Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

As cianobactérias acumulam glicogênio como a principal reserva de carboidratos de carbono do CO ₂ fixado na luz através da fotossíntese. O glicogênio é um glicano constituído por glucano linear a-1,4-ligado com ramos criados por ligações de glucosilo ligadas a a-1,6. A biossíntese de glicogênio em cianobactérias começa com a conversão de glicose-6-fosfato em ADP-glicose através da ação seqüencial da fosfoglucomutase e da pirofosforilase de ADP-glicose. A fração de glicose em ADP-glucose é transferida para a extremidade não redutora do esqueleto a-1,4-glucano do glicogênio por uma ou mais sintases de glicogênio (GlgA). Posteriormente, uma enzima de ramificação introduz a ligação de glucosilo ligada a a-1,6, que é ampliada para gerar a partícula de glicogênio. No escuro, o glicogênio é dividido por glicogênio fosforilase, enzimas de desmantelamento de glicogênio, α-glucanotransferase e malto-dextrina fosforilase em glicose fosforilada e glicose livre. Esses feed intOu caminhos catabólicos, incluindo a via oxidativa de fosfato de pentose, a via de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólise) e a via Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

O metabolismo de glicogênio em cianobactérias aumentou o interesse nos últimos anos devido ao potencial de cianobactéria se desenvolver em fábricas de células microbianas conduzidas pela luz solar para produzir produtos químicos e combustíveis. O metabolismo do glicogênio pode ser modificado para aumentar o rendimento dos produtos, porque o glicogênio é o maior grupo de carbono flexível dessas bactérias. Um exemplo é a cianobactéria Synechococcus sp. PCC 7002, que foi manipulado geneticamente para produzir manitol; A interrupção genética da síntese de glicogênio aumenta o rendimento de manitol 3 vezes ⁵ . Outro exemplo é a produção de bioetanol a partir de cargas carregadas com glicogênioYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . O conteúdo de glicogênio celular de tipo selvagem pode ser até 60% do peso seco da célula durante a fome de nitrogênio ⁶ .

Nossa compreensão do metabolismo e regulação do glicogênio também se expandiu nos últimos anos. Enquanto o glicogênio é conhecido por se acumular na luz e ser catabolizado no escuro, a cinética detalhada do metabolismo do glicogênio durante o ciclo diel foi revelada apenas recentemente em Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Além disso, vários genes que afetam a acumulação de glicogênio foram identificados. Um exemplo notável é a descoberta de que a putativa histidina quinase PmgA e o RNA PmgR1 não codificante formam uma cascata regulatória e controlam o acúmulo de glicogênio. Interessantemente, os mutantes de deleção e PMGA pmgR1 acumular duas vezes mais glicogénio como a estirpe de tipo selvagem de Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Outros elementos reguladores também são conhecidos por afetar o acúmulo de glicogênio, incluindo o fator de sigma alternativo E e o fator de transcrição CyAbrB2 ^{10 , 11} .

À medida que o interesse na regulação do glicogênio e no metabolismo cresce, um modelo detalhado que descreve a determinação do conteúdo de glicogênio é garantido. Vários métodos são usados ​​na literatura. A hidrólise ácida seguida pela determinação do teor de monossacarídeos através de cromatografia líquida de permuta aniónica de alta pressão acoplada a um detector amperométrico pulsado ou a uma determinação espectrométrica após tratamentos com ácido e fenol são métodos amplamente utilizados para aproximar o teor de glicogênio ^{9 , 10 , 12 , 13} . No entanto, uma cromatografia líquida de permuta de aniões de alta pressãoO instrumento c é muito caro e não discrimina a glicose derivada do glicogênio da derivada de outros glicoconjugados contendo glicose, tais como sacarose ¹⁴ , glucosilglicerol ¹⁵ e celulose ^{16 , 17 , 18} , que são conhecidos por se acumularem em algumas espécies de cianobactérias. O método ácido-fenol pode ser realizado utilizando equipamento de laboratório padrão. No entanto, ele usa reagentes altamente tóxicos e não distingue a glicose derivada de diferentes glicoconjugados, nem distingue a glicose de outros monossacarídeos que constituem materiais celulares, como glicolípidos, lipopolissacarídeos e matrizes extracelulares ¹² . Notavelmente, o ensaio a quente de ácido-fenol é freqüentemente usado para a determinação do teor total de carboidratos em vez de para a determinação específica do teor de glicose ¹² . Enzymatic hyA hidrólise de glicogênio em glicose pela α-amiloglucosidase seguida da detecção de glicose através de um ensaio acoplado a enzima gera uma leitura colorimétrica altamente sensível e específica à glicose derivada de glicogênio. A especificidade pode ser melhorada ainda mais com a precipitação preferencial de glicogênio a partir de lisados ​​celulares pelo etanol ^{5 , 8 , 19} .

