Cavitação de nitrogênio e centrifugação diferencial permite o monitoramento da distribuição de proteínas de membrana periférica em culturas de células

Resumo

Aqui apresentamos os protocolos para homogeneização de detergente livre de células de mamíferos cultivadas com base no azoto cavitação e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Este método é ideal para monitorar o particionamento de proteínas de membrana periférica entre solúvel e fracções de membrana.

Resumo

As células cultivadas são úteis para estudar a distribuição subcelular de proteínas, incluindo proteínas periféricas da membrana. Geneticamente codificado fluorescente etiquetadas proteínas revolucionou o estudo da distribuição Subcellular da proteína. No entanto, é difícil quantificar a distribuição com microscopia fluorescente, especialmente quando as proteínas são parcialmente citosólica. Além disso, muitas vezes é importante estudar proteínas endógenas. Bioquímicos ensaios tais como immunoblots permanecem o padrão ouro para quantificação da distribuição de proteínas após fracionamento subcelular. Embora existam jogos comerciais que visam isolar citosólica ou certas fracções de membrana, a maioria destes jogos é baseada na extração com detergentes, que podem ser inadequados para o estudo de proteínas de membrana periférica que facilmente são extraídas de membranas. Aqui nós apresentamos um protocolo livre de detergente para celular homogeneização por cavitação de nitrogênio e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Podemos confirmar a separação de organelas subcelulares em solúvel e pelota frações através de diferentes tipos de células e comparar a extração de proteínas entre vários métodos de homogeneização mecânica não baseados em detergente comum. Entre várias vantagens de azoto cavitação é a eficiência superior de ruptura celular com o mínimo de danos físico e químico para organelas delicados. Combinado com ultracentrifugação, cavitação de nitrogênio é um excelente método para examinar a mudança das proteínas de membrana periférica entre citosol e membrana fracções.

Introdução

Proteínas celulares podem ser divididas em duas classes: aqueles que estão associados com membranas e aqueles que não são. Non-membrana proteínas associadas são encontradas no citosol, nucleoplasma e lumina de organelas como o retículo endoplasmático (ER). Existem duas classes de proteínas de membrana-associado, integrais e periféricas. Proteínas integrais da membrana são também conhecidas como proteínas transmembrana porque um ou mais segmentos da corrente do polypeptide atravessa a membrana, normalmente como um composto de aminoácidos hidrofóbicos α-hélice. Proteínas transmembrana co-translationally são inseridas em membranas no decorrer de sua biossíntese e permane....

Protocolo

1. buffer e preparações de equipamento

1. Chill 45 mL célula rompimento bombas, tubos de 15 mL e tubos de ultracentrifugação em 4 ° C.
2. Preparar e relaxar 25 mL de tampão de homogeneização por 2 x 10 ⁷ células em 4 ° C. adicionar uma protease inibidor tablet imediatamente antes da utilização.
   Nota: Buffers de homogeneização normalmente contêm KCl ao invés de NaCl para melhor refletir a composição intracelular de sal. Tampão de homogeneização utilizado neste protocolo consiste de 10 mM HEPES pH 7,4, 10 mM KCl e 1,5 mM de MgCl ₂ (adiante designado como tampão de homogeneização hipotônica). A maioria dos amortecedores podem s....

Resultados

A Figura 2 mostra o particionamento de proteínas celulares do PNS na fracção solúvel citosólica (S) ou fração da pelota de membrana (P). Nós examinamos três linhas de celulares representativos de diferentes tipos de células: HEK-293 (epitelial), NIH-3T3 (fibroblasto) e Jurkat (linfócitos). Inibidor de dissociação de guanina Rho (RhoGDI) e o receptor de manose-6-fosfato cação independente (CIMPR) foram usados como controles positivos para citosólico e fracções.......

Discussão

As vantagens da cavitação de nitrogênio sobre outros métodos de ruptura mecânica são múltiplas. Talvez o benefício mais significativo é a sua capacidade para suavemente ainda eficientemente homogeneizar as amostras. Os princípios físicos de descompressão esfria amostras em vez de gerar danos de aquecimento local como ultra-som e fricção/corte com base em técnicas. A cavitação é também extremamente eficiente em rompendo a membrana plasmática. Porque o nitrogênio bolhas são geradas dentro de cada célula individual após a d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vaso de Ruptura Celular (45 mL)	Instrumento Parr	4639	Bomba de cavitação de nitrogênio
Homogeneizador Dounce (2 mL)	Kontes	885300-0002	Pilão e tubo Dounce
Seringa de Insulina U-100 28G½	Becton Dickinson	329461	Agulha
Atg12 anticorpo	Santa Cruz	271688	Camundongo anticorpo, uso em diluição 1:1000
β-anticorpo de actina	Santa Cruz	47778	Anticorpo de camundongo, uso em diluição 1:1000
β-tubulina anticorpo	DSHB	E7-s	Anticorpo de camundongo, uso em diluição 1:5000
Anticorpo Calnexina	Santa Cruz	23954	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo de calregulina	Santa Cruz	373863	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo catalase	Santa Cruz	271803	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo CIMPR	Abcam	124767	Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
Anticorpo EEA1	Santa Cruz	137130	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo	EGFR Santa Cruz	373746	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo F0-ATPase	Santa Cruz	514419	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo F1-ATPase	Santa Cruz	55597	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo	fibrilarínicoSanta Cruz	374022	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:200
Anticorpo Golgin 97	Santa Cruz	59820	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo HDAC1	Santa Cruz	81598	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo de hexoquinase 1	Tecnologia de sinalização celular	2024S	Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
Anticorpo	Lamin A/CSanta Cruz	376248	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo LAMP1	DSHB	H4A3-c	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Na+/K+ Anticorpo ATPase	Santa Cruz	48345	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo Rab7	Abcam	137029	Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:1000
Rab9 anticorpo	Thermo	MA3-067	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo RCAS1	Santa Cruz	398052	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo RhoGDI	Santa Cruz	360	Anticorpo de coelho, use na diluição de 1:3000
Anticorpo da proteína ribossômica S6	Santa Cruz	74459	Anticorpo de camundongo, use na diluição de 1:1000
Anticorpo Sec61a	Santa Cruz	12322	Anticorpo de cabra, uso em diluição de 1:1000
Tubo de ultracentrífuga de policarbonato de parede espessa	Beckman Coulter	349622	Tubo de amostra para ultracentrifugação
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