Summary
提案するミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティを統合ヌクレオソーム密度チップ seq 解析フレームワークに適したシーケンス データセットの生成 (チップ seq) 方法論をシーケンス変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降ヒストン修正測定。
Abstract
(チップ seq) 実験的プロトコルとガウス混合分布解析手法 (ヌクレオソーム密度チップ seq; ndChIP seq) の生成を可能にする互換性のある配列変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降を提案します。ヒストン修飾ゲノムとミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティの結合された測定。ヌクレオソームの位置と局所密度と翻訳後修飾ヒストン亜単位のローカル転写状態を規制するコンサートで行動します。NdChIP シーケンスによって生成されたヒストン修飾とヌクレオソーム アクセシビリティの組合せ測定は、これらの機能の同時の尋問のためことができます。NdChIP seq 方法論ベースのチップ seq プロトコルを架橋にアクセスできない一次電池の小さな数字に適用されます。NdChIP seq 一緒に取られて、珍しい主細胞内 RNA 転写を制御する共有メカニズムへの新しい洞察を取得するローカル ヌクレオソーム密度とヒストン修飾の組み合わせでの測定が可能。 にします。
Introduction
真核生物のゲノムは、146 の塩基対の DNA1,2に囲まれた 4 つのヒストン蛋白質 (例えばH2A、H2B、H3、および H4) の 2 つのコピーを含むヌクレオソーム構造を繰り返しを介してクロマチンにパッケージされています。クロマチン改造複合体遺伝子プロモーターの境界内のヌクレオソームの位置を制御し、dna の転写因子、RNA ポリメラーゼ機械3、アクセシビリティを変更することにより遺伝子発現の調節に関与 4。
ヌクレオソームのヒストンのアミノ ターミナル尾はアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、sumo 化、化、および特定のアミノ酸5の水酸化反応を含む種々 の共有結合修飾を受ける,6,7,8します。 位置とこれらの変更の度転写7のアクティベーションを許可する分子複合体のクロマチン構造と制御アクセスに影響を与えるクロマチンの状態を決定します。ヌクレオソームの密度とヒストン修正9の同時測定を可能にするネイティブ チップ アプローチを開発私たちことを考えると両方のヌクレオソーム密度とヒストン修飾は、遺伝子転写のローカル制御の役割を果たす、 10。
ネイティブ チップ seq エンドヌクレアーゼ球菌ヌクレアーゼの本来の状態、核11,12ヌクレオソームの13の配置をマップに活用されているプロパティ内でそのままクロマチンを消化する (MNase) の活用します。,14,15. ヌクレオソーム密度チップ seq (ndChIP-seq) MNase アクセシビリティを組み合わせてヒストン修正10測定を生成するクロマチン領域を開く MNase の優先的なアクセスのプロパティを活用します。ndChIP seq は珍しい初代培養細胞、組織および培養細胞におけるヒストン修飾のプロファイリングに最適です。ここでは、フラグメント サイズのポスト免疫沈降、ペアエンドに境界を読むによって決定を統合する前述の分析フレーム作業10に適したシーケンス データセットの生成を可能にする詳細なプロトコルを提案します。同時にヒストン修正測定 MNase アクセシビリティを調査します。以前は、このプロトコルの 10,000 の主な臍帯血への応用派生 CD34+細胞とヒト胚性幹細胞はこれらの内のクロマチン構造とヒストン修飾関係のユニークな携帯型10 明らかに.ヌクレオソーム アクセシビリティとヒストン修飾を同時に測定する能力を与え、ndChIP seq は単一ヌクレオソーム レベルで細胞のエピゲノム機能を明らかにし、解決に異種の署名が可能です、構成要素。NdChIP seq によって異種の細胞集団の探査の例は H3K4me3、アクティブなマークと H3K27me3、抑圧的なマークの両方が現在10二価プロモーターの調査です。
Protocol
注: このプロトコルの最小の入力が単一の免疫沈降 (IP) 反応あたり 10,000 のセルです。提供されている実験ワークシートを印刷し、実験を計画するためのガイドラインとして利用します。室温で孵化は ~ 22 ° C でと見なされます。すべてのバッファー調理法は、表 1に提供されます。すべてのバッファーは、4 ° C で保存し、特に明記しない限り、中には、氷で冷やしてください。
1. セル準備
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培養細胞
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 1 mL の細胞を洗浄し、検定を用いた細胞濃度を正確に決定します。以上 100 万セルがある場合は、PBS のボリュームを上げます。
- 滅菌 1.5 mL チューブとスピン ・ ダウン (500 g) x 4 ° C で 6 分間に 70,000-100,000 細胞と同じ細胞数、分注に基づくピペットを使用して、ゆっくりと削除し (細胞ペレットを妨げないで) 上澄みを廃棄し、冷たい換散バッファー + 1 プロテアーゼ抑制剤のカクテル (PIC) 1000 個の細胞の濃度を x でペレットを再懸濁します/μ L. 20 30 上下ピペッティングでよく混ぜる回。細胞塊が中断されることが重要です。泡を作成しないようにします。
- NdChIP seq プロトコルの日 1 (セクション 2) に直接進むか、液体窒素、-80 ° C でストア フラッシュ凍結細胞ペレット
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並べ替えられた細胞
- ハンクのバッファリングされた塩溶液 (HBSS) または PBS + 2% ウシ胎児血清 (FBS) の 350 μ L で 1.5 mL チューブに 70,000-100,000 ソート16セルを収集します。
- 各セルの 4 ° C で 6 分間 500 x g で割り切れるスピンダウンします。ピペットを使用して、ゆっくりと (細胞ペレットを妨げないで) 上澄みを除去し、冷えた換散バッファー + 1 で再懸濁します 1,000 セルの最終的な集中に PIC x/μ L。 上下ピペッティングでよく換散バッファーのミックス 20 ~ 30 倍。細胞塊が中断されたことを確認します。泡を作成しないようにします。
- NdChIP seq プロトコルの日 1 (セクション 2) に直接進むか、液体窒素、-80 ° C でストア フラッシュ凍結細胞ペレット
2. 1 日目: ndChIP-seq
- 抗体ビーズ複合体の作製
- 37 ° C の水浴と氷のバケツを準備します。氷に取り組んで、1 x IP バッファー/1 PIC x と 1 x (Ab) 抗体希釈バッファー準備、氷のそれらを保ちます。4 ° C の記憶域、およびミックスから穏やかなパルス ボルテックスによって非常によく蛋白質 A (または G) 磁気ビーズ (選択基準の説明を参照) を取得します。氷の上におきます。
注: パルス ボルテックス チューブ内における渦が形成されるたびに、ボルテックスが停止しているを意味します。 - 新しい 2 mL のチューブに IP 反応あたり 24 μ L 蛋白質 A (または G) の磁気ビーズを転送します。ビーズの量を記録して、氷のチューブ。168 μ L = 例、7 ips 7 x 24 μ L を使用します。
- チューブ マグネット チューブを配置し、明確に示すビーズ分離になるソリューションを待ちます。ビーズを乱すことがなく慎重にピペットを使用して上清を削除し、破棄します。管磁石をチューブに乗り、氷の上に置きます。
- 冷たい IP バッファーの等しいボリューム (つまり、最初の量のビーズ) + 1 x 写真のミックスを追加します。上下にピペッティングで混ぜます。ボルテックスにかけないでください。
- IP バッファー + 1 x 写真 + 管磁石にビーズを配置し、明確に示すビーズ分離になるソリューションを待ちます。ビーズを乱すことがなく慎重にピペットを使用して上清を削除し、破棄します。3 洗浄の合計は冷たい IP バッファー + 1 X 2 写真洗浄・回を繰り返します。
- 最終的な洗浄の後は、冷たい IP バッファーの等しいボリューム (つまり、最初の量のビーズ) + 1 x 写真のミックス ビーズを再懸濁します。上下にピペッティングで混ぜます。ボルテックスにかけないでください。氷の上の管を保ちます。
