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Artigo de método

Transplante de Schwann células dentro de conduítes de PVDF-TrFE a ponte rato necrosante tocos de medula espinhal para promover a regeneração do axônio através da abertura

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DOI:

10.3791/56077

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3 de novembro de 2017

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve uma técnica para inserir um canal oco entre os cotos de medula espinhal após a transecção completa e preenchimento com células de Schwann (SCs) e matriz de injetável membrana basal para ponte e promover a regeneração do axônio através da abertura.

Resumo

Entre vários modelos para a lesão da medula espinhal em ratos, o modelo de contusão é o mais frequentemente usado porque é o tipo mais comum de lesão da medula espinhal humana. O modelo de transecção completa, embora não tão clinicamente relevantes como o modelo de contusão, é o método mais rigoroso para avaliar a regeneração do axônio. No modelo de contusão, é difícil distinguir regenerada de axônios germinados ou poupados devido à presença do restante post lesões no tecido. No modelo de transecção completa, um método de ponte é necessário preencher a lacuna e criar a continuidade partir o rostral para os cotos caudais para avaliar a eficácia dos tratamentos. Uma cirurgia de ponte confiável é essencial para testar as medidas de resultado, reduzindo a variabilidade devido o método cirúrgico. Os protocolos descritos aqui são usados para preparar Schwann células (SCs) e condutas antes da transplantação, transecção completa da medula espinhal torácica nível 8 (T8), insira o conduíte e transplantação SCs para a canalização. Essa abordagem também usa em situ gelificação de uma matriz de injetável membrana basal com transplante de SC que permite o crescimento do axônio melhorada entre as interfaces rostrais e caudais com o tecido do hospedeiro.

Introdução

Reparação de lesão da medula espinhal é um problema complexo e desafiador que exigirá uma estratégia de tratamento combinatória envolvendo, por exemplo, o uso de células e um biomaterial para fornecer um microambiente favorável para função CÉL transplantado e axônio regeneração no local da lesão. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transecção completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos são frequentemente usados para avaliar os efeitos das terapias pontes baseada em biomateriais. A vantagem de usar um modelo hemisection é que ele fornece mais estabilidade para construção de ponte em comparação com transecção completa. No entanto, nos modelos hemisection, é difícil provar a regeneração do axônio como um resultado do método terapêutico aplicado devido à presença de tecido poupado. O modelo de transecção completa é o método mais rigoroso para demonstrar a regeneração do axônio.

Vários materiais naturais e sintéticos têm sido estudados para uso como um gel injetável, um gel pré-formado colocados em hemisection modelos ou contusão, ou como uma conduta estruturada em hemisection ou completar modelos transecção (detalhados em23 comentários , 24 , 25). in situ gelificação de uma mistura injectável matriz/SC cria uma interface mais permissiva entre o transplante e o cabo de anfitrião para o axônio cruzamento26,27 , em comparação com implantes previamente coaguladas matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. em situ gelificação permitiu a matriz para contorno próximo as interfaces de host irregular, Considerando que uma conduta mais rígida e estruturada ou um gel menos moldável pré-formado não poderia. Um conduíte estruturado frequentemente fornece contato orientação e implante estabilidade em contraste com uma matriz injetável. Os protocolos aqui apresentados descrevem um procedimento cirúrgico que tira proveito de uma matriz de injetável de membrana basal (por exemplo, matrigel, consulte a Tabela de materiais, referido como injetável matriz aqui) e um condutor estruturado para Avalie a regeneração do axônio no modelo mais rigoroso de lesão da medula espinhal.

Electrospun poli-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) alinhados fibrosos ocos conduítes são usados em nossa abordagem experimental. PVDF-TrFE é um polímero piezoelétrico que gera uma carga transiente quando deformado mecanicamente e tem sido demonstrado para promover a regeneração de extensão e axônio axônio tanto em vitro29,30 e vivo em 31. eletrofiação é um método de fabricação de andaime comuns que pode rapidamente produzir confiança andaimes fibrosos, usando uma variedade de polímeros com propriedades controláveis como alinhamento de fibra, diâmetro da fibra e espessura do andaime para neural e outras aplicações32,33,34.

