Artigo de método

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

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DOI:

10.3791/56056

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25 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.

Resumo

Propriedades mecânicas da matéria mole complexa, à base de polímero, tais como células ou redes de biopolímero, podem ser entendidas em nem o quadro clássico de polímeros flexíveis nem de hastes rígidas. Filamentos subjacentes permanecem estendidos devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo, que é quantificada através do comprimento de persistência (l.p), mas eles também estão sujeitos a fortes flutuações térmicas. Sua rigidez de flexão finito leva a mecânica coletiva única, não-trivial de redes em massa, permitindo a formação de andaimes estáveis em frações de baixo volume, proporcionando grande malha tamanhos. Este princípio subjacente é prevalente na natureza (por exemplo, em células ou tecidos), minimizando o alto teor molecular e facilitando difusiva ou transporte ativo. Devido a suas implicações biológicas e potenciais aplicações tecnológicas em hidrogel biocompatível, semiflexível polímeros têm sido objecto de estudo considerável. No entanto, investigações compreensíveis permaneceram desafiadoras desde que eles dependiam de polímeros naturais, tais como os filamentos de actina, que não são livremente ajustáveis. Apesar dessas limitações e devido à falta de polímeros sintéticos, mecanicamente ajustáveis e semiflexível, filamentos de actina estabeleceram-se como sistema comum de modelo. Uma grande limitação é que a quantidade central lp não pode ser livremente ajustado para estudar seu impacto nas estruturas macroscópicas em massa. Esta limitação foi resolvida empregando estruturalmente programáveis nanotubos de DNA, permitindo a alteração controlada de rigidez do filamento. Eles são formados por projetos baseados em azulejo, onde um conjunto discreto de costas parcialmente complementares cruzar em uma estrutura em anel com uma circunferência discreta. Estes anéis apresentam extremidades pegajosas, permitindo a efetiva polimerização em filamentos vários microns de comprimento e exibir semelhante cinética de polimerização como biopolímeros naturais. Devido à sua mecânica programável, estes tubos são ferramentas versátil, a novela para estudar o impacto da lp a único-molécula, bem como a escala em massa. Em contraste com os filamentos de actina, eles permanecem estáveis durante semanas, sem degeneração notável, e sua manipulação é comparativamente simples.

Introdução

Devido os comportamentos complexos habilitados por suas propriedades mecânicas únicas, semiflexível polímeros são blocos de construção fundamentais da matéria viva. Em contraste com polímeros flexíveis, polímeros semiflexível adotam uma configuração estendida devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo enquanto ainda permanecem sujeitas a fortes flutuações térmicas1. Assim, modelos estocásticos puramente não podem ser aplicados a seus comportamentos, como com os extremos de polímeros totalmente flexíveis ou rígidos. A cadeia de tipo worm chamado modelo2,3,4 foi desenvolvido para quantificar essa rigidez através a lp, que é a constante de decaimento da correlação tangente-tangente ao longo do filamento de4. Se lp é comparável ao comprimento de contorno (l.c) do filamento, o polímero é considerado semiflexível1. Análogo aos polos de uma tenda, seus arranjos em redes ou feixes estabiliza todo o sistema coletivo em frações de baixo volume, levando a incomum viscoelástico propriedades5,6,7, 8,9. Essas estruturas fornecem altas elasticidades em grande malha tamanhos10, mantendo a integridade mecânica enquanto ainda facilitando difusiva e processos de transporte ativo. Esta propriedade é especialmente indicada para sistemas biológicos, tais como o citoesqueleto ou a matriz extracelular, mas é também amplamente utilizado na engenharia de alimentos1,11,12.