- 氷の上 25 mL V 字貯水池に IP バッファー + 写真の 10 mL を注ぐ。冷たい IP バッファーの 130 μ L + きれいな V 下 96年ウェルの個々 の井戸に PIC ミックス x 1 を追加マルチ チャンネル ピペットを使用してプレート。IP ごとに 1 つの井戸を埋めます。ラベルとしてプレート「Ab ビーズ ・ コンプレックス」。
- 含む IP バッファー + 写真、それぞれに 12 μ L 洗浄の蛋白質 A (または G) の磁気ビーズを追加し、上下ピペッティングで混ぜます。氷の上の残りの洗浄ビーズをしてください。
- 必要な場合、検証済みの抗体を氷の上冷蔵その融解から取得します。氷に取り組んで、希釈濃度を表 2に示す 1 x Ab 希釈バッファーで抗体です。
- Ab ビーズ複雑なプレートの各ウェル、適切な希薄化後の抗体 (表 1) の 1 μ L を追加します。抗体キーに井戸を記録します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、上下に 20 回ピペッティングで各行をミックスします。ヒント行間を変更します。Ab ビーズ複雑なプレートをアルミ製プレート カバーと非常によくシールし、4 ° C で 2 時間、少なくとも回転プラットフォームで孵化させなさい。
注: このインキュベーションは、2.4 ステップを開始する準備ができるまで進むことができます。
- 37 ° C の水浴と氷のバケツを準備します。氷に取り組んで、1 x IP バッファー/1 PIC x と 1 x (Ab) 抗体希釈バッファー準備、氷のそれらを保ちます。4 ° C の記憶域、およびミックスから穏やかなパルス ボルテックスによって非常によく蛋白質 A (または G) 磁気ビーズ (選択基準の説明を参照) を取得します。氷の上におきます。
- セル換散とクロマチン消化
- 換散バッファー x 1 + PIC x 1 と MNase 1 mL を準備氷に取り組んで、私希釈バッファー (表 3) と氷のそれらを保ちます。
- -80 ° C ストレージから (または氷、新鮮な場合) 細胞ペレットを取得します。37 ° C の水浴 10 秒、その後氷への転送の各細胞ペレットを解凍します。
- 各細胞ペレット冷たい 1 x 換散バッファー + 1 x 10,000 のセル/20 μ L と 10 回ピペッティングによるミックスの最終濃度に PIC を上下に、泡を作成することがなくすぐに追加します。たとえば、70,000 セル最終巻は 140 μ L です。
- 氷、因数の 20 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートに結果の lysates に取り組んでいます。プラスチック シール プレート カバーし 20 分ラベル プレート「MNase 消化」氷の上をインキュベートし、テンプレートのキーに井戸を記録します。クロマチン消化反応の正確なタイミングを保証するために同時にサンプルの以上 2 行で消化に続行しないでください。
- 20 分溶解が完了したら、直前に希釈、MNase 私 MNase 酵素私希釈バッファー、20 U/μ L の最終的な集中に、氷の上にそれを維持します。
- 氷に取り組んで、準備、MNase 私消化貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行に表 4とミックス サンプルに加えて、5 μ L のデッド ボリュームの行ごとの 20 μ L 分注によるとミックスをマスターし、氷の上にそれを維持します。2 つの行のボリュームがする必要があります: (x 2 20 μ L) + 5 μ L = 45 μ L。
- Lysates の孵化が終わったら、氷から MNase 消化プレートを取り外します。マルチ チャンネル ピペットを使用して MNase の 20 μ L を追加私消化サンプルの行ごとにミックス マスターし、上下にピペットで 10 回をミックスします。ヒント行間を変更します。まさに 5 分間室温でインキュベートします。
- 5 分後に反応を停止し、マルチ チャンネル ピペットを使用して 250 μ M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 6 μ L を追加するサンプルの行ごとに、上下を混ぜるを数回します。ヒント行間を変更します。EDTA 添加後ピペットの設定に切り替えて 20 μ L とミックス 10 回消化反応の完全な停止を確保するために上下にピペッティングによる。ヒント行間を変更します。
- 消化のサンプル、MNase の各行に、マルチ チャンネル ピペットを使用して、上下に 10 回ピペッティングでよく換散バッファーとミックス x 10 の 6 μ L を追加します。プラスチック シールでカバーし、15 分間氷の上を孵化させなさい。
- 入力分離と前清算
- プールのすべての井戸同じは 1 つ、滅菌にペレット/テンプレートを携帯用中古冷蔵 (あらかじめテンプレート ID の付いた) 1.5 mL チューブ、ミックス、氷氷の上の作業 15 分インキュベーションを徹底的に次が、ゆっくりとピペットを使用して洗剤の泡を避けるために。
- 各細胞ペレットにもテンプレートの消化のクロマチンに新しい滅菌、(あらかじめテンプレート ID のラベル)、0.5 mL チューブと 4 ° C でストアの 8 μ L を夜通し転送します。これは、入力コントロールとなります。
- 新しい 96 ウェル プレートに 48 μ 因数で消化されたクロマチンの残りのボリュームを配布します。A01 A06 の井戸に入る細胞ペレット/テンプレート 1、細胞ペレット/テンプレート 2ウェルズ A07 A12 等に入る。テンプレートのキーに井戸を記録します。プレート「事前清算」にラベルを付けます。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、追加 IP バッファー x 1 + PIC x 1 の 120 μ L と 12 μ L 洗浄蛋白質 A (または G) 磁気ビーズの前クリア プレートの各ウェルに 2.3.3 のステップから。上下に 10 回ピペッティングで各行をミックスします。ヒント行間を変更します。アルミ プレートとプレートを非常によくシールし、最低 2 h のための 4 ° c 回転プラットフォームで孵化させなさい。
- 免疫沈降反応
- この手順を開始する前に必ず Ab ビーズ複雑なプレート (ステップ 2.1.10) と前クリア プレート (手順 2.3.4) が少なくとも 2 h. クイック スピン 10 遠心分離による両方の板を温められた 200 x g で s。
- プレート マグネット (ステップ 2.1.10) から Ab ビーズ複雑なプレートを置き、待つ 15 s クリアになる解決のため。慎重に削除し、ビーズを乱すことがなくピペットを使用して上澄みを廃棄します。プレート マグネットからプレートを削除し、氷の上にそれを維持します。
- プレート マグネット (手順 2.3.4) から前清算反応プレートを置き、待つ 15 のビーズを分離してクリアになるソリューションです。ビーズを乱すことがなく複雑なプレート上に残ります氷とミックスゆっくり 15 回上下にピペッティング Ab ビーズの対応する井戸にピペットを使用して上清を慎重に転送します。シール プレートもアルミ製カバー プレートし、インキュベートは、回転台に 4 ° c (12-18 h) を一晩します。プレート「IP 反応」のラベルを変更します。
3. 2 日目: ndCHIP-seq
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洗浄および溶出
- 65 ° C まで加熱ミキサーを設定します。氷の上低塩洗浄バッファー、高食塩洗浄バッファーを準備します。クイック スピン 10 ステップ 2.4.3 から IP リアクション プレート 200 x g で s。
- プレート マグネットに IP リアクション プレートを配置し、15 を待って s クリアになる解決のため。マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく、慎重に削除し、上澄みを廃棄します。プレート マグネット オフ板を取るし、氷の上に置きます。
- IP リアクション プレートのサンプルの行ごとに、上下にビーズを完全に再懸濁しますバッファーとミックス 10 回ゆっくりと洗って冷たい低塩分の 150 μ L を追加します。
- プレート マグネットに IP 反応プレートを置き、複数は、ビーズを待つ、マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく削除し、上澄みを廃棄します。氷の上にバック プレートを置き、手順 3.1.3 と 3.1.4 2 洗浄の合計の。
- 氷の上 IP リアクション プレートのサンプルのそれぞれの行に追加を上下にビーズを完全に再懸濁しますピペッティングによるバッファーとミックスゆっくり 10 回洗浄高塩 150 μ L。