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um ensaio baseado em enzimas do teor de glicogênio em duas das espécies cianobacterianas mais estudadas, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nas variedades de tipo selvagem e mutante. A fim de assegurar a hidrólise eficiente, é utilizado um cocktail de α-amilase e α-amiloglucosidase ⁸ . A α-amilase de ação endo hidroliza as ligações a-1,4 em vários glucanos em dextrinas, que são ainda hidrolisadas tO glicose por α-amiloglucosidase ^{20 de} ação exo. Os efeitos sinérgicos destas enzimas são bem conhecidos, e essas enzimas são rotineiramente usadas para a hidrólise seletiva do amido, que é um glucano semelhante a um glicogênio, sem afetar outros glicoconjugadores, como a celulose, na biomassa vegetal ²¹ . A glicose liberada é detectada quantitativamente após um ensaio acoplado a enzima consistindo em glucose oxidase - que catalisa a redução de oxigênio para peróxido de hidrogênio e a oxidação da glicose para uma lactona e peroxidase - que produz um corante de quinoneimina cor de rosa de peróxido de hidrogênio, Um composto fenólico e 4-aminoantipirina ²² .

1. Preparação

1. Cianobacterias
   1. Grow Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C em meio líquido BG11 ⁸ , com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO ₂ . Ilumine as culturas continuamente com luz em uma densidade de fluxo fotônico fotossintético de 50 μmol de fotão / m ² / s.
   2. Grow Synechococcus sp. PCC 7002 em meio líquido A + ²³ (meio BG11 também pode ser usado), com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO ₂ . A temperatura deve ser de 37 ° C. Ilumine as culturas continuamente com luz em uma densidade de fluxo fotônico fotossintético de 150 μmol de fotão / m ² / s.
   3. Medir a densidade óptica (OD) da cultura a 730 nm usando uma cuvete com um caminho de luz de 1 cm. Se o valor da OD estiver acima de 0,8, faça diluições apropriadas para obter medições de OD que sejam proporcionais aConcentração de célula e.
      NOTA: Os protocolos apresentados abaixo são adequados para culturas líquidas, com uma densidade celular correspondente a um valor de OD _730nm de 2 ou superior. Quando as culturas na fase de crescimento exponencial são desejadas, que tipicamente têm um valor de OD _730nm abaixo de 1, concentre a densidade celular por centrifugação e ressuspensão em um tampão ou meio para atingir um valor de OD _730nm de 2 ou superior.
2. Buffers e reagentes
   1. Faça um tampão Tris-HCl 50 mM a pH 8.
   2. Faça um tampão de acetato de sódio 50 mM a pH 5.
   3. Faça uma solução de reserva de 8 U / mL de amiloglucosidase em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5.
   4. Faça uma solução-mãe de 2 U / mL de a-amilase em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5.
   5. Usando água destilada, soluções padronizadas de formaglucose em concentrações variando entre 0 e 100 μg / mL.
   6. Prepare o reagente GOD-POD do kit D-Glucose Assay Kit (Formato GODPOD), fConforme as instruções do fabricante.

2. Determinação do peso seco da célula (opcional)

1. Transferir 2 mL de uma cultura ou uma ressuspensão celular (ver passo 1.1) para um tubo de 2,0 mL e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
2. Ressuspender o sedimento em 1 mL de água e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 0,5 mL de água.
3. Transfira a suspensão para uma bandeja de alumínio pré-pesada. Transfira a bandeja para um forno de secagem a 105 ° C para secar durante a noite (aproximadamente 18 h).
   CRÍTICO: É importante que a bandeja seja manipulada com fórceps para evitar a transferência de material dos dedos. Seque uma bandeja de alumínio vazia pré-pesada nas mesmas condições para determinar qualquer perda de peso das bandejas durante a secagem.
4. Após a secagem, retire a bandeja do forno e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente.5 min antes de pesá-lo com uma precisão de 0,0001 g.
   NOTA: O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênio em uma base celular-seca.