Indo além da sua importância com a matéria viva, é fundamental examinar exaustivamente as propriedades físicas destas estruturas a fim de ter as ferramentas para desenvolver materiais biomimético ou hidrogel romance. Em termos de polímeros semiflexível, isto implica a determinação sistemática das propriedades coletivas de redes resultantes de filamento único propriedades como lp e o desenvolvimento de um quadro teórico descritivo. Em estudos pioneiros, a actina biopolímero celular foi estabelecida como um sistema modelo para polímeros semiflexível e é ainda considerada o padrão-ouro5,13,14,15 , 16 , 17. no entanto, estudos exaustivos são limitados com este sistema, desde que eles são obrigados às propriedades inerentes desta proteína. Diversas abordagens teóricas têm visa construir uma descrição dos comportamentos não-trivial mecânicas a nível de filamento único e conduziram a notavelmente diferentes previsões dimensionamento para a dependência o módulo de cisalhamento do planalto elástica linear, G de 0 (ou seja, a "elasticidade" da rede), no que diz respeito a concentração (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Enquanto o dimensionamento de concentração é prontamente acessível em experimentos com actina-based ou outros sistemas modelo e enquanto predições teóricas têm sido rigorosamente verificados13,16,24, 25, o dimensionamento em relação ao lp manteve-se experimentalmente inacessível. Isto, porém, é uma limitação principal desde lp também é uma variável independente que é a definição quantidade de polímeros semiflexível.

Esta central, natural limitação imposta pelo fixo lp de actina ou outros polímeros derivados biologicamente como colágeno recentemente foi resolvida empregando tubos telha-baseado de DNA, que são ajustáveis em suas propriedades mecânicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeiras variações nas arquiteturas dos tubos (por exemplo, números diferentes do DNA constituinte vertentes dentro do anel de unidade) produzem valores distintos para lp, que pode ser avaliada através de microscopia de fluorescência, analisando um tubo flutuante ou avaliando as configurações curvas de vários tubos aderidas, como descrito anteriormente9,28. Essas análises revelaram que valores dep ldas populações diferentes de tubo variam ao longo de mais de uma ordem de magnitude e que técnicas de avaliação diferentes produzem resultados consistentes9,28.

Surpreendentemente, a escala global do planalto elástica linear cisalhamento módulo G0 em relação à concentração e lp foi relatada para ser inconsistente com todas as abordagens teóricas anteriores 9, em particular, demonstrando um muito mais forte do que o previsto dependência lp. Esses achados enfatizam o valor de um novo sistema de modelo para estudar as propriedades centrais de polímeros semiflexível. Empregando n-tubos de DNA de hélice dramaticamente amplia o escopo destas investigações. Não só pode lp ser variado livremente sem alterar o material básico, mas a natureza inerente programável do DNA pode permitir o exame sistemático dos elementos adicionais, tais como as referências cruzadas ou processos cinéticos de comutação. Além disso, estes tubos são solúveis em água e, em contraste com a maioria das proteínas, estável em pH adequado e condições iônicas por várias semanas, sem degradação detectável9.

Para montar estes tubos, é utilizado um conjunto de oligonucleotídeos de DNA, cada uma das quais contém dois domínios que compartilham sequências base complementares às duas vertentes vizinhas (devido as sequências específicas, um único fio não pode formar estruturas como pinos de cabelo). As sequências complementares cruzam de forma cíclica, formando anéis fechados, metade-sobreposição de dupla-hélice segmentos n interligados (figura 1A e B). Estes formam anéis em um discreta de diâmetro (Figura 1) e sua configuração de meia-sobreposição expõe axiais extremidades pegajosas complementares às extremidades pegajosas de outro anel. Esta adição seletiva de correspondência oligonucleotides desencadeia um empilhamento dos anéis, levando à polimerização eficaz de filamentosas tubos de hélice de DNA de tamanho n (n-HT). Seus comprimentos contornos tipicamente medem vários microns de comprimento, e sua distribuição de comprimento é comparável de actina filamentos9,26,,27,28. Tem sido demonstrado para nanotubos de DNA semelhantes que eles de fato apresentam cinética de polimerização semelhante dos microtúbulos e filamentos de actinaclasse p = "xref" > 29. Dependendo o número n de cadeias de ADN individuais que compõem a estrutura básica do anel, a arquitetura nHT, bem como a sua circunferência e diâmetro, podem ser botija variados. Usar mais de DNA aumenta a circunferência dos tubos/anéis, e a correspondente alteração arquitetônica desloca as propriedades mecânicas para valores mais elevados dep l(Figura 1), correspondente a uma maior rigidez. Na escala mesoscópica, estes grandes valores dep ltraduzem em conformações menos dobradas devido a rigidez superior (Figura 1 e E).