Numerosos estudos de SCs transplantados em sítios de lesão da medula espinhal dos ratos demonstraram tratamento eficácia5,9,18,19,20,21 ,26. Esses transplantes são neuroprotetor para o tecido circundante da lesão, reduzir o tamanho da cavidade de lesão e promover a regeneração do axônio para o sítio de lesão/transplante e mielinização dos axônios regenerados. SCs humanas podem ser autologously transplantados, uma vantagem quando comparado com a maioria dos outros neurais relacionadas com células24. Depois de uma biópsia de nervo periférico, SCs podem ser isoladas e purificadas e irá proliferar para a quantidade desejada para transplante em humanos. Transplante autólogo de SC para pacientes ferido da medula espinhal tem sido provado para ser seguro no Irã35,36,37,38, China39,40e o Estados Unidos41,,42. SCs são conhecidos para secretar numerosos fatores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular importantes para o crescimento do axônio e desempenham um papel essencial na regeneração do axônio após a lesão de nervo periférico. Nosso objetivo aqui é descrever métodos que podem investigar projetos de canalização para melhorar o resultado da transplantação de SC em um modelo de transecção medular completa de rato.

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Protocolo

ratos de Fischer adulto feminino (180-200 g de peso de corpo) estão alojados de acordo com as diretrizes do NIH e USDA. O cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os procedimentos animais.