- プレート マグネットに IP 反応プレートを置き、複数は、ビーズを待つ、マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく削除し、上澄みを廃棄します。氷の上 IP 反応プレートを置き、あらかじめ横に新しい 96 ウェル プレートを冷やします。
- IP リアクション プレートのサンプルの行ごとに、150 μ L 高い塩の洗浄バッファーとミックスゆっくり 10 回上下にビーズを完全に再懸濁しますピペッティングでを追加します。巻き上がり後、新しい、事前に冷やして、96 ウェル プレートの対応する行にサンプルのそれぞれの行を転送します。ラベル プレート「IP 反応」。古いプレートを破棄します。
- プレート マグネットに新しい IP リアクション プレートを配置し、分離するビーズを待ちます。マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく、慎重に削除し、上澄みを廃棄します。室温でプレートを維持します。
- IP リアクション プレートのサンプルのそれぞれの行にチップ溶出バッファー (EB) の 30 μ L を追加し、ピペッティングを上下にゆっくりと 10 回をミックスします。バブル形成を防止することを確認します。
- PCR カバー、プレートをシールし、1,350 rpm の混合速度で 1.5 h の 65 ° C で加熱ミキサーで孵化させなさい。
- 4 ° C で 1 分 200 x g で IP リアクション プレート 1.5 時間培養後スピンダウンします。50 ° C に加熱ミキサーの設定を変更します。
- スピン後 IP リアクション プレート プレート マグネット、オフにソリューションを待ちます。マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく慎重に上澄みの 30 μ に転送新しい 96 ウェル プレート。新鮮なヒントを使用して、行ごとに。ラベル プレート「IP 反応」室温で保管してください。
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タンパク質の消化
- 4 ° C の冷蔵庫から 30 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ17 (バッファー組成表) ソリューションを取得し、重要な少なくとも 30 分は室温でそれを維持: ビーズ ソリューション完全に進む前に部屋の温度に達することを確認します。
- 4 ° C の記憶装置 (ステップ 2.3.2) とクイック スピンから入力コントロールのサンプルを取得します。ピペットを使用してボリュームを測定し、純水各コントロールに追加入力 30 μ L の最終巻は、事前に選択された入力の井戸 (空井戸) に入力コントロール サンプルを転送の IP リアクション プレート (ステップ 3.1.12) にします。サンプル キーに井戸を記録します。
- 氷の上貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行に表 5および分注の等量に示すタンパク質消化マスター ミックスを準備します。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、IP リアクション プレートのサンプルのそれぞれの行にタンパク質消化マスター ミックスの 40 μ L を追加し、上下にゆっくりと 10 回をミックスします。PCR カバー、プレート シール、1 分の 200 x g でスピン ・ ダウンと 650 rpm に設定で 30 分間 50 ° c 加熱ミキサーで孵化させなさい。プレートを培養すると、新鮮な 70% エタノール (エタノール) の準備、部屋の温度でそれを維持します。
- 30 分インキュベーションの完了後、スピン 1 分、4 ° C の 200 x g で IP リアクション プレート室温でプレートを維持します。
注: 合計ボリュームは、今 〜 70 μ L/ウェルでする必要があります。
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30 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ水溶液を用いたビードきれいアップ
- 分注ペグ/1 M NaCl 磁気の室温 30% きれいな 96-well 貯水池プレートの 1 つの行にソリューションのビーズ (サンプルあたり 75 μ L 行の # x)。
- 常温、マルチ チャンネル ピペットを使用して IP リアクション プレートのサンプルのそれぞれの行に 30 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションの 70 μ L (1:1 の比率) を追加し、上下にピペッティングして 10 回を混ぜます。ヒント行間を変更します。室温で 15 分間プレートを孵化させなさい。
- プレート マグネット プレートを置き、分離するビーズを許可するように 5 分間インキュベートします。
- ビーズを乱すことがなく、ピペットを使用して、慎重に削除し、上澄みを廃棄します。ビーズをしてください。
- IP リアクション プレートはまだプレート マグネット、室温 70% の 150 μ L を追加サンプルのそれぞれの行に、マルチ チャンネル ピペットを使用してエタノール 30 インキュベートと s。後 30 秒、マルチ チャンネル ピペットを使用して削除し、上澄みを廃棄します。2 洗浄の合計の 1 つのより多くの時間をこの手順を繰り返します。
- 2 番目のエタノール洗浄後 3 分は視覚的にすべてのエタノールが蒸発するように板を検査のため '乾燥' プレート マグネット プレートを孵化させなさい。ない場合は、1 分の過剰乾燥低収量でビーズ結果プレートを孵化させなさい。
- プレート マグネットとマルチ チャンネル ピペットを使用してプレートを取る 35 μ L EB (資材表) を追加します。上下に 10 回のピペッティングでよく混ぜます。ヒント行間を変更します。溶出に 3 分間、室温でインキュベートします。
- インキュベーション後、プレート マグネットに IP 反応プレートを置き、2 分間インキュベートします。ビーズを分離する必要があります、ソリューションが明確になります。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、ビーズを乱すことがなく慎重に上清に転送の新しい 96 ウェル プレート対応する井戸。
- アルミ製プレート カバー プレートをシール、「IPed + 入力 DNA」をラベル付けし、長期的に一晩の 4 ° C または-20 ° C でを保存 (> 48 h) ストレージ。
4 3 日目: 図書館の建設
- 最後の修理およびリン酸化
- 最後の修理/リン酸化反応の入力は、IPed ステップ 3.3.10 からプレートを入力。解凍後、4 ° C で 1 分 200 x g でプレートをスピンダウンし、氷の上にそれを維持します。
- -20 ° C のフリーザー (酵素) を除く試薬のすべては、最後の修理/リン酸化反応 (表 6) に必要なそれらを室温で解凍し、氷にすぐに転送から取得します。
- 氷を取り組んで、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに最終修理/リン酸化マスター ミックスを設定する表 6に従ってください。すべて非酵素成分の添加後パルス ボルテックスでよく混ぜるし、氷の上にチューブを配置します。
- 低温貯蔵と輸送から冷蔵チューブ クールなラックでベンチに関連する酵素を取得します。チューブ、クイック スピンは、フリックすることで各々 の酵素をミックスし、冷蔵チューブ クールなラックに戻した。酵素をピペッティングするとき、正確な量の転送を保証するためにゆっくりと吸引します。添加後、上下ピペッティングによるマスター ミックスで先端を洗浄します。
- 酵素を追加すると、一度軽くパルス渦マスター ミックス 5 回すべてのコンポーネント、クイック スピンの均一な分布を保証、すぐにチューブには氷の上バックアップします。
- 氷、因数新しい貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行に最終修理/リン酸化マスター ミックスの適切なボリュームの上ボリュームを検体: (15 μ L 行の # x) + 5 μ L のデッド ボリューム。2 つの行の計算の例: (15 μ L x 2) + 5 μ L = 35 μ L/ウェル。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、サンプルのそれぞれの行に最終修理/リン酸化マスター ミックスの 15 μ L を追加し、上下にピペットで 10 回を混ぜます。ヒント行間を変更します。プラスチック製のカバー プレートをシール、4 ° C で 1 分 200 x g でスピン ・ ダウンと 30 分間室温でインキュベートします。
