Method Article

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

DOI:

10.3791/56079

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and Whitaker Cardiovascular Institute, Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

Abstract

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Enquanto a obesidade está intimamente ligada ao desenvolvimento de doenças metabólicas e cardiovasculares, pouco é conhecido sobre os mecanismos que regem esses processos. Supor que mediadores pro-aterogênico liberados do adiposo, particularmente em associação com a adiposidade visceral/central podem promover alterações vasculares patogénicas localmente e sistemicamente, e a noção de doença cardiovascular pode ser o consequência da disfunção do tecido adiposo continua a evoluir. Aqui, descrevemos um método exclusivo de tele-microscopia que envolve a análise das respostas vasodilatador e vasoconstritor intacta pequenas arteríolas humana, retirados do depósito de tecido adiposo de seres humanos vivos. Tele-microscopia é usada para examinar as propriedades funcionais de microvessels isolado em resposta a estímulos fisiológicos ou farmacológicos, usando um sistema de pressão que imita as condições na vivo . A técnica é uma abordagem útil para a compreensão da fisiopatologia e mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção vascular localmente dentro do meio do tecido adiposo. Além disso, anormalidades na microvasculatura tecido adiposo também têm sido associadas com doenças sistêmicas. Nós aplicamos esta técnica para examinar o depósito específico respostas vasculares em indivíduos obesos. Avaliamos a vasodilatação endotélio-dependente ao fluxo aumentado e acetilcolina em arteríolas adiposas (50-350 µm de diâmetro interno, 2-3 mm de comprimento) isoladas de dois diferentes depósitos de tecido adiposos durante cirurgia bariátrica do mesmo indivíduo. Demonstrámos que arteríolas de gordura visceral apresentam prejudicada vasodilatação endotélio-dependente, em comparação aos navios isolados do depósito subcutâneo. Os resultados sugerem que o microambiente visceral está associado a disfunção endotelial vascular que pode ser relevante para a observação clínica vinculando aumento de adiposidade visceral aos mecanismos de doença sistêmica. A técnica de tele-microscopia pode ser usada para examinar vasculares fenótipos de diferentes depósitos de gordura, bem como comparar resultados entre indivíduos com diferentes graus de obesidade e disfunções metabólicas. O método também pode ser usado para examinar as respostas vasculares longitudinalmente em resposta às intervenções clínicas.

Introduction

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Tele-microscopia é uma técnica útil utilizada para examinar a função vasomotora pequenas arteríolas removido da vida humana assuntos ex vivo. Nosso laboratório centrou-se na dissecação fora microvessels minúsculo de compartimentos diferentes de tecido adiposo para caracterizar os efeitos de vários microambiente adiposa sobre a microvasculatura. Uma grande vantagem desta técnica é que os vasos sanguíneos removidos do corpo humano permanecem funcionais e podem ser examinados prontamente dentro de minutos a horas após a biópsia. Condições fisiológicas são imitadas e firme pressão transmural mantida no espaço intraluminal através de cânulas de vidro micro que recapitular muitas características de na vivo . 1 , 2 além disso, um set-up confiável tele-microscopia com software de detecção de borda automática permite que para avaliação qualitativa e quantitativa do endotélio-dependente e - independente de vasodilatador e vasoconstritor capacidade isolada navios em tempo real, permitindo rápida avaliação fisiológica em resposta a estímulos físicos e farmacológicos. 3 outras técnicas microvasculares também estão disponíveis como fio miografia que tende a ser menos demorado e medir respostas de tensão para vários agonistas por um transdutor de força.

Nosso laboratório tem aplicado tele-microscopia para examinar a relação entre obesidade e disfunção vascular, enfocando os efeitos de domínios diferentes de tecido adiposo na vasculatura. Adiposidade central, com acúmulo de gordura visceral intra-abdominal tem sido mais estreitamente associada a produção de adipocytokine, disfunção metabólica e risco Cardiometabólica. Foi postulado que a disfunção do tecido adiposo com excesso de produção de pro-aterogênico desregulagem de citocinas e adipokine estão fortemente implicados nestes processos, mas moléculas reguladoras específicas e alvos de tratamento permanecem em grande parte por descobrir. 4 além disso, no nível do tecido adiposo local, rarefação capilar e perfusão deficiente têm sido associados a pseudohypoxia de tecido adiposo e desregulação metabólica. A hipótese de que a doença cardiovascular pode ser a consequência da disfunção do tecido adiposo está evoluindo. Pro-aterogênico mediadores liberados da gordura, particularmente em associação com a adiposidade central/visceral, provável promovem disfunção endotelial e alterações vasculares patogénicas que podem ser manifestam localmente na vasculatura adiposa e detectado usando o descrito neste documento metodologia. 5