3. Lysis of Cyanobacterial Cells

1. Transfira 1 mL de uma cultura ou uma ressuspensão celular (ver passo 1.1) para um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 6000 xg e 4 ° C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
2. Ressuspender o grânulo em 1 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8 e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 10 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 mL do tampão Tris-HCl. Repita o processo.
3. Ressuspender completamente o grânulo em 500 μL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8.
   CRÍTICO: ressuspenda o sedimento bem para uma lise celular eficiente. Mantenha a ressuspensão no gelo.
4. Lyse as células ressuspensas a 4 ° C realizando 30 ciclos de ultra-sonografia, sendo cada ciclo constituído por 30 s a uma frequência de 20 kHz com a amplitude máxima,Seguido por 90 s sem.
   NOTA: Este método pode lidar eficazmente Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. Alternativamente, transfira a ressuspensão da célula para um tubo de tampa de rosca e adicione contas de óxido de zircônio ao tubo, seguindo as instruções do fabricante. Coloque o tubo em um homogeneizador de tecido e lise as células a 4 ° C realizando 2 ciclos de batida, cada ciclo consistindo de 5 min na configuração de freqüência de 5.
      NOTA: Este método pode liar eficientemente Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Centrifugar o tubo contendo o lisado durante 10 minutos a 6.000 xg e 4 ° C.
   NOTA: O grânulo deve consistir principalmente em detritos de células grandes. Se houver um número significativo de células ininterruptas, repita o passo 3.4. Mantenha o sobrenadante no gelo.
6. Determine a concentração de proteína usando um kit comercial de teste de proteína BCA.
   NOTA: O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênioEm base de conteúdo protéico.

4. Precipitação de glicogênio

1. Remova a clorofila a partir do lisado celular misturando 900 μL de etanol a 96% (v / v) e 100 μL do sobrenadante do passo 3.5 num tubo de tampa roscada de 1,5 mL. Depois de fechar a tampa, aqueça o tubo a 90 ° C durante 10 minutos usando um bloco de aquecimento de laboratório padrão.
2. Incube o tubo sobre gelo durante 30 min.
3. Centrifugue o tubo a 20.000 xg e 4 ° C durante 30 min e remova cuidadosamente o sobrenadante; O sedimento contém glicogênio. Secar levemente a pastilha no ar para remover o excesso de etanol.
   CRÍTICO: A secagem excessiva do grânulo deve ser evitada, caso contrário torna-se difícil solubilizar no passo 5.1.
4. OPCIONAL: Medir a absorvância do sobrenadante obtido no passo 4.3 a 664 nm para determinar o teor de clorofila a . Use um coeficiente de absorção de 84,6 L / g / cm ²⁴ .
   NOTA: O valor pode ser usado para normalizarE o conteúdo de glicogênio.

5. Determinação da hidrólise enzimática e do glicogênio

1. Solubilizar o grânulo obtido no passo 4.3 em 100 μL de acetato de sódio 50 mM, pH 5, e adicionar 50 μL de 8 U / mL de amiloglucosidase e 50 μL de 2 U / mL de a-amilase. Misture estes materiais bem usando um vórtice.
   NOTA: A mistura por pipetagem não é recomendada porque a bolacha de glicogênio é viscosa.
2. Incubar a mistura a 60 ° C em um bloco de aquecimento durante 2 h para permitir a digestão de glicogênio em moléculas de glicose.
3. Centrifugar a amostra a 10 000 xg durante 5 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.

6. Determinação do conteúdo total de glicose usando o Reagente GOD-POD

1. Medir a concentração de glicose no sobrenadante obtido no passo 5.3 usando o reagente GOD-POD. Transfira 100 μL do sobrenadante do passo 5.3 para um poço numa placa de 96 poços. Como um controle negativo,Use 100 μL de acetato de sódio 50 mM, pH 5. Para gerar uma curva de calibração, também mede as soluções padrão de glicose.
2. Adicione 150 μL de reagente GOD-POD a cada amostra e rapidamente misture por pipetagem.
3. Incubar a placa estaticamente a 25 ° C durante 30 min. Registre o valor de absorvância a 510 nm usando um leitor de placas.
4. Calcule a concentração de glicose usando uma curva de calibração obtida a partir dos padrões de glicose.
   NOTA: A concentração de glicogênio no lisado celular é expressa como a concentração de glicose (μg / mL).

