Ultrasonografia em investigações de reprodução Experimental em ratos

Resumo

Este manuscrito descreve a utilidade do ultra-som realizado em ratos fêmeas para projetar modelos experimentais para investigação ginecológica e reprodutiva. Uma explicação passo a passo de como realizar a avaliação ultra-sonográfico é mostrada.

Resumo

Com o desenvolvimento da tecnologia de reprodução assistida e as limitações éticas da investigação em humanos, modelos animais de rato foram amplamente utilizados na medicina reprodutiva. No passado, o estudo do desenvolvimento do sistema reprodutivo em roedores baseou-se no único exame histológico dos tecidos extirpados. Recentemente, com o desenvolvimento do ultra-som transabdominal de alta resolução, alta qualidade ecografia agora pode ser realizada para avaliar os órgãos reprodutivos de ratos, permitindo que um novo método para estudar o sistema reprodutivo. Imagens foram obtidas utilizando um sistema de alta resolução e ultra-sonográficos. Ultrasonografia ginecológica foi a 28 ratos não-grávida de oito semanas de idade e 5 ratos de Sprague-Dawley grávidos. Descrevemos como reconhecer os órgãos do sistema reprodutor e estruturas associadas no típicas vistas durante as diferentes fases do estro do ciclo. Cor de fluxo que Doppler foi usado para medir o fluxo de sangue da artéria uterina e avaliar as mudanças de padrão do fluxo de sangue uterino durante diferentes estágios da gravidez. Temos demonstrado que a exploração de ultra-som é um método útil para avaliar alterações nos órgãos reprodutivos internos. Seu uso aumenta a possibilidade de realização de experiências adicionais, incluindo procedimentos médicos ou cirúrgicos e fornece a capacidade para monitorar alterações sonográfico órgãos internos sem sacrificar animais.

Introdução

Modelos animais de rato têm sido amplamente utilizados em medicina reprodutiva, incluindo no embrião e transplante ovariano^1,2. No entanto, no passado, o estudo do desenvolvimento do sistema reprodutivo em roedores tem sido baseado em one-time exame histológico dos tecidos extirpados, e o estudo longitudinal de mudanças do dia-a-órgão reprodutivo não foi possível em ratos³. Ultrasom tem sido amplamente utilizada em tecnologia reprodutiva assistida em seres humanos há mais de 30 anos, mas esta tecnologia valiosa só foi aplicada aos ratos recentemente.

Nosso objetivo foi estabelecer uma abordagem ultra-sonográficos para avaliar os órgãos reprodutivos de ratos Sprague-Dawley para projetar modelos experimentais para a investigação de reprodução e Ginecologia e para demonstrar o procedimento porque a nosso conhecimento, Não há nenhuma publicação visualizada atual sobre este procedimento. Descrevemos o procedimento de exame ultra-sonográfico do sistema reprodutivo feminino do rato e achados ultra-sonográficos presentes na anatomia e o fluxo de sangue de artéria uterina usando ultra-som de alta definição. Temos monitorado as características do endométrio, ovários e fluxo de sangue da artéria uterina em animais não-grávidas em diferentes estágios do ciclo do estro para avaliar as diferenças significativas na espessura endometrial, Morfologia ovariana e fluxo de sangue uterino em diferentes fases do ciclo do estro, semelhante às mulheres. Usamos equipamentos de ultra-som de alta qualidade com uma frequência de 70 MHz e um nível de resolução de 30 µm. Nosso outro objetivo foi avaliar as alterações na resistência do fluxo de sangue uterino em ratos grávidos. Esta técnica permite o estudo das alterações diárias em órgãos reprodutivos sem sacrificar animais.

Existem várias dificuldades técnicas na utilização de ultra-som em ratos. Estas dificuldades incluem: o endométrio de rato é muito mais fino que uma fêmea humana⁴. Dificuldade em imagens os ovários dos ratos tem sido atribuída a pele mais espessa e a musculatura da parede abdominal em ratos, o que resultou na quase completa atenuação do ultra-som⁵, e a artéria uterina é muito mais difícil de encontrar em não-grávidas ratos. Nós resolvemos muitos problemas técnicos com o procedimento, e para aqueles problemas que permanecem, mostramos como minimizá-los.