A avaliação funcional das arteríolas isoladas de tecido adiposo é uma abordagem útil para a compreensão da fisiopatologia e mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção vascular na obesidade humana. Para investigar os mecanismos que contribuem para a disfunção gordura de depósito específico, desenvolvemos métodos para examinar o endotélio-dependente e - respostas vasodilatadoras independentes da microvasculatura e avaliar a expressão de vários normativos candidatos em emparelhados viscerais e subcutâneas (SC) tecido adiposo espécimes obtidos de indivíduos obesos no momento da cirurgia bariátrica.

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Protocol

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o protocolo e exemplos aqui descritos foram aprovados por Boston Universidade escola de medicina institucional Review Board (IRB, protocolo #H-25644) e foram conduzidos de acordo com a declaração de Helsinque. Todos os temas fornecidos escrito consentimento informado antes participação.

1. preparação de soluções e vidro Micro cânulas

  1. preparar a solução salina de ácido 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Para 1 L, dissolver 8,059 g de NaCl, 0,298 g de KCl, 0,296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g de CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g de D-Glucose e 2,383 g HEPES de ácido em 950 mL de água deionizada água. Perfazer o volume de 1 L com água desionizada. Ajuste o pH para 7,4 usando NaOH. Tampão HEPES pode ser armazenado 7 dias a 4 ° C.
  2. Preparar a 20 x regulador de sal. Para 1L, adicionar 143,8 g NaCl, 7,0 g de KCl, 5,9 g MgSO 4 e 7,4 g de CaCl 2 • 2 H 2 O em 900 mL de água destilada. Completar o volume de 1 L com água desionizada. Armazenar a solução estoque em 4 ° C.
  3. Preparar a 20 x regulador. Para 1L, adicione 26,8 NaHCO 3 e 0,2 g EDTA·2H 2 O em 900 mL de água desionizada. Completar o volume de 1 L com água desionizada. Armazenar a solução estoque em 4 ° C.
  4. Prepara a solução de KREBS para ser usado durante os experimentos fisiológicos. Para 1L, adicione 900 mL de água deionizada, 50 mL de 20 x Buffer Stock, 50 mL de 20 x sal solução-tampão, 0,99 g de D-Glucose e 0,16 g KH 2 PO 4. Ajuste o pH para 7,4 usando HCl. Para manter o pH do buffer, mexa constantemente e cobrir com parafina ou bolha continuamente.
    1. Verificar o pH a cada 20 min. faça a solução de KREBS frescos diariamente.
  5. Fazer vidro micro cânulas com diâmetro interno de 40-240 µm usando um extrator de agulha/pipeta comercialmente disponível. O tamanho das cânulas de vidro é determinado pelo tamanho do diâmetro interno dos vasos sanguíneos isolados (50-350 µm). Como alternativa, comprar vidro micro cânulas do tamanho pré-determinado.

2. Preparação dos reagentes

  1. preparar a acetilcolina (Ach, 10 -2 M, solução estoque). Dissolva 18,29 g em 10 mL de água desionizada. Armazenar as alíquotas de 1 mL da solução-mãe (10 -2 M) a-80 ° C. No dia do experimento serialmente diluído para obter as seguintes concentrações de trabalho: 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
  2. Preparar a papaverina (2 x 10 -2 M, solução estoque). Dissolva 0,07517 g em 10 mL de água desionizada. Prepare-se 10 alíquotas µ l da solução estoque e loja a -80 ° C. serialmente diluir para obter 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M no dia do experimento.
  3. Preparar a endotelina-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solução estoque). Dissolver 50 µ g de endotelina-1 em 1 mL de 1% BSA/PBS. Armazenar as alíquotas de 1 mL da solução-mãe (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. No dia do experimento diluído para obter uma concentração de trabalho de 10 -10 M, no dia do experimento.
  4. Armazenar reagentes em ou-20 ° C ou até-80 ° C, dependendo do tipo de congelador disponível, mas não mais de 6 meses.