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Protocolo

1. preparação de n HTs

Nota: aqui, n denota o número de diferentes cadeias de DNA simples envolvidos na formação dos tubos de um determinado tamanho de hélice. Para n = 8, oito diferentes cadeias de DNA simples compõem um anel unidade.

  1. Sequências de DNA de compra (grau de pureza HPLC ou superior) de uma síntese de DNA adequada para o serviço ou realizar a síntese de alta qualidade e purificação (sequências exemplares indicadas na tabela 1).
  2. Oligonucleotides Ressuspender liofilizado em água purificada e siga a ressuspensão mais passos indicados no manual correspondente da companhia. Ajustar a quantidade de água para obter uma concentração final de 200 µM.
  3. Determinar concentrações do DNA único vertentes para verificar os valores indicados pelo distribuidor (por exemplo, através de espectroscopia de UV-Vis em 260 nm) desde a estequiometria exata é crucial para o processo de montagem. Calcular a concentração dos oligonucleotides, tendo em conta o peso específico molar e coeficiente de extinção para cada single-stranded do oligonucleotide de DNA.
    Nota: Os valores do coeficiente de extinção inerentemente variam para as sequências diferentes e são demonstrados na documentação do DNA adquirido comercialmente. Eles também podem ser calculados de acordo com o modelo de vizinho mais próximo, usando uma série de ferramentas on-line disponíveis gratuitamente. Para garantir a conformidade com a escala linear do espectrómetro, considerar-se diluir a amostra utilizada para determinação de concentração.
  4. Utilizando uma micropipeta, misturar o DNA vertentes-cada na mesma concentração-em um recipiente apropriado para o thermocycler (por exemplo, um tubo PCR de 200 µ l) formar o desejado n HTs (condições de buffer final: 1xTE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8) e 12.5 mM MgCl 2).
    Nota: Amostras de DNA Final n HT consistem em n - 1 fios, U 1 − U n − 1 e um fio de n T. A concentração por fio pode variar de sub-micromolar para mais de 10 µM, dependendo das necessidades do usuário (por exemplo, < 1 µm por vertente para a diluição subsequente observar filamentos simples ou concentrações mais elevadas para o exame de mecânica de rede densa).
  5. Cruzar o n HTs em um thermocycler (desnaturação por 10 min a 90 ° C, com uma queda rápida subsequente a 65 ° C; temperatura lenta diminuição de 65 ° C a 55 ° C, com emparelhamento base complementar em 20 passos de temperatura de-0,50 K por 30 min cada; e uma rápida queda de 55 ° C a 20 ° C); Ver Figura 2A.
    Nota: Os passos de diminuição lenta de 65 ° C podem ser alongados para aumentar o comprimento médio do tubo; no entanto, a subsequente queda rápida a 20 ° C é fundamental para evitar a agregação dos tubos polimerizados.
  6. Armazenar o hibridizadas n HTs por até 3 semanas a 4 ° C, sem degradação detectável.
    Nota: Para fluorescência microscopia, rotulada n HTs são hibridizados substituindo (parcialmente) U1 com o U1-Cy3 modificado (tabela 1). Para tempos mais longos de observação, a adição de agentes antibranqueamento estabelecidas é aconselhável.
  7. Cuidadosamente diluir a amostra para a concentração final desejada (por exemplo, 4 µM para redes ou 20 nM para observações de filamento único) usando o buffer de amostra, se necessário. Para minimizar as fontes de erro possível, montar amostras na concentração final desejada.