Sucesso monitoramento sonográfico mudanças nos órgãos reprodutivos de ratos sem a necessidade de sacrificar animais abrirá a possibilidade de construção de futuros modelos animais de medicina reprodutiva e outros procedimentos cirúrgicos.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e de acordo com a chegada (pesquisa Animal: relatando as experiências em Vivo) orientações. O protocolo recebeu uma licença para experimentação animal, em conformidade com a Directiva 2010/63/UE com o número de autorização de A13170404 (Anexo 1). Todos os experimentos foram realizados em um laboratório certificado da União Europeia, seguindo as diretrizes nacionais de tratamento ético de animais (RD 53/2013, UE directiva 63/2010). O protocolo foi aprovado pelo Comité de ética de experimentos Animal da Universidade de Múrcia.

1. preparação animal

Nota: Todos os experimentos foram apoiados da seção de Experimentação Animal de Murcia Universidade e obstetrícia e Ginecologia departamento de Múrcia Universidade.

1. Use 8 ratos Sprague Dawley semanas (28 ratos fêmeas) pesando 200-250 g em todos os experimentos.
   Nota: Aqui, também usamos 5 ratos grávidos.
2. Para obter ratos grávidos, gaiola de ratos do sexo masculino femininos e fértil oito semanas de idade e companheiro de 17:00 -23:00 h. identificação de um tampão vaginal na manhã seguinte foi interpretado como acasalamento de sucesso. Considere 1 dia de gestação, no dia seguinte, depois que eles foram acasalados.
3. Realizar os experimentos no 9, 15 e 18 dias de gestação.
4. Ratos de casa em grupos de dois, com livre acesso à comida e água e mantêm-se em ciclos de regular 12 h claro/escuro.
5. Depois de aclimatar-se as condições de instalação para um mínimo de duas semanas, use citologia vaginal diária de manhã para avaliar para a regularidade e a frequência de cio.
   Nota: Vinte e oito ratos com uma fase de estro do dia normal de 4 a 5 foram selecionados para inclusão no estudo.

2. preparação de ratos para a imagem latente

Nota: Imagens foram obtidas utilizando a ultra-sonografia transabdominal de alta resolução. Fases do ciclo estral foram determinadas pela citologia de esfregaço vaginal.

1. Antes do estudo da imagem, anestesia a barragem na câmara de indução com gás de isoflurano de 2-3%.
2. Remover o animal e imediatamente coloque o focinho dentro de um cone de nariz conectado ao sistema de anestesia e manter o animal em 1,5 a 2% de isoflurano durante o exame ultra-sonográfico.
3. Retire a pele da margem costal no abdómen caudal com tesouras e creme depilatório.
4. Coloque o rato anestesiado em posição supina sobre uma mesa aquecida para proteger o rato e garantir melhor conforto e manutenção dos parâmetros fisiológicos para a duração da sessão de imagens. Todos os parâmetros fisiológicos devem ser integrados com as imagens e dados capturados em tempo real através da aplicação de ultra-som.
5. Delicadamente, inserir uma sonda rectal (após lubrificação) para monitorar a temperatura do corpo (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
6. Coloque o transdutor (30 Hz) em um suporte fixo e movê-lo ao longo do eixo vertical e o eixo horizontal (para a frente para trás e lado) usando um joystick operado manualmente ou com a mão.
7. Aplique o bálsamo oftálmico à base de petróleo para os olhos do rato para evitar a secagem durante o procedimento.

3. procedimento de exame

Nota: Anatomia de órgãos reprodutivos de rats´: A vagina fica dorsal para a bexiga urinária e se divide em dois cornos uterinos que se estendem na direção dos rins. Os ovários estão conectados os cornos uterinos através os ovidutos (Figura 1). O útero está localizado na região posterior para os rins.