3. Coleção de tecido adiposo e preparação do navio

  1. recruta obesos homens e mulheres (índice de massa corporal (IMC) ≥ 35 kg/m ², idade ≥ 18 anos) inscritos no programa de cirurgia bariátrica no centro médico de Boston (BMC). Um total de 40 sujeitos participou nestas experiências.
  2. Coletar amostras de tecido de adiposo subcutâneo e visceral durante cirurgias bariátricos planejadas pelo cirurgião realizar a operação.
    1. Colheita subcutânea adiposo tecidos da parede abdominal inferior e visceral de gordura do omento maior, respectivamente. Tamanho de amostra de tecido adiposo típica varia de 3 a 10 mg de tecido.
      2. Tecidos
    2. lugar imediatamente no frio HEPES buffer de solução com um pH de 7,4 e loja a 4 ° C por até 24 h.
      Nota: Além disso, arteríolas adiposas pode ser obtidas de indivíduos magros também durante outros tipos de cirurgias tais como reparos de hérnia ou cirurgia plástica e também pode ser uma biópsia do depósito subcutâneo através de biópsia do tecido abdominal trans-cutânea < sup classe = "xref" > 6.
  3. Usando um microscópio de dissecação de tecido, micro tesouras e micropinça, Retire cuidadosamente circundante gordura e tecido conjuntivo de pequenas arteríolas adiposas (50-350 µm de diâmetro intraluminal, 2-3 mm de comprimento).
  4. Tie todos os ramos sobre as arteríolas usando minúsculo nylon ou seda suturas antes canulação sobre a pipeta capilar de vidro. Dissecar cuidadosamente as arteríolas desde que mesmo pequenos danos da parede da arteríola provoca alterações funcionais significativas. Exposição de navio
    1. minimizar a luz e calor que pode causar vasodilatação. Desde que pode ser às vezes difícil distinguir as arteríolas vênulas, identifica o tom de tamanho e musculatura lisa dos vasos por beliscando as pontas dos vasos. Arteríolas são geralmente menores e demonstrar o tom maior, em comparação com vênulas.
  5. Preparar a câmara de órgão. Lentamente, encha a pipeta capilar de vidro e tubo de borracha com solução de KREBS utilizando uma seringa de 10 mL.
  6. Uma vez que o tubo de borracha é preenchido e pipetas capilares de vidro estão submersos em solução de KREBS dentro da câmara de órgão, Canule as arteríolas firmemente sobre as seguras pipetas e amarre as duas extremidades da arteríola com nylon ou pontos de sutura de seda cuidadosamente.
  7. Encher a câmara de órgão com solução de KREBS até 2 mL.
  8. Secure câmara do órgão para um palco com o microscópio invertido (objetivo de ampliação 10 X / 0.25) e câmara de vídeo.
  9. Ativar o software de detecção de borda que é transmitido em tempo real a uma taxa de amostragem de 1 kHz (quadro 1/s).
  10. Conecte um lado do tubo de pressão para a solução de KREBS reservatórios cheios de pressão livre de microbolhas, como bolhas podem apresentar erro experimental. Ligue a outra extremidade do tubo pressurizado para a câmara de órgão.
  11. Conectar os reservatórios de pressão cheia de solução KREBS para o transdutor de pressão com tubo limpo.
  12. Controle de fluxo intra luminal, regulando a altura destes dois reservatórios; assim, quando os reservatórios são colocados na mesma altura, nenhum fluxo intra-luminal ocorrerá.
  13. , Uma vez que todos estes processos estão completos, ligar o aquecimento bloco e software programa para manter a temperatura a 37 ° C. continuamente perfundir o recipiente com solução de KREBS e ventilar com uma mistura de gás de 5% de CO 2, 21% O 2 e 74% N 2 7 , 8, ao longo de todo o procedimento experimental.
  14. Para atingir a pressão desejada insido lúmen dos vasos isolados, gradualmente, aumentar a pressão intraluminal (5 mmHg, cada 5 min) através da unidade de controle de pressão no painel myo-interface, fazê-lo em ritmo lento para evitar lesões da camada endotelial.
    Nota: Uma vez que a pressão atinge 60 mmHg, um período de equilíbrio de 20-30 minutos é necessário para estabilizar o navio. Todos os estudos da função vascular são executados em 60 mmHg e 37 ° C em pH 7,4. 7

4. Avaliação da função Microvascular adiposa

Nota: em geral, vasodilatação endotélio-dependente de arteríola adiposa pode aparecer em resposta a fisiológica (induzida pelo fluxo) e estímulos farmacológicos (Ach-induzida).

