Aqui, apresentamos uma aplicação nova do ensaio do anel aórtico onde prelabelled as células mesenquimais são co cultivadas com redes endotelial derivado de aorta de ratos. Este novo método permite a visualização de células estromais mesenquimais (MSCs) homing e integração com redes endoteliais, quantificação das propriedades de rede e avaliação de expressão de gene e immunophenotypes MSC.
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Artigo de método
O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Angiogênese é um processo complexo, altamente regulamentado, responsável pela criação e manutenção de perfusão do tecido adequado. Manutenção de vascularização insuficiente e malformações patológicas podem resultar em graves doenças isquêmicas, enquanto excessivamente abundante desenvolvimento vascular está associado com câncer e doenças inflamatórias. Uma forma promissora de pro-angiogênico terapia é a utilização de fontes de célula angiogênico, que podem fornecer fatores regulatórios, bem como suporte físico para o desenvolvimento de recém vasculatura.
Células estromais mesenquimais (MSCs) são candidatos extensivamente investigados para regeneração vascular devido a seus efeitos parácrina e sua capacidade para detectar e lar de tecidos isquêmicos ou inflamados. Em particular, primeiro trimestre humana cordão umbilical perivasculares células (FTM HUCPVCs) são um candidato altamente promissor devido a suas propriedades como Pericito, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e parácrina robusta o seu perfil. Para efetivamente avaliar potencialmente angiogênico células regenerativas, é um requisito para testá-los em confiável e ensaios pré-clínicos "traduzíveis". O ensaio do anel aórtico é um ex vivo modelo de angiogênese que permite a fácil quantificação de estruturas tubulares endoteliais, fornece acessórias apoia células e matriz extracelular (ECM) do host, exclui componentes inflamatórios e é rápida e barata para configurar. Isto é vantajoso em relação na vivo modelos (por exemplo, ensaio da córnea, Matrigel ficha de ensaio); o ensaio do anel aórtico pode rastrear as células administradas e observar interações intercelulares, evitando a rejeição de xeno-imune.
Apresentamos um protocolo para um aplicativo de romance do ensaio do anel da aorta, que inclui a humanas MSCs em culturas co com desenvolvimento rato aórtica endotelial das redes. Este ensaio permite a análise da contribuição da MSC para tubo de formação e desenvolvimento através de interações físicas como Pericito e de sua potência para ativamente migrando para sites da angiogênese e para avaliar sua capacidade de realizar e mediar Processamento de ECM. Este protocolo fornece mais informações sobre as alterações na expressão de gene e fenótipo MSC seguinte co-cultura.
Introdução
O complexo processo de angiogênese melhora e mantém a perfusão do tecido, promovendo o desenvolvimento de embarcação de sangue novo de pré-existente vasculatura1. É um processo rigidamente regulamentado, equilibrado por fatores pro-angiogênico e antiangiogênico. Qualquer deficiência neste sistema pode conduzir a embarcação insuficiente manutenção ou crescimento, causando graves doenças isquêmicas, incluindo doença do miocárdio, acidente vascular cerebral e doenças neurodegenerativas. No entanto, exagerado desenvolvimento vascular é característica para as condições, incluindo câncer e doenças inflamatórias2.
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Protocolo
todos os estudos que envolvam animais foram conduzidos e relatados de acordo com orientações de chegada 29. Todos os estudos foram realizados com a aprovação do Conselho de pesquisa institucional ética (número de REB 4276). Animal de todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do University Health Network (Toronto, Canadá), e todos os animais receberam atendimento humano em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, 8 th edição ( Institutos nacionais de saúde 2011).
1. configuração de ensaio de anel da aorta
- isolar a aorta de rat....
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Resultados
O fluxo de trabalho esquemático para estabelecer o ensaio de co-cultura de anel/MSC aórtica é demonstrado na Figura 1. As etapas principais incluem: rato isolamento da aorta, seccionamento e incorporação dos anéis da aorta, monitoramento da brotação endotelial e desenvolvimento da rede e finalmente a rotulagem e administrando os MSCs. A linha do tempo da análise endotelial rede descreve a janela para as análises viáveis para cada período de cultivo co: dia 1,.......
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Discussão
Existem vários estágios críticos na criação de um ensaio de anel aórtico bem sucedida experiência de co-cultura MSC. Primeiro, os passos mais importantes quando isolando e aorta de corte são: 1) obtenção exclusivamente o segmento torácico da aorta; 2) cuidadosamente removendo a ramificação dos vasos sanguíneos, o conjuntivo e o tecido adiposo e; 3) seções até corte da aorta (~ 1mm) para limitar a variabilidade entre cada ensaio. Em segundo lugar, a incorporação de sucesso dos anéis da aorta em BME é fundamental para este.......