1. Identificação do útero
   1. Usando a bexiga como um marco para encontrar o colo do útero, siga o colo do útero para encontrar o ramo dos chifres uterinos direita e esquerdos.
   2. Alterne para a visualização bidimensional/vídeo selecionando a "modalidade B". Medir o diâmetro antero-posterior de cada corno uterino na região da meados de-isthmic em uma imagem sagital mediana. Detecta as medições utilizando o software de sistema ultra-sonográficos.
   3. Medir a espessura endometrial de ecogénica fronteira a fronteira ecogénica em toda a cavidade endometrial em uma imagem sagital mediana na modalidade"B".
   4. Alterar para o modo Doppler cor selecionando "Color Doppler". Use cor Doppler para identificar a fonte de sangue do endométrio e medir o fluxo de sangue do endométrio. Selecione os seguintes parâmetros no modo Doppler cor: filtro passa-alta ajustado a 4 Hz, conjunto de frequência pulsada repetição entre 4 e 48 kHz e Doppler pulsado portão situado entre 0,2 a 0,5 mm.
2. Identificação do fluxo de sangue da artéria uterina
   1. Obter o Doppler na artéria uterina perto da margem lateral inferior da junção utero-cervical perto da artéria ilíaca em cada lado das formas de onda.
   2. Use os seguintes parâmetros no modo Doppler: filtro passa-alta ajustado a 6 Hz, conjunto de frequência pulsada repetição entre 4 e 48 kHz e Doppler pulsado portão situado entre 0,2 a 0,5 mm.
   3. Tome cuidado para alinhar o fluxo de sangue e o feixe Doppler para minimizar o ângulo Doppler. Grave o ângulo entre o feixe Doppler e do navio. Valores tomados para além de um ângulo de 60° são imprecisas e devem ser evitada,⁶.
   4. Medir a velocidade de pico sistólico (PSV) e velocidade final-diastólica (EDV) de três ciclos consecutivos. Em seguida, calcular a pressão sistólica diastólica relação (S/D) (PSV/EDV) e índice de resistência (RI) ([PSV-EDV] / PSV) valores para cada corno uterino.
   5. Medir o fluxo de sangue da artéria uterina de 5 ratos grávidos durante o 9^th, 15^th, 18^° dia de gestação.
3. Identificação do ovário e o fluxo de sangue da artéria ovárica
   Nota: O rato fêmea ovários estão localizados lateral para os rins em ambos os lados do animal e residir em almofadas de gordura encontradas na extremidade da trompa uterina (Figura 1).
   1. Imagem do ovário, começar com a sonda em um plano transversal e colocá-lo na face lateral do animal ligeiramente abaixo das costelas. O rim e a almofada de gordura têm uma aparência de hiperecoico em comparação com o ovário.
   2. Medir o limite externo do ovário e folículos. Números na escala para cada imagem são em milímetros, com incrementos de 0,1 mm.
      Nota: Imagem de cor de modo Doppler e Power Doppler ajuda com identificação da intensidade dos ovários e fluxo direcional.

4. desenho do estudo

1. Verifique o ciclo estro por citologia de esfregaço vaginal.
2. Divida todos os ratos em dois grupos. Para o grupo 1 ou pre-fértil (ou periovulatory), incluem os ratos que estavam no proestro e estro as fases do ciclo. Para o grupo 2 ou pós-férteis, incluem os ratos que estavam no diestro cedo e tarde diestro fases do ciclo.
3. Monitorar e comparar o diâmetro antero-posterior de cada corno uterino na região médio-isthmic de grupos 1 e 2.
4. Monitorar e comparar a espessura endometrial e as características do endométrio nos grupos 1 e 2.
5. Monitorar e comparar o tamanho (diâmetro máximo) e as características dos ovários e localizar qualquer folículos periovulatory em ambos os ovários em grupos 1 e 2.
6. Monitorar e comparar o fluxo de sangue da artéria uterina nos grupos 1 e 2.
7. Monitorar e comparar o fluxo de sangue da artéria uterina de ratos grávidos em diferentes estágios de gestação (dias 9, 15 e 18 de gestação).
8. Executar análises estatísticas usando SPSS. Apresentar dados como a média ± desvio-padrão (SD) ou mediana com faixas de percentis. Analise os resultados usando o teste t de Student entre os diferentes grupos. Um P-valor de menos de 0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Lá não houve diferenças significativas nos diâmetros antero-posterior corno uterino ou na espessura do endométrio entre os dois lados da trompa uterina (tabela 1). Comparado com o grupo 2, a espessura endometrial média no grupo 1 foi mais grossas, mas não significativas diferenças (P > 0,05) foram encontradas entre os dois grupos (Figura 3). No entanto, encontramos fluido no interior do útero (em 8 de 28 ratos) perto do ciclo do estro associado com alterações na morfologia do endométrio (Figura 2).

Estudos Doppler também não mostraram nenhuma mudança significativa no fluxo padrões de forma de onda de velocidade em cada lado da trompa uterina ou em diferentes fases do ciclo do estro em ratos não-grávidas (tabelas 1 e 2, Figura 4A). No entanto, em ratos grávidos, como gestação avançada, pico velocidades sistólica e diastólica final aumentadas significativamente e o índice de resistência calculado diminuiu significativamente (tabela 3, Figura 4B).