  1. Vasodilatação mediada por fluxo, endotélio-dependente
    1. após pressurização, gravar o diâmetro da arteríola adiposa em repouso (Di). Isto é referido como o descanso de diâmetro de base.
    2. Pre-constrição dos vasos sanguíneos para ~ 55% do diâmetro da linha de base de descanso (Dp) adicionando 1 µ l de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) diretamente para o banho e espere 5 min, para o efeito. Repita este processo até alcançar o desejado ~ 55% pre-constrito estado.
    3. Após pré-constrição, induzir o fluxo contínuo no espaço intraluminal de tecido adiposo arteríolas, em igual e direções opostas para que uma diferença de pressão pode ser desenvolvida através do navio sem alterar a pressão intraluminal média de 60 mmHg.
      Nota: por exemplo, se um reservatório move para cima por 10 cm de altura, o outro precisa ser movido para baixo por 10 cm para alterar gradientes de pressão e, assim, alterar intraluminal caudal. Se medições mais precisas de taxa de fluxo são desejadas, um sistema de medidor de fluxo quantitativa pode ser aplicado para a montagem experimental.
    4. Medir a dilatação fluxo-mediada 3-5 min após o início da indução fluxo. Os níveis de fluxo intraluminal (gradientes de pressão) podem ser na faixa de 0 - 100 cmH 2 O. aumentar a cada incremento de gradiente de pressão por Δ10 cmH 2 O cada 5-6 minutos, até um máximo de 100 cmH 2 O.
      Nota: A fim de induzir o fluxo laminar estável no lúmen, ambos os tamanhos de ponta de cânula de vidro micro precisam estar muito perto de diâmetro interno de arteríolas; caso contrário, ele irá produzir fluxo turbulento dentro do lúmen e induzir a erros de medição indesejados.
    5. Após a avaliação de dilatação fluxo-mediada, retornar reservatórios de pressão para a mesma altura (60 mmHg).
    6. Em seguida, lavar arteríola e câmara removendo imediatamente a solução da câmara e substitua com solução de KREBS fresca. Isso é feito com cuidado para não perturbar a arteríola suspensa dentro da câmara.
    7. Repita este processo 3 - 4 vezes por 20-30 min, ou até o vaso isolado retorna ao diâmetro do descanso da linha de base.
  2. Vasodilatação mediada por acetilcolina, endotélio-dependente,
    1. quando a arteríola adiposa retornou ao diâmetro do descanso da linha de base, pre-constrição vaso ~ 55% através da administração de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) diretamente para o banho, conforme descrito acima na seção 4.1.2.
    2. Após pré-constrição, sequencialmente, administrar doses crescentes (2 µ l) de acetilcolina, que é mediada por receptores, óxido nítrico agonista (Ach, 10 -9 a 10 -5 M) diretamente para o banho. Registrar a mudança de diâmetro arteriolar 5 min após a administração de cada dose.
    3. , Uma vez que o navio tem alcançado um platô após a administração da última dose Ach, lave o recipiente 3 - 4 vezes com solução de KREBS. Permitir que 20-30 min para navio recuperar e retornar ao diâmetro da linha de base de repouso. Para ajudar a manter o pH na curvatura do órgão, alterar a solução de KREBS cada 15 min.
  3. Incubar a arteríola com N w - nitro - l-éster metílico de arginina (L-NAME, 10 -4 M), um inibidor da óxido nítrico sintase por 30 min e em seguida repetir 4.2.1 e 4.2.2 para caracterizar a contribuição relativa da óxido nítrico, a vasodilatação mediada por Ach.
  4. Avaliar a vasodilatação endotélio-independente (função de músculo liso vascular) e viabilidade de navio por uma administração sequencial de doses crescentes de papaverina (10 -8 a 10 -4 M) diretamente para o banho. Se o diâmetro do vaso não voltar, ou exceder o diâmetro da linha de base (Di) descanso em resposta a papaverina (ou seja, vasodilatação apropriado), considera o navio inviáveis e descartar os pontos de dados.