1. preparação de pré-transplante

  1. preparação Conduit.
    1. Corta o conduíte para 5 mm de comprimento, usando uma lâmina #10 sob um microscópio dissecação.
      Nota: O diâmetro interno da canalização é entre 2,4-2,7 mm; o diâmetro exterior é entre 2,5-2,8 mm.
    2. Dobre o conduíte suavemente ao longo do lado longitudinal ( figura 1A). Corte quatro pequenas incisões sobre 0,4 mm de comprimento e pelo menos 1 mm de aberturas da canalização e cerca de 1 mm separados usando borda reta Tesoura Vannas ( figura 1B).
      1. Desdobrar a canalização ( Figura 1) e corte entre as duas incisões ao longo do mesmo lado, criando duas janelas lado a lado ( Figura 1). Certifique-se de que o windows pode ser convenientemente aberto e fechado ao longo do lado sem cortes.
    3. Esterilizar os conduítes em etanol a 75% para 25 min em um prato de Petri de 10 cm. Lave os conduítes de uma vez para 4 min com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e transferir os conduítes com Pinças esterilizadas para um novo prato de Petri de 10 cm. Lave os conduítes duas vezes com PBS 1x por 25 min cada.
    4. Armazenar os conduítes em PBS 1x até cirurgia.
      Nota: Muitos conduítes podem ser esterilizados imediatamente. Armazenar as canalizações em tubos de centrífuga separado estéril 1,5 mL para mantê-los estéril.
  2. Verde proteína fluorescente (GFP)-preparação de célula de Schwann (SC)
    1. preparar culturas de SC purificadas de nervos tibiais de Fischer feminino adulto ratos como descrito anteriormente, 43. Após a conclusão desta etapa, os SCs na poli-L-lisina (PLL) da placa-revestido pratos de Petri de 10 cm e manter-se no meio de D10/3M; Estes SCs são definidos como passagem 0.
      Nota: D10/3M médio é composto dos seguintes: extrato de 10% fetal de soro bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina (caneta/strep) 20 pituitária µ g/mL, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin em Dulbecco ' s modificado águia ' médio s (DMEM).
    2. Reabastecer com meio fresco de D10/3M (7 mL/10-cm placa de Petri) a cada 3 a 4 dias.
    3. Cultura de Split SC, uma vez que ele atinge a confluência de 70-80%.
      1. Meio de remover e lavar duas vezes com Hank ' s equilibrada solução salina (HBSS) sem cálcio ou magnésio.
      2. Adicionar 5 mL de 0,25% tripsina/EDTA para cada prato de Petri de 10 cm e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
      3. Adicionar 5 mL de meio de D10 (10% FBS e 1% caneta/estreptococo em DMEM) em um tubo de centrífuga de 50 mL para neutralizar a tripsina.
        4. Solução
      4. suavemente a pipeta a tripsina/EDTA para a Petri prato várias vezes para desanexar SCs. Remove a suspensão de eritrócitos do prato e coloque-o no tubo de centrífuga, preparado na etapa anterior. Enxagúe o prato com 5 mL de meio de D10 e coloque-o no tubo de centrífuga para maximizar a colheita da pilha.
      5. Centrifugar as células a 370 x g durante 5 min à 4 ó C. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 4 mL de meio de D10/3 M para cada placa de Petri split.
      6. Diluir 1 mL de suspensão de SC e 6 mL de meio de D10/3M em um prato de Petri de 10 cm; cada placa de Petri divisão resultará em 4 placas de Petri. Estes SCs são definidos como passagem 1.
      7. Reabastecerá com meio D10/3M fresco o dia depois de chapeamento e a cada 3-4 dias após o chapeamento.
      8. Uma vez as SCs chegar a confluência de 70-80%, repita as etapas de 1.2.3.1 para 1.2.3.6. As SCs estão agora na passagem 2.
    4. Transduce as SCs uma vez atingindo a confluência de 50%, com um vetor de Lentivirus codificação GFP em D10/3M médio durante a noite em uma multiplicidade de infecção de 30 conforme descrito anteriormente 44 , 45 .
    5. Reabastecer com meio fresco D10 / 3M, no dia seguinte e a cada 3-4 dias após o chapeamento.
    6. , Uma vez que a GFP-SCs alcança a confluência de 70-80%, repita as etapas de 1.2.3.1 para 1.2.3.5 mas Resuspenda os GFP-SCs em 6 mL de meio de D10, em vez disso. Dispense a 15 µ l de suspensão de GFP-SC em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e adicionar 15 µ l de solução de azul de Tripan 0,4%. Agite suavemente o tubo de centrífuga e dispense 10 µ l da mistura em uma câmara de contagem celular slide.
      1. Colocar o slide em um contador de célula automatizada e determinar a densidade celular.
    7. Centrifugar as células a 370 x g durante 5 min à 4 ó C. Retire o sobrenadante, resuspenda com 1,5 mL de meio de congelamento para cada 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL de suspensão de GFP-SC em um frasco criogênico e congelamento em -80 ó C durante pelo menos 24 h antes de se mudar para o nitrogênio líquido para armazenamento.
      Nota: Congelamento médio: 25% FBS e 8% Dimetilsulfóxido em DMEM.
    8. GFP-SCs descongelar uma semana antes da cirurgia.
      1. Adicionar 10 mL D10 de meio em um tubo de centrífuga de 50 mL.
      2. Descongelar frascos de GFP-SCs congelados em banho de água a 37 o C até parcialmente derretido.
      3. Remover a suspensão de GFP-SC do frasco criogênico e coloque-o no tubo de centrífuga de 50 mL, preparado em 1.2.8.1. Suavemente a solução de pipeta para cima e para baixo várias vezes.
      4. Centrifugar as células a 370 x g durante 5 min à 4 ó C. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em meio de D10/3 M 4 mL para cada frasco descongelado.
      5. Dispense 2 mL de suspensão de GFP-SC e 5 mL de meio de D10/3M em um prato de Petri de 10 cm; cada frasco deve resultar em 2 placas de Petri. Os GFP-SCs são definidos como passagem 3.
        Nota: Um prato de Petri de 10 cm geralmente produz em torno de 8 x 10 6 GFP-SCs depois de uma semana.
    9. No dia da cirurgia, repita a etapa 1.2.6. Utilização da densidade da célula calculada na etapa 1.2.10.
      10. Tubos
    10. Dispense alíquotas de 3 x 10 6 GFP-SCs em centrífuga estéril 1,5 mL com base na densidade celular calculado da etapa 1.2.9. Centrifugar as alíquotas de GFP-SC a 370 x g durante 5 min à 4 ó C e remover o sobrenadante. Adicionar 1 mL de meio DMEM/F12 para cada alíquota e centrifugar x 370 g.
      Nota: Cada animal recebe 3 x 10 6 GFP-SCs. meio com soro é usado com GFP-SCs até esta etapa.
    11. Manter GFP-SCs no gelo até a hora do transplante.