- 最後の修理やリン酸化後のビード - クリーンアップ
- 4 ° C の冷蔵庫から 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションと 30 %peg/1 M NaCl 水溶液取得し、少なくとも 30 分は室温で孵化させなさい。
注: 30 %peg/1 M NaCl 水溶液しないにはには、磁気ビーズが含まれています。 - どちらのソリューションでも部屋の温度に達すると、各サンプルの 30 %peg/1 M NaCl と 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションの 1:2 ミックス 80 μ L を準備します。24 のサンプルのための例: 24 = 1,920 x 80 μ L μ L (30% の 640 μ L ペグ/1 M NaCl と 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションの 1,288 μ L)。
- 分注ビーズ ソリューション ミックス、等量、貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行に、部屋の温度でそれを維持します。因数の EB バッファー (40 μ L サンプル/行の # x) きれいな 96-well 貯水池プレートの 1 つの行に。2 つの行のための例: 40 μ L 2 = 80 x μ L/ウェル。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、75 μ L で作製したビーズ ミックスの 4.2.2 サンプルの各行をステップイン ステップ 4.1.7 から、上下に 10 回ミックスを追加します。ヒント行間を変更します。手順 3.3.3-3.3.10 で説明したよう 15 分続けるクリーン アップ プロシージャのビードの室温で孵化させなさい。プラスチック シール、クイック スピン プレート カバー、氷の上に置きます。4.3 の手順に進みます。
- 4 ° C の冷蔵庫から 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションと 30 %peg/1 M NaCl 水溶液取得し、少なくとも 30 分は室温で孵化させなさい。
- A テーリング反応
- A テーリング反応 (表 7) 必要な試薬 (酵素) を除くすべて-20 ° C のフリーザーから取得、それらを室温で解凍し、すぐに氷に転送。
- 氷を取り組んで、滅菌 1.5 mL 遠心チューブにはテーリング マスター ミックスを設定するテーブル 7に従ってください。手順 4.1.4-4.1.6 で説明している一般的な酵素 brew セットアップ指示に従います。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、サンプルのそれぞれの行に A テーリング マスター ミックスの 15 μ L を追加し、上下にピペットで 10 回を混ぜます。ヒント行間を変更します。PCR のカバー プレートをシール、4 ° C で 1 分 200 x g でスピン ・ ダウンと 37 ° c 30 分たちで孵化させなさい。インキュベーション後、1 分の 200 x g でプレートをスピンダウンし、部屋の温度でそれを維持します。
- A テーリング後のビード - クリーンアップ
- 4.2 の手順で説明されている手順を実行します。プラスチック シール、ラベル「A 尾 + BC」クイック スピン、プレート カバー、氷の上に置きます。4.5 の手順に進みます。
- アダプター結紮
- アダプターの ligation の反作用 (表 8) 必要な試薬 (酵素) を除くすべて-20 ° C のフリーザーから取得、それらを室温で解凍し、すぐに氷に転送。
- 10 μ M PE アダプター (補足表 1) 原液を取得し、希釈を 0.5 μ M の EB を使用します。パルス ボルテックスでよく混ぜます。必要なボリュームは 3 μ L x サンプル数。氷、分注に 0.5 μ M PE アダプター、等量、96 ウェルきれいな貯留層板の 12 の井戸に取り組んでいます。氷の上におきます。
- 氷を取り組んで、滅菌 1.5 mL 遠心チューブにアダプター結紮マスター ミックスを設定するテーブル 8に従ってください。手順 4.1.4-4.1.6 で説明している一般的な酵素 brew セットアップ指示に従います。5 の X クイック結紮バッファーが完全に解凍と非常によく混合使用する前にあることを確認します。
- 氷上では、因数新しい貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行にアダプター結紮マスター ミックスの適切なボリューム。たとえば、2 つの行の計算: (23 μ x 2) + 5 μ L = 51 μ L/ウェル。氷の上のプレートを保ちます。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して追加 0.5 μ M の 2 μ L 4.4.1 のステップおよびミックスからのサンプルの各ローに対端 (PE) アダプター。ヒント行間を変更します。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、サンプルのそれぞれの行にアダプター結紮マスター ミックスの 23 μ L を追加し、上下にピペッティングで 15 回を混ぜます。ヒント行間を変更します。金属製のカバー、ラベル「結紮」、4 ° C で 1 分 200 x g でスピンダウンとプレートを密封し、、一晩室温で孵化させなさい。
- 4 日目: ビーズ クリーンアップ #1 アダプター結紮後
- 4 ° C の冷蔵庫から 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションを取得し、少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。解決の平衡準備新鮮な 70 %etoh。
- 因数 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューション、サンプル、96 ウェルの貯蔵所の 1 つの行にあたり 55 μ L プレートし、部屋の温度でそれを維持します。2 つの行のための例: 55 μ L 2 = 110 x μ L/ウェル。
- EB バッファー サンプル、きれいな 96-well 貯水池プレートの 1 つの行にあたり 50 μ L 分注。2 つの行のための例: 50 μ L × 2 = 100 μ L/ウェル。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、手順 4.5.6 から結紮プレートのサンプルの行ごとに 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ溶液 48 μ L を追加し、上下に 10 回混ぜます。ヒント行間を変更します。手順 3.3.3-3.3.7 で説明したよう 15 分続けるクリーン アップ プロシージャのビードの室温で孵化させなさい。
- プレート マグネットとマルチ チャンネル ピペットを使用してプレートを取る 45 μ L EB (資材表) を追加します。上下に 10 回のピペッティングでよく混ぜます。ヒント行間を変更します。溶出に 3 分間、室温でインキュベートします。
- インキュベーション後、プレート マグネットに IP 反応プレートを置き、ビーズを乱すことがなくマルチ チャンネル ピペットを使用して 2 分間インキュベート慎重に新しい 96 ウェル プレート対応する井戸に上清を移します。「結紮 + 1年 BC」プレート ラベルを付けます。
- 各ウェルに 10 x PCR 高音質バッファーの 5 μ L を追加し、上下ピペッティングでよく混ぜます。ヒント行間を変更します。カバー プレート プラスチック シール、クイック スピンは、室温で保管してください。
- ビーズ クリーンアップ #2 アダプター結紮後
- 次の変更と 4.6 で説明したようにビーズのクリーンアップを実行: 結紮 + 13 プレート (ステップ 4.6.7) アクティブも 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションの 60 μ L を追加し、EB バッファーの 35 μ L を使用してビーズから溶出します。「結紮術 + 2 BC」プレートをラベル氷の上保管してください。
- PCR の拡大
- -20 ° C のフリーザーから PCR の反作用 (表 9) に必要な酵素) を除くすべての試薬を取得、それらを室温で解凍し、すぐに氷の上にそれらを配置します。