5. Análise de dados e cálculo

  1. calcular a reatividade vascular. Use vasodilatação por cento para expressão de dados que representam as diferenças de base no diâmetro dos vasos e calcular através da seguinte equação:
    % vasodilatação = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
    onde DT é o diâmetro gravado em um ponto determinado tempo (máximo diâmetro), Dp é o diâmetro gravado após a adição do agente de vasoconstrição (i. e. ET-1 induzido diâmetro de constrição), e Di é o diâmetro gravado imediatamente antes da adição do agente de vasoconstrição (diâmetro de descanso da linha de base). 9
  2. definir a sensibilidade de vasodilatação e vasoconstrição (dose-resposta) para um agonista como a concentração de Ach, papaverina ou ET-1 que provoca 50% da resposta máxima (CE 50) que pode ser definido por um parâmetro sigmoidal e plotados, conforme descrito anteriormente. 10
    Nota: os estudos de reprodutibilidade inter observador de vasodilatação do tecido adiposo microvessels tem um alto coeficiente de correlação (CC) de 0,99 (n = 10 experimentos de embarcação) em nosso laboratório.

6. análise estatística

  1. Express contínua medições como média ± SEM. Estes tendem a ser normalmente distribuída. Analisar a reatividade vascular em arteríolas adiposas por medidas repetidas ANOVA de duas vias.
  2. Alternativamente, comparar a área sob a curva (AUC) da trama para vasodilatação cumulativa a dose-respostas entre os grupos de tratamento. Em todos os casos, considerar P < 0.05 estatisticamente significativo.

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Results

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Nosso laboratório tem usado tele-microscopia para examinar o endotélio-dependente e - vasodilatação independente, bem como a função de vasocontractile de tecido adiposo arteríolas isoladas de gordura subcutânea e visceral de humanos obesos. A montagem experimental característica é exibida na figura 1A. Tecido adiposo arteríolas são suspensas entre duas pipetas de vidro capilar e preso no lugar com suturas dentro da câmara de órgão, como mostrado na

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Discussion

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A dissecção e o isolamento de arteríolas adiposas dos tecidos circundantes podem ser um processo demorado e trabalhoso com cuidadosa atenção aos detalhes e protocolo técnico. O procedimento de microdissection exige habilidades meticulosas e utensílios especializados dissecação para evitar possíveis danos ao músculo liso ou endoteliais células camadas da microvasculatura. Até mesmo pequenas punções acidentais na parede arteriolar podem evitar pressurização intraluminal e resultados em um experimento mal sucedido. Além dis...

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Disclosures

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Os autores não têm divulgações ou conflitos de interesses ao relatório.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de agradecer os voluntários para a sua participação nestes estudos e a equipe cirúrgica no centro médico de Boston para a prestação de biópsias de tecido adiposo. Dr. Gokce é suportado pelo Instituto Nacional de bolsas de saúde (NIH), HL081587, HL114675 e HL126141. Dr. Farb é suportado pelo NIH conceder K23 HL135394.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome químico
AcetilcolinaSigma AldrichA6625
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma Aldrich223506
D-(+)-glicoseSigmaAldrich G5767
Endothelin-1Sigma AldrichE7764
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra ácido acético (EGTA)Sigma AldrichE3889
Ácido etilenodiaminotetra acético (EDTA)Sigma AldrichE9884
HEPESSigmaAldrich H3784
Nw-nito-L-arginina metil ester cloridratoSigma AldrichN5751
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma AldrichM7506
Cloreto de potássio (KCL)Sigma AldrichP3911
Fosfato de potássio (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PapaverineSigma AldrichP3510
Bicarbonato de sódio (NaHCO 3)Sigma AldrichS6014
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma AldrichS7653
Fosfato de sódio monobásico monohidratado (NaH2Po4)Sigma AldrichS9638
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipment
ForcepsFinescience tools15000-08
Microscópio invertidoZeiss Achromat
Laboratory tubingEuro-Pharm250100306F999
Extrator de agulhas/pipetasDavid kopf instruments720
Sutura de nylon monofilamento oftálmicoEspecialidades cirúrgicasA7756N
TesouraFinescience ferramentas150000-08
Câmara de vasoDMTVAS v.2.1

References

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