2. Completar a transecção torácica nível 8 (T8)

  1. Animal preparação para cirurgia
    1. Anesthetize uma fêmea Fischer rato (180-200 g) com uma injeção intraperitoneal de cetamina (60 mg/kg de peso) e xilazina (5 mg/kg de peso corporal). Monitorar a profundidade da anestesia antes de prosseguir para a próxima etapa, verificando a beliscar-dedo do pé e olho pisca respostas.
    2. Raspar a parte de trás do rato com uma tosquiadeira elétrica e limpe a pele com álcool 70%. Aplique lubrificante oftálmico ambos os olhos. Transferir o animal para a mesa de cirurgia em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em cerca de 37 o C. lugar o animal em um rolo assim as vértebras são de fácil acesso.
      Nota: O rolo pode ser feito de toalha de papel ou 2 em x2 em gaze que pode ser esterilizado. Rolos maiores são recomendados quando T7-T9 precisa ser colocados horizontalmente no topo do rolo.
  2. T7 a T9 laminectomia
    1. localizar o ponto de referência para os processos espinhosos de T9-T11.
      Nota: As lacunas entre o T9, T10, T11 e são pequenas em comparação com outros segmentosn a região. Depois de colocar o rato sobre o rolo, processos espinhosos de T9-T11 vai se sentir como um pequeno solavanco triangular através da pele.
    2. Fazer uma incisão de 4 a 5 cm da pele usando uma lâmina #10 de T4 T11. Faça uma pequena incisão na camada de gordura superficial com tesoura curva com extremidades sem corte para dissecar a gordura.
      Nota: Outros tipos de instrumentos podem ser usados para separar a gordura mas tesoura curva com extremidades sem corte habilitar o método mais eficaz e menos invasivo para a separação de gordura.
    3. Localizar o T7 a T9 espinhosos processos usando as costas da lâmina #10. O músculo em sobre T4 com fórceps rombudo e fazer uma incisão no músculo ao longo de cada lado das vértebras de T6-T10. Fazer o corte mais próximo as vértebras quanto possível para fazer uma abertura limpa e causar prejuízo mínimo ao animal.
    4. Isolar cada individual processo espinhoso de T7 a T9 cortando os músculos e ligamentos entre T6 e T7, T7 e T8, T8 e T9 e T9 e T10 com uma lâmina #10.
    5. Usar um rongeur para remover qualquer músculos e ligamentos sobre as lâminas de T7 a T9. Remover os músculos e ligamentos mais lateralmente quanto possível até que as lacunas entre as apófises transversas de T7 a T9 são visíveis.
    6. Remover o processo espinhoso T9 com um rongeur. Segure o processo espinhoso T8 com fórceps rombudo e levante suavemente para elevar a lâmina T9 na pequena abertura entre os processos de T9 e T10.
    7. Remover a lâmina, a partir da abertura e movendo-se rostralmente com um rongeur no T9. Remover a lâmina lateralmente o máximo possível; as raízes dorsais deve ser visíveis após a laminectomia.
    8. , Uma vez que a lâmina é removida, repita o processo para T8 e T7.
      Nota: Durante a laminectomia, use lanças de absorção para remover sangue continuando com a laminectomia. Se o sangramento excessivo ocorre, coloque uma esponja comprimida no local do sangramento e adicionar soro fisiológico para ajudar com a coagulação sanguínea.
  3. Transecção em T8
    1. Coloque o retractor em torno de T7 a T9. Uma vez que todas as lâminas são removidas, certifique-se que as lacunas entre as apófises transversas são visíveis, especialmente em T8. Também examinar os ossos ao longo do comprimento de ambos os lados entre T7 a T9 para garantir que existem não há fragmentos de ossos salientes para fora.
      Nota: Esta lacuna em T8 é importante para a realização da transecção completa. As vértebras ao longo do comprimento devem ser removidas para fácil inserção de conduíte.
    2. Corte dorsal e ventral raízes acima e abaixo T8 usando angulado tesoura de mola. Adicionar soro fisiológico da medula espinhal e esperar o sangue ao coágulo.
      Nota: este passo é importante para a inserção de canalização adequada.
    3. Coloque a tesoura mola angular acima da medula espinhal as lacunas entre as apófises transversas em T8 e faça um corte para separar completamente a medula espinhal. Coloque um pequeno pedaço de espuma compactado a lacuna resultante de 2-2,5 mm e adicionar soro fisiológico a área imediatamente.