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Divulgações
Dr. Clifford L. Librach é co-titular da patente: métodos de isolamento e o uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical do primeiro trimestre. Concedido no Canadá e Austrália.
Agradecimentos
Os autores agradecer aos seguintes membros funcionários e pessoal de pesquisa: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Sarah Laronde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | para meios de cultura FTM HUCPVC e BMSC. |
| APC-conjugado anti humano TRA-1-85 | R & D Systems | FAB3195A | Marcador celular específico para humanos para citometria de fluxo e classificação celular Extrato |
| membrana basal (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | Para incorporação de aorta |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Inclui: Gentamicina/Anfotericina-B (GA)Fator de Crescimento Epidérmico humano (hEGF); Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF); R3- Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-1 (R3-IGF-1); Ácido Ascórbico; Hidrocortisona; Fator de Crescimento de Fibroblastos Humanos-Beta (hFGF-β); Heparina; Soro Fetal Bovino (FBS). Necessário para preparar EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | Para coloração de MSCs, o verde é captado de forma óptima pelas MSCs |
| Microscópio de Cultura CKX53 | Olympus | Para imagens de campo claro do desenvolvimento da rede endotelial | |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | C10227 | Contagem de células para cultura MSC, citometria de fluxo e qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | Para dissociar co-culturas de anel aórtico-MSC (pré-aquecer a 37 ° C) |
| Bisturis estéreis descartáveis | VWR | 21909-654 | Para seccionar a aorta |
| Dulbecco's fosfato tamponado solução salina | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio |
| Meio basal endotelial (EBM) | Lonza | CC-3156 | Meio basal necessário para a cultura de co-culturas de ensaio de anel aórtico-MSC (quente a 37 ° C antes de usar). Necessário para EGM e EBM-FBS |
| Etanol, 70%, Grau de Biotecnologia | VWR | 97064-768 | Para esterilizar superfícies |
| EVOS | Life Technologies | Microscópio fluorescente interno para rastrear a migração e integração de MSC | |
| Soro fetal bovino (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Componente de soro do meio de cultura de células |
| Anticorpo anti-CD31 conjugado com FITC | BD | 558068 | Marcador endotelial humano para citometria de fluxo |
| anti-CD146anticorpo conjugado com FITC | BD | 560846 | Marcador de pericito humano para citometria de fluxo |
| Fórceps | Almedic | 7727-A10-704 | Para entregar tecido de rato. Pode usar qualquer fórceps semelhante |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio |
| HERAcell 150i CO2 Incubadora | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | Para incubação de células |
| Angiogênese Humana RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Específico para humanos e inclui primers para 84 genes envolvidos na angiogênese. Cada poço é 1 reação de primer |
| ImageJ | Software de processamento de imagem de código aberto. Requer o plug-in do analisador de angiogênese | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. Para citometria de fluxo. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Instalação. Para classificação de células. | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140122 | Componente antibiótico para tampões e meio de cultura celular |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Para purificação de RNA. Inclui tampão de lise celular |
| RT2Easy Kit de primeira fita | Qiagen | 330421 | Para preparação de cDNA para qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Kit de Síntese | Qiagen | 330451 | Pré-amplificação de cDNA se RNA de baixo rendimento |
| Tesoura cirúrgica | Ferramentas de Ciência Fina | 14059-11 | Para cortar pele, músculo e aorta |
| Gaze estéril | VWR | 3084 | Para umedecer e esterilizar o pêlo do peito |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | enzima de dissociação MSC pré-aquecer a 37 &graus; C |
| 0,2 μ unidade de filtração de poros m | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | Para esterilizar meios de cultura de tecidos |
| 0,25% Tripsina/EDTA | Gibco | 25200056 | Para dissociação celular, pré-aquecer a 37 ° C |
| 10 cm placas de cultura de tecidos | Corning | 25382-428 | Para limpeza e seccionamento de aorta e cultura de células MSC |
| 12 placas de cultura de células de poço | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | Para a configuração de ensaio de anel aórtico-co-co-culturas MSC |
| Tubo de 15 mL | BD Falcon | 352096 | Para procedimentos gerais de cultura de tecidos |
| 70 μ filtro de células m | Fisherbrand | 22363548 | Para garantir uma suspensão de célula única antes da citometria de fluxo ou classificação |
Referências
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J.
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Reimpressões e permissões