10 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 foram cultivados sob condições fotoautotróficas até o valor de OD 730nm atingir aproximadamente 0,8. As células foram colhidas e ressuspensas em Tris-HCl 50 mM, pH 8. O valor de OD730nm foi ajustado para 2-3. O teor de glicogênio foi analisado seguindo o protocolo descrito acima. O teor de glicogênio por OD 730nm foi de 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12). O teor de glicogênio em relação ao teor de proteína foi de 0,24 ± 0,03 μg / μg ( N = 12) eo teor de glicogênio em relação ao teor de clorofila a foi 5,7 ± 0,6 μg / μg ( N = 12). Devido à pequena quantidade de material disponível, a medida do peso seco da célula foi omitida. Dado que o teor de proteína em cianobactérias cultivadas em condições comparáveis ​​é cerca de 50% do peso seco da célula 25 </ Sup>, o teor de glicogênio é estimado em 12% do peso seco da célula, o que é consistente com estudos anteriores 26 .

Os limites de detecção do ensaio GOD-POD mostraram uma correlação linear entre a concentração de glicose e a absorvência a 510 nm na faixa de concentração de glicose entre 10 e 100 μg / mL, correspondendo a valores de absorvência de 0,08 e 0,7 a 510 nm. O limite mínimo é provavelmente devido ao limite de detecção instrumental. Quando foram utilizadas concentrações de glicose superiores a 150 μg / mL, precipitaram-se precipitados de verde escuro, causando uma grande variação na leitura da absorvância. No que respeita à quantidade de materiais celulares utilizados, rotineiramente obtidos teores de glicogênio reprodutíveis quando o valor de OD 730nm de ressuspensão celular antes da lise celular situou-se entre 2 e 10. resuspensions celular com um valor de DO 730nm de um ou abaixo deu origem a sinais perto do Limite de detecção mínimaT, levando a resultados altamente variáveis. A ressuspensão celular com um valor de OD 730nm superior a 20 não era adequada porque a lise celular estava incompleta e era necessária lise prolongada ou diluições.

A Figura 1 mostra resultados representativos dos teores de glicogênio em Synechocystis sp. PCC 6803 tipo selvagem e duas cepas mutantes ( ΔpmgA e ΔpmgR1 ). As células cultivadas na fase de crescimento exponencial foram utilizadas. Os teores de glicogênio foram primeiro normalizados pelo teor total de proteínas e posteriormente foram expressos em relação ao valor do tipo selvagem. Os resultados mostram que as cepas mutantes possuem conteúdo de glicogênio que é pelo menos duas vezes maior que a estirpe do tipo selvagem.

Em seguida, o conteúdo de glicogênio foi analisado em estirpes de Synechococcus sp. PCC 7002 projetado para produzir manitol 5 . A primeira cepa (Glg + ) contém os genes glgA1 e glgA2 de tipo selvagem que codificam duas sintases de glicogênio funcionais, enquanto a segunda estirpe (Glg - ) não possui cópias funcionais desses genes 5 . Os teores de glicogênio e manitol foram então medidos em ambas as cepas ( Figura 2 ). Os resultados mostram que o Glg - não possuía um nível detectável de glicogênio, enquanto produzia mais manitol do que a estirpe Glg + . Isso sugere que o carboidrato sintetizado pela fotossíntese é redirecionado para o manitol na estirpe mutante que não possui a capacidade de sintetizar o glicogênio. Os valores de DO730nm das culturas foram aproximadamente 10, proporcionando materiais celulares suficientes para análise de peso seco de células. Os teores de glicogênio foram normalizados usando o peso seco da célula.

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Figura 1: Os teores de glicogênio medidos em diferentes linhas de Synechocystis sp . PCC 6803. conteúdo de glicogénio relativa no WT e em dois mutantes (ΔpmgA 9 e ΔpmgR1 8) são mostrados. Os níveis de glicogênio foram normalizados pelo teor total de proteínas. Os meios de três repetições biológicas são mostrados, com barras de erro representando desvios padrão. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2: Produção de glicogênio e manitol em Synechococcus sp. Manipulado geneticamente. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, a linhagem que sintetiza manitol e glicogênio. Glg - , a linhagem que sintetiza manitol, mas sem glicogênio. Os valores representados são a média de três repetições biológicas, com barras de erro representando os desvios padrão. CDW: peso seco celular, ND: não detectado. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Os autores não têm nada a divulgar.