2. Reologia de cisalhamento

geometria
  1. escolher um apropriado (placa-placa ou cone-placa) para o rheometer cisalhamento dinâmico. Para volumes pequenos (ou seja, abaixo de 200 µ l), use a geometria cone-placa.
  2. Carregar a amostra sobre o cisalhamento dinâmico rheometer.
  3. Passivate interface ar-água da amostra e do ambiente, usando as seguintes etapas para evitar os efeitos de evaporação potencial.
    1. Cercam a amostra com 2,5 mL do banho de tampão de amostra.
    2. Adicionar um surfactante apenas abaixo da concentração micelle.
    3. Usar uma seringa Hamilton para cercar a amostra com um lipídio para evitar contato direto da amostra com ar.
  4. Selar a câmara de amostra com um boné equipado com esponjas molhadas e, se possível, com um banho de água adicionais (não em contato com a amostra) para mais suprimir evaporação.
  5. Iniciar a medição usando o software de rheometer específicos à temperatura ambiente; em alternativa, realizar a medição em temperaturas diferentes, tais como a 37 ° C (se são necessárias condições fisiológicas).
    Nota: Refrigerar a amostra é muitas vezes acompanhada pela condensação do vapor de água do ar circundante, enquanto o aquecimento leva a maior evaporação. Ambos os efeitos incontrolavelmente podem alterar a concentração da amostra, para que todas as medições em uma série devem ser executadas a uma temperatura constante.
  6. Permitir a amostra equilibrar para 2 h à temperatura ambiente. A evolução temporal pode ser monitorizada com uma varredura de tempo (dados de um ponto por minuto; tensão γ = 5 %); frequência f = 1 Hz).
  7. Mede as propriedades mecânicas com os protocolos do teste desejado. Comece com uma série de varreduras de frequência (f-varre) porque eles deixam a amostra intacta e permitir mais medições.
    Nota: Além disso, curto f-varreduras devem ser efectuadas antes e após as medições mais (tais como longo f-varre com uma resolução muito maior) para verificar que a amostra permaneceu inalterada durante todo o protocolo de medição completo.
    1. Realizar um curto f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; pontos de 5 dados por década).
    2. Realizar um longo f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 pontos de dados por década); o regime de baixa frequência pode ser omitido se não for necessário para reduzir o tempo de medição.
    3. Realizar um curto f-varredura.
    4. Executar uma varredura-γ (por exemplo, f = 1 Hz; γ = 0,0125% a 100%; pontos de 20 dados por década).
      Nota: Utilize o curto f - varrer primeiro, como é geralmente inconsistente com anterior f - varre porque redes geralmente ruptura durante a varredura-γ ou separar as chapas. Como alternativa, use o γ-rampa (por exemplo, = 0.025 s -1, t = 60 s); no entanto, as rampas normalmente requerem alterando o modo de motor, então subsequentes curto f-varreduras iria ser falsificadas.
  8. Bin e/ou liso, os dados brutos com um kernel Gaussian.

3. análise da fluorescência-assistida de DNA recozimento

  1. 8 preparar alíquotas de 12 µ l de cada amostra usando 1-4 µM DNA por vertente e 12,5 mM MgCl 2 em 1 x tampão TE 1x gel de ácido nucleico mancha de DMSO um 10.000 x estoque. Fazer um controle negativo sem DNA, mas incluem ácido nucleico gel mancha.
  2. Transferir as alíquotas para um prato PCR em tempo real e selar com película adesiva (por exemplo, uma placa de 96 poços de reação).
    Nota: As altas temperaturas, utilizadas em protocolos de recozimento térmico evaporará amostras. Assim, certifique-se que os poços são hermeticamente fechados com película adesiva para evitar o aumento de concentração e evaporação de água, particularmente durante as experiências a longo prazo.
  3. Centrifugar a placa a 100 x g por 1 min à temperatura ambiente para remover as bolhas de gás; se expandem as bolhas de gás, os poços não podem ser analisados.
  4. Carregar a placa selada em um sistema PCR quantitativo em tempo real.
  5. Executar um programa de recozimento. Desnaturar o DNA a 90 ° C por 10 min. soltar a temperatura rapidamente a 72 ° C. Então, diminua a temperatura lentamente por 0,5 ° C cada 30 min. Depois que o sinal está estragada, acelerar a rampa de temperatura.
    Nota: 72 ° C é suficientemente acima da temperatura real da hibridação; assim, o sinal é gravado sobre uma escala de temperatura larga apropriada para determinar a escala de temperatura necessário.
  6. Certifique-se de que a tampa do reciclador aquece a pelo menos 100 ° C para evitar a condensação da amostra evaporada sobre a película adesiva.
  7. Durante a montagem, excitar as amostras com um laser de argônio-íon em 488 nm e detectar a fluorescência em 550 nm quando usando uma mancha de gel de ácido nucleico (ou espectralmente semelhantes). Para outros corantes, escolha uma combinação adequada de excitação/emissão. Medir o sinal de fluorescência, sempre que possível para aumentar a total qualidade do sinal usando a built-in câmera.
    Nota: Aqui, as medidas foram tomadas todas as 9 s.
  8. Se derretendo predefinidos e recozimento programas são aplicados, use o software fornecido para analisar os dados. Se não, subtrair o valor médio anterior do valor médio para cada etapa de temperatura obter a mudança relativa do sinal fluorescente.