- 氷を取り組んで、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに PCR マスター ミックスを設定するテーブル 9に従ってください。手順 4.1.4-4.1.5 で説明している一般的な brew セットアップ指示に従います。氷上では、因数新しい貯水池 96 ウェル プレートの 1 つの行に PCR マスター ミックスの適切なボリューム。氷の上におきます。手順 4.5.4 計算例を参照してください。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して氷の上作業それぞれのユニークな 12.5 μ m 逆インデックス結紮の各ウェルにプライマー (補足テーブル 2) + 2 BC プレート (ステップ 4.7.1) PCR 2 μ L を追加し、上下ゆっくりと混ぜます。ヒント行間を変更します。氷の上のプレートを保ちます。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して氷の上の作業は上下にピペッティングによるステップ 4.8.3 とミックスから 23 μ L のサンプルの行ごとに PCR マスター ミックスを 10 回追加します。PCR のカバー プレートをシール、1 分 200 x g でスピンダウンするたちで孵化させなさい (PCR サイクリング条件表 10を参照)。
- PCR 増幅後のビード - クリーンアップ
- PCR の拡大の後で 1 分、4 ° C の 200 x g プレートをスピンします。セクション 4.6 次の変更で説明するように、ビーズのクリーンアップを実行: 各 PCR の反作用に 20 %peg/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューションの 51 μ l 添加し EB バッファーの 25 μ L を使用してビーズから溶出します。アルミ製カバー プレートを封印し、スピン ・ ダウン 200 × g で 1 分ストアの-20 ° C のサンプル
- 構築されたライブラリを検証するため、蛍光ベースの試金を使用して DNA の定量化を実行、チップ ベース キャピラリー電気泳動分析 (高感度アッセイ) を使用して最終製品を視覚化し、濃縮を実行 (qPCR) (見なさいの量的な PCR代表結果、qPCR による ndChIP seq ライブラリ品質検証)。
Representative Results
クロマチン消化プロファイル
MNase 消化の最適化は、このプロトコルの成功に不可欠です。それは重要な単一ヌクレオソーム フラグメント サイズによって支配される消化プロファイルを生成する一方ない過剰消化、高い順序ヌクレオソーム フラグメントの回復を可能に。ごく小さい、単一のヌクレオソームを超えるフラグメントを表す単一ヌクレオソーム フラグメントの大半の理想的な消化プロファイルで構成されます。図 1は、理想的な過剰消化、消化の下のサイズ分布の例を示します。クロマチンのサブ最適な消化も IP 素材 (図 2) から生成されたシーケンス ライブラリのプロファイルに明白なことを注意してください。
QPCR による ndChIP seq ライブラリの品質の検証
qPCR、チップ18,19,20の品質の評価の確立された方法です。IP は 1 以下になります後核酸収量細胞 10,000 の ndChIP シーケンスを実行するとき ng。したがって、背景に対象地域の相対的な強化を評価するためのライブラリ構築後 qPCR を実行に不可欠です。背景の見積もりを提供するために MNase 消化クロマチン (入力) から構築されたライブラリが生成されます。各 IP ライブラリ (一般的に使用されるヒストンのためのプライマーの一覧についてカスタマーインフォメーション センターの障害表 3参照) 2 組のプライマーが必要です。1 つのプライマー セットは、興味 (肯定的なターゲット) のヒストン修飾と一貫して関連付けられているゲノム領域および利益 (負ターゲット) のヒストン修飾でマークされていない別の地域の特定する必要があります。チップ seq ライブラリの品質は、入力ライブラリに関して濃縮を折るように評価されます。倍濃縮は、ターゲットのゲノム領域の指数関数的増幅を前提としています次の方程式を使って計算できます: 2Ctの入力-CtIP。カスタム R 統計ソフトウェア パッケージ、qcQpcr_v1.2、低入力ネイティブ チップ seq ライブラリ (補足コード ファイル) の qPCR 濃縮分析に適しています。図 3は、成功と失敗のチップ seq ライブラリの qPCR の結果を表します。質の良い ndChIP seq ライブラリの最小予想倍濃縮値は H3K4me3 など広範なマーク、たとえば H3K27me3 の 7 の狭いマーク 16 です。
MNase アクセシビリティをモデリング
チップ seq の計算解析は複雑でユニークな実験設定ごとに。国際人間エピゲノム コンソーシアム (IHEC) や、百科事典の DNA 要素 (エンコード) の定めるガイドラインのセットは、チップ seq ライブラリ21の品質を評価するために使用できます。ライブラリの順序深度影響の検出と豊かな地域の20の解像度を与えることに注意してくださいすることが重要です。ピークの数は増加を検出し、読み取りの深さが増加すると、高原に近づきます。狭いマーク (例えばH3K4me3) 5000 万対読み取り (2500 万フラグメント) の IHEC の推奨事項に基づいてシーケンスする ndChIP seq ライブラリをお勧めし、1 億ペア-(5000 万フラグメント) の読み取り広範なマーク (例えば、H3K27me3) および22を入力します。これらの配列の深さは、広くを使用して最も重要なピークの検出のための十分な配列アラインメント彩度23,24に達することがなく MACS2、ホーマーなど、チップ seq ピークの呼び出し元を使用するを提供します。質の高い哺乳類 ndChIP seq ライブラリは PCR 重複率 < 10% および参照ゲノム配置率 > 90% (重複読み取りを含む)。成功した ndChIP seq ライブラリ濃縮 MACS222識別の一直線に並べられた読み取りピークのかなりの部分 (> 40%) と相関性の高い複製が含まれます、ゲノムのブラウザーに一直線に並べられた読み取りの検査する必要があります視覚的に明らかにします。入力ライブラリ (図 4) と比較して検出可能な濃縮。さらに、ndChIP seq をガウス混合分布アルゴリズムを用いたヌクレオソーム密度を評価するために使用できます (w1 * n(x;Μ1,σ1) + w2 * n(x; μ2, σ2) = 1) MACS2 で、MNase アクセス可能な境界によって定義されているにモデル ヌクレオソーム密度に豊かな領域を同定しました。このモデルで1 w モノラル ヌクレオソーム分布重量を表し w2 ・ ディ ・ ヌクレオソーム分布重量。W1 w2より大きいが、モノラル ヌクレオソームの断片とその逆の優位性があります。この分析では、フラグメントのサイズを定義することができますので、ライブラリはペアエンド ファッションでシーケンス処理することが必要です。ガウス混合分布アルゴリズムを適用するためには、統計的に有意な豊かな地域はまず識別されます。ピーク通話 MACS2 狭いマークと広範なマークの 0.01 の q 値カットオフ コントロールとして、既定の設定で入力を使用してお勧めします。広く使われている統計ソフトウェア パッケージからガウス混合分布アルゴリズムを用いた統計パッケージの数があります。MACS2 分布が豊かなプロモーターを識別し、R 統計パッケージを使用して各プロモーターにガウス混合分布アルゴリズムを適用できる IPed サンプルのペアエンド リード境界によって決定されるフラグメントの平均サイズを利用配分を計算する Mclust バージョン 3.025 。このアプリケーションでは、ウェイトのしきい値の見積もりが不安定になったりするので 30 未満の一直線に並べられた断片を含むプロモーターを排除することをお勧めします。良質 ndChIP seq ライブラリは、モノ-、ジ ヌクレオソーム フラグメントの長さに対応する平均値の 2 つの主要なコンポーネントで構成されるガウス混合分布を生成します。