3. Inserção de conduíte

  1. enquanto aguarda os tocos de cabo cortado alcançar a hemostasia, tirar um conduíte de 1X PBS. Corte os triângulos de absorção em peças muito finas e coloque-os no conduíte para remover o excesso PBS. Verifique se o windows pre-cut estão aberto.
  2. Remover a solução salina e usando finas partes longas de triângulos de absorção de sangue. Levante os dois cotos da medula espinhal, usando um microspatula para garantir a boa separação. Delicadamente Levante o coto rostral com o microspatula e deslizar o condutor sobre o coto com as janelas viradas para si mesmo. Certifique-se de que o tronco inteiro é inserido e não há nenhum sangramento excessivo para o canal.
  3. Suavemente levantar o coto caudal e deslize a outra extremidade do condutor sobre o coto. Certifique-se que o tronco inteiro é inserido e as janelas estão na superfície dorsal ( Figura 2A).

4. Célula de Schwann / Matrix injetável (ver tabela de materiais) preparação e injeção

  1. enquanto aguarda o cordão cortado alcançar a hemostasia, remover o meio acima a pelota de GFP-SC (preparado na etapa 1.2). Resuspenda os GFP-SCs em 10 µ l de frio DMEM/F12. Adicionar 10 µ l de frio gel injetável à suspensão de células e misture bem por repetidas pipetagem. Manter a mistura de matriz de GFP-SC/DMEM/F12/injetável no gelo, até que seja concluída a inserção de conduíte.
  2. Depois de garantir que o windows sobre a superfície dorsal são abrir ( Figura 2A), injetar 20 µ l da mistura de matriz de GFP-SC/DMEM/F12/injetável a conduta através de um do windows pre-cut 46 usando um western blot para carregamento de ponta e uma micropipeta. Se a mistura de matriz SC/DMEM/F12/injetável deve encher demais o conduíte, retire o excesso com triângulos de absorção. Feche o windows após a injeção; sutura não é necessária ( Figura 2B).

5. Ferida de encerramento e cuidados pós-operatório

camadas
  1. sutura do músculo e as camadas de gordura superficiais. Limpar a pele com 70% de etanol e então grampo (por exemplo, usando clipes de ferida) fecha a pele. Manter os animais em uma incubadora termicamente regulamentada até que recupere a consciência. Transferência que dos animais de volta para as gaiolas. Fornecer água com um tubo de alimentação há muito tempo e colocar comida na cama para facilitar o acesso.
  2. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal) duas vezes por dia durante 3 dias por via subcutânea, começando imediatamente após a cirurgia para reduzir a dor. Injete a gentamicina (5 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea uma vez ao dia por 7 dias imediatamente após a cirurgia para prevenir e reduzir a infecção. Injectar 10 mL de solução de lactato toques por via subcutânea duas vezes por dia durante 7 dias para hidratação.
  3. Vazio bexigas manualmente, duas vezes por dia até a bexiga função retorna. Se ocorrer infecção na bexiga, então Administre soro fisiológico 10 mL por via subcutânea até urina torna-se claro. Se não houver melhora em dois dias, injetar gentamicina (5 mg/kg de peso corporal, uma vez por dia) por via subcutânea até que a urina se torna clara.