4. AFM Imaging

  1. Cleave mica (por exemplo, mica " V1 ") anexando comercialmente disponível de fita adesiva e rasgá-lo fora; a camada superior da mica deve ser removida.
  2. Utilizando uma micropipeta, depositar pré-formado n HT em Mg 2 + com solução tampão dobrável sobre a mica clivada fresco e deixá-lo resolver durante 10 min.
  3. Girar as amostras em intervalos curtos 3 s a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa pequena para remover o líquido restante. Vários n HTs ainda deve ser anexado à superfície de mica.
  4. Use uma ponta de cantilever com uma rigidez elevada (por exemplo, 54 Nm -1) e determinar a sua frequência de ressonância com o software interno do AFM.
  5. Registro do perfil de altura com o AFM no ar na batida modo de varredura baixas taxas (por exemplo, 1 linha/s) para evitar danificar ou deslocando o n HTS

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Resultados

A montagem dos nanotubos de DNA através de uma rampa de temperatura (Figura 2) é um método muito confiável para formar estes polímeros semiflexível artificiais. Estes polímeros têm características comparáveis aos seus homólogos naturais, tais como os filamentos de actina, mas fornecem um quadro experimental muito mais amplo, uma vez que suas propriedades mecânicas podem ser botija alterado9,27 . Como ...

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Discussão

Para obter corretamente formadas redes, reunir os nanotubos de DNA é um passo crucial. Erros durante o processo de síntese impactar negativamente a qualidade do tubo; Portanto, é recomendável que ser usado para purificar os oligonucleotides HPLC ou um processo mais rigoroso. Desde que a formação de discretos ao invés de agregados nanotubos de DNA, bem como sua distribuição de comprimento, depende da estequiometria equimolar dos oligonucleotides constituintes n dentro do conjunto, é necessário para remeasure as c...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos que o financiamento pelo DFG (1116/17-1) e da escola de Leipzig de ciências naturais "BuildMoNa" (GSC 185). Este trabalho foi apoiado através do projeto de Fraunhofer atrair 601 683. T. H. reconhece que o financiamento do Fundo Social Europeu (FSE-100077106).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AFM cantilever, ACTAAppNano
NanoWizard 3JPK
AndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
oligonucleotídeos do ADNBiomers.netPara sequências, veja a tabela 1
Oligonucleotídeos Cy3-marcados com ADNBiomers.netPara a sequência, consulte a Tabela 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Microscópio de epifluorescênciaLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm redondoPlano GmbH50-12
MicroAmp® Placa de reação óptica rápida de 96 poçosThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® Filme Adesivo ÓpticoThermo Fisher Scientific Inc.
Espectrofotômetro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Objetiva 100xLeica5506168
Água purificadaMerk Millipore - Milli-Q & Tubos de PCR Elix
SapphireGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070- Sistema de PCR em
7900HTApplied Biosystems4351405
ReômetroTA InstrumentsARES
SYBR® Coloração de gel de ácido nucleico verde IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Suprime a evaporação da amostra na interface ar-água
AFM - câmera do CCD dos instrumentos de, , , 43469074306311 Tempo Real Rápido Padrão

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