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
AnticorpofibrilarínicoSanta Cruz374022Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:200
Anticorpo Golgin 97Santa Cruz59820Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo HDAC1Santa Cruz81598Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo de hexoquinase 1Tecnologia de sinalização celular2024SAnticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
AnticorpoLamin A/CSanta Cruz376248Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo LAMP1DSHBH4A3-cAnticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Na+/K+ Anticorpo ATPaseSanta Cruz48345Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo Rab7Abcam137029Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
Rab9 anticorpoThermoMA3-067Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo RCAS1Santa Cruz398052Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo RhoGDISanta Cruz360Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:3000
Anticorpo da proteína ribossômica S6Santa Cruz74459Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo Sec61aSanta Cruz12322Anticorpo de cabra, uso em diluição de 1:1000
Tubo de ultracentrífuga de policarbonato de parede espessaBeckman Coulter349622Tubo de amostra para ultracentrifugação
Rotor TLK-100.3de 349481Beckman Coulterpara ultracentrifugação
Ultracentrífuga pessoal de alta capacidade Optima MAX Ultracentrífuga BeckmanCoulter364300
comprimidos de coquetel de inibidores de protease completosInibidoresdeprotease
Raspadores de células com cabo de 25 cm e lâmina de 3,0 cmRaspador de células grandesCorning353089
agitação magnéticaFisher Scientific14-513-57SIXmicro barra de agitação
Agitador magnético de topo cerâmicomagnéticode S504501ASFisher Scientific
Rotor 11697498001 Roche Barra de Agitador

Referências

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