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Resultados

O objetivo de utilizar esta técnica cirúrgica é avaliar o uso de uma conduta estruturada e matriz injetável que maximiza a função de SC após transplante em concluído espinais necrosante. Três semanas após o transplante, os animais são pintados com paraformaldeído 4% e a coluna vertebral são grosseiramente dissecada e fixada no mesmo fixador para outro 24h. A medula espinhal é então dissecada e amostras para seções sagitais criostato são colocadas em uma solução de sacarose de 30% para cry...

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Discussão

O passo mais crítico na criação de um modelo eficaz de transecção é rompimento da medula espinhal em um ou dois cortes. Um intervalo de 2-2,5 mm entre os cotos rostral e caudal da medula espinhal deve estar presente no local da transecção. Os três motivos mais prováveis para tal uma lacuna não aparecendo são (1) as raízes dorsal/ventral não foram removidas corretamente, (2) a dura-máter ventral não foi removido adequadamente, e/ou (3) o animal não foi corretamente posicionado no rolo colocado abaixo dela.

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o vetor Viral e núcleos de Animal no projeto de Miami para cura paralisia produzindo lenti-GFP-vírus e fornecendo cuidados com animais, respectivamente e o histologia e núcleos de imagens para o uso do criostato, microscópio confocal, e microscópio fluorescente com investigador estéreo. Financiamento foi fornecido pelo NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge é a Christine E Lynn Distinguished Professor de neurociência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frascos criogênicosThermoFisher Scientific5000-0020
Placa de Petri de 10 cmVWR25382-428
Meio de Eagle modificado de Dulbecco: mistura de nutrientes F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" em protocolo.
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific15140-122"Caneta / Strep" em protcol.
Soro fetal bovinoHycloneSH300-70-03"FBS" em protocolo.
Extrato hipofisárioBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR & D Systems396-HB/CF
Poli L-lisinaSigma-AldrichP2636"PLL" em protocolo.
Meio Eagle modificado de DulbeccoThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" no protocolo.
Solução salina balanceada de HankThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" em protocolo.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Rato Fischer fêmea (160-180g)Tesoura Envigo
Vannas, retaFST15018-10
Cetamina Vedco Inc5098976106 100 mg/ml
XylazineLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamicinaAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02Pode ser qualquer marca de sua escolha.
Micro EspátulaFST10089-11Pode ser qualquer marca de escolha.
Tesoura curva com ponta rombaFST14017-18Pode ser qualquer marca de sua escolha.
Pinça sem corteFST11006-12Pode ser qualquer marca de escolha.
rongeurFST16121-14Pode ser qualquer marca de sua escolha.
Tesoura de mola angularFST15006-09Pode ser qualquer marca de escolha.
Triângulos de absorçãoFST18105-03Pode ser qualquer marca de sua escolha.
GelfoamHenry Schein9083300"Espuma comprimida" em protocolo.
#10 lâminasSklar06-3010Pode ser qualquer marca de escolha.
MatrigelCorning354234"Matriz injetável" no protocolo.
Anticorpo anti-proteína fluorescente verdeMilliporeAB16901
Mouse RT97 anticorpo de hibridomaDSHBRT97
Anticorpo anti-neurofilamento de coelhoEncor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
Anticorpo de proteína ácida fibrilar glial de coelho policlonalDakoZ033401
Alexa Fluor 488 cabra anti-frango IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 cabra anti-coelho IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 cabra anti-rato IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Microscopia ConfocalNikonclsi

Referências

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