O diâmetro médio do ovário não foi significativamente diferente (tabela 1). Quando a morfologia do ovário foi comparada entre os dois grupos, foram vistos folículos periovulatories e líquido ao redor do ovário após a ovulação (tabela 2, Figura 2).

Figura 1 : Anatomia Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Medição da espessura endometrial (modo-B). A espessura do endométrio (linha azul) (A). Os diâmetros antero-posterior corno uterino (grande linha azul) e a espessura do endométrio (linha azul curto) durante o cio do ciclo (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : (A) medida do diâmetro do ovário esquerdo; (B) ovário e folículos durante a fase de estro.

Figura 4 : Medição do fluxo de sangue da artéria uterina. (A) fluxo de sangue da artéria uterina em ratos não-grávidas. (B) fluxo de sangue da artéria uterina no 15 ^º dia de ratos grávidos.

(P > 0,05, não há diferença significativa em cada grupo). SD: DesviationPSV padrão: velocityEDV sistólica de pico: diastólica final velocityS/d: sistólica a diastólica ratioRI: índice de resistência. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Variável (mm±SD)	Lado esquerdo	Lado direito	Valor p.
Diâmetro de chifre (mm)	1.78±0.24	1.73±0.28	0.626
Espessura do endométrio (mm)	0.75±0.06	0.76±0.05	0.752
Diâmetro do ovário (mm)	3.69±0.52	3.62±0.32	0.107
Tamanho do folículo (mm)	1.68±0.31	1.74±0.29	0,859
PSV (mm/s)	91.52±17.91	93.07±22.87	0,055
EDV (mm/s)	34.18±9.36	36.67±11.14	0.178
S/D	2.78±0.59	2.62±0.50	0,294
RI	0.62±0.08	0.60±0.08	0.876
(P > 0,05, não há diferença significativa em cada grupo).
SD: Desvio padrão
PSV: velocidade sistólica pico
EDV: velocidade diastólica final
S/d: sistólica diastólica relação
RI: índice de resistência. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tabela 1: As diferenças no ovário e trompa uterina direita e esquerda.

Variável (mm±SD)	Fase de estro (Grupo 1)	Non-estro fase (Grupo 2)	P.Value
Diâmetro de chifre (mm)	1.71±0.18	1.83±0.23	0.433
Espessura do endométrio (mm)	0.78±0.04	0.72±0.05	0.168
Diâmetro do ovário (mm)	3.71±0.56	3.66±0.47	0.515
PSV (mm/s)	92.05±17.93	94.15±20.62	0.886
EDV (mm/s)	37.81±9.64	34.72±5.38	0,096
S/D	2.61±0.58	2.77±0.44	0.249
RI	0.60±0.08	0.63±0.06	0.232
(P > 0,05, não há diferença significativa em cada grupo).
SD: Desvio padrão
PSV: velocidade sistólica pico
EDV: velocidade diastólica final
S/d: sistólica diastólica relação
RI: índice de resistência. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tabela 2: As diferenças entre as fases do ciclo estral diferente em ratos não-grávidas.

Variável	D9	D15	D18	Valor de P
PSV(mm/s)	111.08±5.93, b	122.64±7.49c	131.91±3.50	< 0.05
EDV(mm/s)	38.80±3.37d, e	56.43±3.10f	79.29±5.47	< 0.05
S/D	2.87±0.12g, h	2.17±0.16eu	1.67±0.14	< 0.05
RI	0.65±0.02 j, k	0.54±0.04L	0.39±0.05	< 0.05
PSV = pico de velocidade sistólico
EDV = velocidade final-diastólica.
S/D = sistólica diastólica relação (PSV/EDV).
RI = índice de resistência ((RI) = ([PSV – EDV] / PSV).
D9 = 9 dias de gestação
D15 = 15 dias de gestação
D18 = 18 dias de gestação
SD: os erros indicam o desvio padrão (±).
(P < 0,05, não há diferença significativa em cada grupo)
Valor de P: D9 vs D15 um = 0,03; d = 0,001; g = 0,01; j = 0,01. D9 vs D18 b = 0,003; e = 0,001; h = 0,01; k = 0,001. D15 vs D18 c = 0,03; f = 0,001; Eu = 0,03; L = 0,04.

Tabela 3: As diferenças no fluxo de sangue da artéria uterina em ratos grávidos.