図 1: ライブラリを生成する前に MNase 消化の評価します。最適な MNase のチップを使ったキャピラリー電気泳動分析プロファイル (A) を消化、下消化 (B)、および過剰 (C) クロマチンを消化します。生物の複製は、青、赤、および緑の痕跡として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: MNase 消化後ライブラリ生成の評価します。(A) 最適消化入力の図書館建設プロファイルを掲載 (生物的複製; 赤、緑、黒) と IP (生物的複製; シアン、紫、青) と (B) のサブ最適な入力 (生物的複製; 赤、緑、青) と IP (生物の複製;水色、紫、オレンジ) ライブラリ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: NdChIP seq ライブラリの品質を評価する定量的 PCR を使用ことができますライブラリ構築の記事。入力ライブラリに関して H3K4me3 IP ライブラリの倍濃縮は 2 として計算されます(入力 - の Ct Ct の IP) qcQpcr_v1.2 を使用して正と負のターゲットのため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 10,000 のプライマリ CD34 から構築された代表的な ndChIP seq ライブラリ+臍帯血細胞。H3K4me3 信号 (マップされたリードの百万ヒット) 3 生物の複製、1 と 2 の (B) (A) 複製間プロモーター (2 Kb + TSS) の計算のピアソン相関は、1 と 3、2 と 3 の (C) の複製をレプリケートします。架橋チップ seq の HOXA 遺伝子クラスターの (D) UCSC ブラウザー ビューは、IP、IP ごとの 10,000 のセルから成功 ndChIP seq、IP ごとの 10,000 のセルから失敗した ndChIP seq あたり 100 万の細胞から生成されます。(赤: H3K27me3、緑: H3K4me3 と黒: 入力)。MACS2 内マップの読み取りの (E) 部分は、H3K4me3 (黒) と H3K27me3 (グレー) の豊かな領域を同定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| バッファー組成 |
| A. 1. 免疫沈降バッファー (IP) |
| 20 mM トリス塩酸 pH 7.5 |
| 2 ミリメートルの EDTA |
| 150 mM の NaCl |
| 0.1% トリトン X-100 |
| 0.1% デオキシ コール酸 |
| 10 mM 酪 |
| A. 2. 低塩洗浄バッファー |
| 20 mM トリス塩酸 pH 8.0 |
| 2 ミリメートルの EDTA |
| 150 mM の NaCl |
| 1% トリトン X-100 |
| 0.1% SDS |
| A. 3. 高塩洗浄バッファー |
| 20 mM トリス塩酸 pH 8.0 |
| 2 ミリメートルの EDTA |
| 500 mM の NaCl |
| 1% トリトン X-100 |
| 0.1% SDS |
| A. 4. チップ溶出バッファー |
| 100 mM NaHCO3 |
| 1% SDS |
| A.5。 換散バッファー-1 mL x 1 |
| 0.1% トリトン |
| 0.1% デオキシ コール酸 |
| 10 mM 酪 |
| 6. Ab 希釈バッファー |
| 0.05% (w/v) アジ |
| 0.05% 広範囲抗菌薬 (例えばProClin 300) |
| PBS で |
| A.7 30% PEG/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューション (参考16)。 |
| 30% 止め釘 |
| 1 M の NaCl |
| 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 洗浄の超常磁性ビーズの 1 mL |
| A.8 20% PEG/1 M NaCl 磁気ビーズ ソリューション (参考16)。 |
| 30% 止め釘 |
| 1 M の NaCl |
| 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 洗浄の超常磁性ビーズの 1 mL |
表 1: ndChIP seq バッファー組成物。
| ヒストン修飾 | 濃度 (μ g/μ L) |
| H3K4me3 | 0.125 |
| H3K4me1 | 0.25 |
| H3K27me3 | 0.125 |
| H3K9me3 | 0.125 |
| H3K36me3 | 0.125 |
| H3K27ac | 0.125 |
表 2: 抗体量 ndChIP シーケンスに必要な
| Reganet | (Μ l) |
| 超純水 | 478 |
| 1 M トリス-HCl pH 7.5 | 10 |
| 0.5 M の EDTA | 10 |
| 5 M の NaCl | 2 |
| グリセロール | 500 |
| 総容積 | 1,000 |
表 3: MNase 希釈バッファーのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 超純水 | 13 |
| 20 mM DTT | 1 |
| MNase バッファー x 10 | 4 |
| 20 U/μ l Mnase | 2 |
| 総容積 | 20 |
表 4: MNase マスター ミックスのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 溶出バッファー | 30 |
| バッファー G2 | 8 |
| プロテアーゼ | 2 |
| 総容積 | 40 |
表 5: DNA 精製マスター ミックスのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 超純水 | 3.3 |
| 制限酵素バッファー (例えばNEBuffer) × 10 | 5 |
| 25 mM ATP | 2 |
| 10 mM dNTPs | 2 |
| T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (10 U/μ l) | 1 |
| T4 DNA ポリメラーゼ (3 U/μ l) | 1.5 |
| Dna ポリメラーゼは大 (Klenow) フラグメント (5 U/μ l) | 0.2 |
| 総容積 | 15 |
表 6: 最終修復マスター ミックスのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 超純水 | 8 |
| 制限酵素バッファー (例えばNEBuffer) × 10 | 5 |
| dATP を 10 mM | 1 |
| Klenow (3' 5' エキソ-) | 1 |
| 総容積 | 15 |
表 7: A テーリング マスター ミックスのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 超純水 | 4.3 |
| クイック結紮バッファー x 5 | 12 |
| T4 DNA リガーゼ (2000 U/μ l) | 6.7 |
| 総容積 | 23 |
表 8: アダプター結紮マスター ミックスのレシピ。
| 試薬 | (Μ l) |
| 超純水 | 7 |
| 25 uM PCR プライマー 1.0 | 2 |
| HF バッファー x 5 | 12 |
| DMSO | 1.5 |
| DNA ポリメラーゼ | 0.5 |
| 総容積 | 23 |
表 9: PCR マスター ミックスのレシピ。
| 温度 (° C) | 時間 (秒) | サイクル数 |
| 98 | 60 | 1 |
| 98 | 30 | |
| 65 | 15 | 10 |
| 72 | 15 | |
| 72 | 300 | 1 |
| 4 | ホールド | ホールド |
表 10: PCR は、メソッドを実行します。
| オリゴ | シーケンス | 変更 |
| PE_adapter 1 | 5'-GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG-3 5Phos/' | 5' 変更: リン酸化 |
| PE_adapter 2 | 5' - ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC * T - 3' | 3' 変更: * T はホスホロチオエート結合 |
PE アダプターの生成の補足表 1: オリゴのシーケンス。
