Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Resumo

Aqui, apresentamos um ensaio confiável e fácil para medir o teor de glicogênio em células cianobacterianas. O procedimento implica a precipitação, despolimerização selecionável e a detecção de resíduos de glicose. Este método é adequado para ambas as variedades de tipo selvagem e geneticamente modificado e pode facilitar a engenharia metabólica de cianobactérias.

Resumo

As cianobactérias acumulam glicogênio como um armazenamento intracelular importante de carbono e energia durante a fotossíntese. Desenvolvimentos recentes na pesquisa têm destacado mecanismos complexos de metabolismo de glicogênio, incluindo o ciclo diel de biossíntese e catabolismo, regulação redox e o envolvimento de ARN não codificante. Ao mesmo tempo, estão sendo feitos esforços para redirecionar o carbono do glicogênio aos produtos desejáveis ​​em cianobactérias geneticamente modificadas para aumentar os rendimentos do produto. Vários métodos são usados ​​para determinar os teores de glicogênio em cianobactérias, com precisões variáveis ​​e complexidades técnicas. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a determinação confiável do conteúdo de glicogênio em cianobactérias que podem ser realizadas em um laboratório padrão de ciências da vida. O protocolo implica a precipitação seletiva de glicogênio a partir do lisado celular e a despolimerização enzimática de glicogênio para gerar monómeros de glicose, que são detectados por um boi de glicoseIdase-peroxidase (GOD-POD) ensaio acoplado enzimático. O método foi aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, duas espécies modelo de cianobactérias que são amplamente utilizadas na engenharia metabólica. Além disso, o método mostrou com sucesso diferenças nos teores de glicogênio entre o tipo selvagem e mutantes defeituosos em elementos reguladores ou genes biossintéticos de glicogênio.

Introdução

As cianobactérias acumulam glicogênio como a principal reserva de carboidratos de carbono do CO ₂ fixado na luz através da fotossíntese. O glicogênio é um glicano constituído por glucano linear a-1,4-ligado com ramos criados por ligações de glucosilo ligadas a a-1,6. A biossíntese de glicogênio em cianobactérias começa com a conversão de glicose-6-fosfato em ADP-glicose através da ação seqüencial da fosfoglucomutase e da pirofosforilase de ADP-glicose. A fração de glicose em ADP-glucose é transferida para a extremidade não redutora do esqueleto a-1,4-glucano do glicogênio por uma ou mais sintases de glicogênio (GlgA). Posteriormente, uma enzima de ramifica....

Protocolo

1. Preparação

1. Cianobacterias
   1. Grow Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C em meio líquido BG11 ⁸ , com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO ₂ . Ilumine as culturas continuamente com luz em uma densidade de fluxo fotônico fotossintético de 50 μmol de fotão / m ² / s.
   2. Grow Synechococcus sp. PCC 7002 em meio líquido A + ²³ (meio BG11 também pode ser usado), com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO ₂ . A temperatura deve ser de 37 ° C. Ilumine as culturas continuamente com l....

Resultados

10 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 foram cultivados sob condições fotoautotróficas até o valor de OD _730nm atingir aproximadamente 0,8. As células foram colhidas e ressuspensas em Tris-HCl 50 mM, pH 8. O valor de _OD730nm foi ajustado para 2-3. O teor de glicogênio foi analisado seguindo o protocolo descrito acima. O teor de glicogênio por OD _730nm foi de 13 ± 1.8 μg / mL / OD _730nm ( N = 12). O teor de glicogênio em relação a.......

Discussão

Os passos críticos dentro do protocolo são a precipitação de glicogênio e ressuspensão. Após centrifugação após precipitação com etanol, o glicogênio forma uma pastilha translúcida que se adhere vagamente às paredes dos tubos de microcentrífuga. Portanto, ao remover o sobrenadante, é necessário prestar atenção especial para não remover o grânulo. O pellet de glicogênio é pegajoso, e a solubilização pode ser difícil se se dissolver. Note-se que a solubilização completa da pastilha de glicogênio é importante porque a solu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Leitor de Microplacas	de placas Eliza da	Molecular Devices	NA
Bullet Blender Storm Next	Advance	BBY24M-CE	Batedor de contas
Espectrofotômetro UV/Visível Ultrospec 3100 pro Espectrofotômetro	Amersham Biosciences	NA
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Tampão
HCl	Merck	1-00317	Ajuste de pH
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	32319	Tampão
amiloglicosidase (Rhizopus sp.)	Enzima Megazyme	E-AMGPU	para despolimerização de glicogênio
&alfa;-Amilase, termoestável (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzima para despolimerização de glicogênio
D-Glucose	Merch	8337	Padrão para o ensaio de glicose
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	Thermo Fisher scientific	23225	Para determinação de concentrações de proteína
Bandejas de secagem de alumínio, descartáveis	VWR	611-1362	Para determinação de pesos secos celulares
Kit de ensaio D-Glucose (formato GODPOD)	Megazyme	K-GLUC	Para determinação de concentrações de glicose
Pães de óxido de zircônio, 0,15 mm	Next Advance	ZrOB015	Grânulos para lise celular em um Tubos Bullet Blendar Storm
RINO	Tubos Next Advance	NA	para lise celular em um Bullet Blendar Storm

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