Discussão

Devido as modificações processuais e solução de problemas que foi necessário neste estudo, apesar de nosso objetivo de identificar todas as fases do estro ciclo em ratos usando ultra-som, fomos capazes de encontrar diferenças significativas. Nós hypothesize que estas dificuldades podem ser porque o ciclo estro dura apenas alguns dias em ratos, ao contrário do ciclo em mulheres. Temos a certeza de que todas as medições foram feitas na hora certa para determinar quaisquer diferenças. Portanto, nós se reagruparam o estro as fases do ciclo em apenas duas fases para avaliar diferenças eventuais, mas não foram observadas. Como esperado, não encontramos nenhuma diferença significativa entre as medições de cada corno uterino, o que nos permitirá escolher qualquer chifre para realizar as medições no futuro. Estudos sobre os efeitos do uso de isoflurano em roedores são contraditórios. Pode ser teratogênico, mas só se administrado em concentrações de anestésicas durante muitas horas ou vários dias. Na nossa experiência, o tempo de exame nos ratos grávidos foi menos de 30 min, então não encontramos quaisquer efeitos adversos em qualquer grávidos ratos ou seus descendentes.

Gostaríamos de ter encontrado mais semelhanças com avaliação de ultra-som do aparelho reprodutor nas mulheres, em que existem ecogénica claras diferenças entre a fase folicular, periovulatory e fases secretoras, mas essas alterações não foram observadas em ratos modelo. Este fato pode ser explicado porque o estro rato ciclo fases só dura quatro a cinco dias. Estro curto períodos de gestação e as fases do ciclo fazer o rato um animal ideal para pesquisa sobre reprodução⁵. No entanto, este fato pode ser a razão por que não há nenhuma diferença significativa no diâmetro do corno uterino, espessura endometrial e ovariano diâmetro nas fases de cio e não-estro. É difícil tirar as medidas exatamente a hora certa para verificar as diferenças, e apesar de tomar medidas todos os dias, não encontramos alterações significativas.

Apesar das limitações acima, propomos a utilização da ultra-sonografia para monitorar as alterações no sistema reprodutivo, incluindo a espessura e a morfologia de órgãos reprodutivos. Podemos afirmar esta utilização da ultra-sonografia porque a espessura do endométrio em 8 semanas de idade Sprague-Dawley ratos medida histopatologicamente (uma camada 359.13 ± 49,70 mm) por Jing et al ⁷ é semelhante aos resultados aqui. Apesar das diversas técnicas para medir a espessura endometrial histopatologicamente e sonographically, obtivemos resultados semelhantes. Poder Doppler e color Doppler tem sido usado em ratos grávidos, para vários anos^8,9, há poucas investigações medindo o fluxo de sangue da artéria uterina em ratos não-grávidas. Agora, com o desenvolvimento da ultra-sonografia, nós pode tirar proveito desta técnica para monitorar mudanças no tracto reprodutivo durante cada fase diferente, mesmo no início da gravidez.

Futuras aplicações de ultra-som podem incluir a exploração do tratamento de endométrio fino e o mecanismo de implantação do embrião em modelos animais de rato. Além disso, através do acompanhamento das características do desenvolvimento de folículos, podemos obter conhecimento mais abrangente sobre a sua função em um modelo de transplante ovariano. Atualmente, existem poucas investigações usando imagem em 3D e ultra-sonografia molecular do sistema reprodutivo de ratos¹⁰, e vamos aplicar esta técnica em um modelo de endométrio fino no futuro.

Podemos tirar a conclusão de que o rato é um modelo adequado para o estudo da dinâmica de órgão reprodutor usando ultra-som transcutâneo bio-microscopia, que não exige o sacrifício do animal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de micro-imagem in vivo de alta resolução Vevo3100*	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Sistema ferroviário integrado Vevo, incluindo unidade de monitoramento fisiológico.	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
MX400 Transdutor	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD	Envigo, inc.		Gel Lubrificante para Tensão de Rato
	General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Sistema de Carrinho de Anestesia	Cibertec S.A		Máquina de anestesia
Ecogel 100 gel de ultrassom	Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Loção depilatória (Nair)	Fornecimento
de isoflurano			Anestesia inalatória
* O software necessário é o software Vevo, incluindo o aplicativo B-Mode, o aplicativo Doppler de onda de pulso e o pacote de ferramentas de análise de tensão vascular.

geral Esteve veterinária