| プライマー名 | シーケンス | インデックス | (シーケンスに使用する) に IndexRevC | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGTGAT | atcacg | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGATC | gatcag | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGGGTT | aacccc | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGGGT | acccag | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCGCT | agcgct | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTTTTG | caaaag | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGTTGG | ccaaca | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCTAG | ctagct | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCATC | gatgct | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGATTA | taatcg | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CATTCA | tgaatg | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGAACT | agttcc | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ACATCG | cgatgt | |||||||
| PCR 逆インデックス入門 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AAGCTA | tagctt | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CAAGTT | aacttg | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCCGGT | accggc | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGGCCT | aggccg | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TAGTTG | caacta | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCGTGG | ccacgc | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GTATAG | ctatac | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CCTTGC | gcaagg | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCTGTA | tacagc | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ATGGCA | tgccat | |||||||
| PCR 逆インデックス プライマー 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGACAT | atgtca | |||||||
補足テーブル 2: 逆回転 PCR のプライマー シーケンス。
| プライマー | シーケンス | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_F | 5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3' | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_R | 5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3' | |
| HOXA9 10_F | 5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3' | |
| HOXA9 10_R | 5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_F | 5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_R | 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' | |
| GAPDH F | 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' | |
| GAPDH R | 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3' | |
| ヒストン修飾 | 肯定的なターゲット | 否定的なターゲット |
| H3K4me3 | GAPDH | HOXA9 10 |
| H3K4me1 | GAPDH_genic | ZNF333 |
| H3K27me3 | HOXA9 10 | ZNF333 |
| H3K27ac | GAPDH | ZNF333 |
| H3K9me3 | ZNF333 | HOXA9 10 |
| H3K36me3 | GAPDH_genic | ZNF333 |
第 3 表補足: 一般的に使用されるヒストン (H3K4me3、H3K4me1、H3K27me3、H3K27ac、H3K9me3、および H3K36me3) のためのプライマーの一覧。
補足ファイル 1: ndChIP seq ワークシート。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足コード ファイル: qcQpcr_v1.2.R 統計ソフトウェア パッケージ、低のネイティブ チップ seq ライブラリ入力の qPCR 濃縮分析のため。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
クロマチンの修飾とヌクレオソームの転写調節における配置の組合せの性質を考えると、これらの機能の同時測定を可能にするメソッドは、エピジェネティック制御に新たな洞察を提供する可能性が高いです。ここで示される ndChIP seq プロトコルは、ヒストン修飾とまれな一次電池9,10ヌクレオソーム密度の同時尋問をできるように最適化ネイティブ チップ seq プロトコルです。ndChIP seq クロマチンの酵素の消化力を利用して、ペアエンド大量並列シーケンスとガウス混合分布モデルに結合された場合、単一ヌクレオソーム レベル調査のヒストンの修正をできるようにと、集団内の不均一性によるエピゲノム プロファイルのデコンボリューション。このプロトコルを使用して、境界、ChromHMM10,24によって定義されている特定のクロマチン状態に関連付けられているを読むペアエンドによって決まります、免疫沈澱フラグメント サイズの独自のディストリビューションを以前報告しています。
NdChIP seq ライブラリの品質は、抗体の特異性と感度、最適な MNase 消化条件の chromatin の品質など複数の要因に依存します。使用される抗体の特異性は、成功 ndChIP seq ライブラリの生産に重要です。理想的な抗体は、他のエピトープを持つ小さな交差反応と関心のエピトープに対して高い親和性を示しています。好みの抗体の高い親和性と磁気ビーズを選択することも重要です。
MNase 消化はこのプロトコルで重要かつ時間と濃度感受性反応です。したがって、複数のサンプルを処理するときは、各反応が時間の同量の培養です重要です (手順 2.2 参照)。Chromatin の品質は、低信号対雑音比の最適 MNase 消化プロファイルとライブラリの結果 ndChIP シーケンス断片化クロマチン リードの結果が大きく影響する別の要因です。低次のサンプルは、細胞の生存率やホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織はこのプロトコルの推奨されませんようクロマチンの低下します。
クロマチン抽出の間に写真の付加を低減 (すなわち、ランダム) クロマチンの断片化と保持の整合性ヒストンの尾を望ましくないです。そのため、PIC を使用する換散バッファーおよび免疫沈降バッファーの直前に追加する必要があります。実行可能なセルを選択し、フローサイトメトリー、を介して選択するセル間細胞は細胞数の推定値の精度と細胞の生存率を向上する低流量で並べ替えられます。換散バッファーに直接セルを並べ替えを避けます。シース バッファーは換散バッファーを希釈して MNase に細胞膜の有効透過を防ぐことができます。細胞または有機体の種類に応じて MNase の滴定は最適な消化を取得する必要があります。
哺乳動物細胞 ndChIP seq 広いマークおよび入力のため狭いマークおよび 1 億対読み取り (5000 万フラグメント) のため 5000 万対読み取り (2500 万フラグメント) の最小のシーケンスの深さが必要です。ガウス混合分布アルゴリズムは、この勧告の大幅下深度化されているライブラリには最適な実行されません。ndChIP seq ないモノラルまたはディ ヌクレオソームの支配のプロモーターにモノラルとディ ヌクレオソーム フラグメントの長さの配分値の間少し分離とプロモーターにより分類されます。したがって、これらのプロモーターは、その後の分析で削除する必要があります。予測分布の信頼性を向上し、MNase 消化と図書館建設の技術的な変動を識別する生物の複製を生成できます。
ネイティブ チップ seq プロトコルの以前のイテレーションとは異なり ndChIP seq はヌクレオソーム密度を統合するフラグメント サイズのポスト免疫沈降法を用いたクロマチン構造とヒストンの修正の組合せの効果を調査するための手段を提供します。MNase アクセシビリティ、ヒストン変更の測定によって決定されます。NdChIP seq の初代培養細胞や組織への応用はエピジェネティック制御の統合的な性質に新しい洞察力を提供し、集団内での不均一性によるエピジェネティックな署名の識別を許可します。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
アダムローリーは健康の研究のカナダの協会からカナダ大学院奨学金によって支えられました。この作品はゲノム ブリティッシュ コロンビア州、カナダ研究所の健康研究 (機構 120589) カナダのエピジェネティクス、環境および健康研究コンソーシアム イニシアチブの一部としてからの助成金やテリー Fox 研究所プログラム サポートされています。プロジェクト助成金 #TFF-122869 取扱い、取扱いにテリー Fox 研究所新しい調査官賞 (グラント # 1039)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Tris-HCl –pH 7.5 | Thermo Scientific | 15567-027 | |
| 1M Tris-HCl –pH 8 | Thermo Scientific | 15568-025 | |
| 0.5M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 5M NaCl | Sigma | 1001385276 | |
| Triton X-100 | Sigma | 1001412354 | |
| Sodium-Deoxycholate | Sigma | 1001437582 | |
| SDS | Thermo Scientific | 15525-017 | |
| Sodium-Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| 100% EtOH | NA | NA | |
| V-bottom 96 well plate (AB 1400) | Thermo Scientific | AB-1400-L | |
| Gilson P2 pipetman | Mandel | F144801 | |
| Gilson P10 pipetman | Mandel | F144802 | |
| Gilson P20 pipetman | Mandel | F123600 | |
| Gilson P100 pipetman | Mandel | F123615 | |
| Gilson P200 pipetman | Mandel | F123601 | |
| Gilson P1000 pipetman | Mandel | F123603 | |
| Micrococcal Nuclease | NEB | M0247S | |
| Thermo Mixer C (Heating block mixer) | Eppendorf | 5382000023 | |
| Multi 12-channel Pippet P20 | Rainin | 17013803 | |
| Multi 12-channel Pippet P200 | Rainin | 17013805 | |
| 1.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431021 | |
| 0.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431005 | |
| Plastic Plate Cover | Edge Bio | 48461 | |
| PCR cover | Bio Rad | MSD-1001 | |
| Aluminum Plate Cover | Bio Rad | MSF-1001 | |
| Elution buffer (EB buffer) | Qiagen | 19086 | |
| 1M DTT | Sigma | 646563 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 22625004 | |
| Ultrapure water | Thermo Scientific | 10977-015 | |
| Protein G dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protein A dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protease inhibitor Cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Rotating platform | Mandel | 1b109-12052010 | |
| Plate magnet | Alpaqua | 2523 | |
| Domed 12-cap strip | Bio Rad | TCS1201 | |
| Buffer G2 | Qiagen | 1014636 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | Thermo Scientific | 12321D | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | LabCore | 730-006 | |
| V shape Plastic reservoir | Mandel | S0100A | |
| Vortex | Mandel | C1801 | |
| Mini Fuge | Mettler Toledo | XS2035 | |
| Analytical scale | Mandel | LB109-12052010 | |
| Quick Ligation Reaction Buffer, 5X | NEB | B6058S | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | M0210S | |
| Klenow Fragment (3'-5' exo) | NEB | M0212S | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Deoxynucleotide Solution mix, 10mM | NEB | N0447S | |
| dATP Solution 10mM | NEB | N0440S | |
| Quick T4 DNA Ligase | NEB | M0202T | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM | NEB | P0756S | |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F549L | |
| NEBuffer 2 | NEB | B7002S | |
| Hank's buffered salt solution | Thermo Scientific | 14025076 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | A3160702 | |
| phosphate buffer saline | Thermo Scientific | 10010023 | |
| H3K4me3 | Cell Signaling | 9751S | |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410037 | |
| H3K27me3 | Diagenode | pAb-069-050 | |
| H3K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| H3K9me3 | Diagenode | C15410056 | |
| SeraMag super-paramagnetic beads |
References
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