Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas

Resumo

Descreveremos um protocolo para visualização de exocitose de insulina em ilhotas intactas usando pHluorin, uma proteína verde fluorescente de sensíveis ao pH. Ilhotas isoladas estão infectadas com vírus adenoide codificação pHluorin juntamente com a carga de vesículas neuropeptide Y. Isto permite a detecção de eventos de fusão de grânulo de insulina por microscopia confocal.

Resumo

A secreção de insulina desempenha um papel central na homeostase de glicose sob condições fisiológicas normais, bem como na doença. Abordagens atuais para estudar a exocitose de grânulos de insulina que ou usar eletrofisiologia ou microscopia acoplado à expressão de repórteres fluorescentes. No entanto, a maioria destas técnicas foram otimizada para linha celular clonal ou exige dissociando ilhotas pancreáticas. Em contraste, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real de exocitose de grânulos de insulina em ilhotas pancreáticas intactas. Neste protocolo, descrevemos primeiro a infecção viral de ilhotas pancreáticas isoladas com adenovírus que codifica uma pH sensíveis à proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada ao neuropeptídeo Y (NPY). Em segundo lugar, descrevemos o confocal imagens de Ilhéus cinco dias após a infecção viral e como monitorar a secreção de insulina do grânulo. Brevemente, os ilhéus infectados são colocados em uma lamela em uma câmara de imagens e fotografados sob um microscópio confocal laser de varredura vertical enquanto continuamente sendo perfundidos com solução extracelular que contém vários estímulos. Imagens confocal abrangendo 50 µm de ilhota são adquiridas como gravações de lapso de tempo usando um scanner rápido-ressonante. A fusão dos grânulos de insulina com a membrana plasmática pode ser seguida ao longo do tempo. Este procedimento também permite testar uma bateria de estímulos em uma única experiência, é compatível com mouse e ilhotas humanas e pode ser combinado com vários corantes para a imagem latente funcional (e.g., corantes de cálcio citosólico ou potencial de membrana).

Introdução

Insulina é produzida pelas células beta das ilhotas pancreáticas e é um regulador chave da glicose metabolismo¹. Morte ou disfunção das células beta perturba a homeostase de glicose e leva a diabetes². Insulina é embalada em grânulos densos núcleos que são liberados em uma Ca^{2 +}-dependente forma³. Elucidar como exocitose de grânulos de insulina é regulada é essencial para compreender plenamente o que determina a secreção de insulina e abre novos caminhos para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes.

Exocitose de insulina tem ....

Protocolo

Comitê de ética animal da Universidade de Miami tem aprovado todos os experimentos.

1. viral infecção de intactos isolados humana ou ilhotas pancreáticas Mouse

1. cultura ilhéu: preparar os meios de cultura de ilhota: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutamina.
   1. Humanos ilhotas pancreáticas são obtidas a partir do programa de distribuição integrada ilhéu (NIDDK, NIH). À chegada, transfer Ilhéus (~ 500 equivalentes ilhéu) de 35mm não-cultura de tecidos tratados pratos de Petri com meios de cultura CMRL mL 2 a 37 ° C, 5% / 95% CO ₂ /O ₂ para 24 h antes da infecç....

Resultados

O fluxo de trabalho inteiro da técnica é mostrado na Figura 1. Brevemente, o mouse ou ilhotas humanas podem ser infectadas com o vírus adenoide codificação NPY-pHluorin e fotografadas, após alguns dias na cultura, sob um microscópio confocal. Como grânulos se fundem com a membrana plasmática e aberto, um aumento na fluorescência é observado e pode ser quantificado (Figura 1). Para determinar se o NPY-pHluorin é realmente uma ferr.......

Discussão

Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para visualizar a exocitose de grânulos de insulina em células beta dentro de ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Ele usa NPY-pHluorin como o repórter fluorescente clonado em adenovírus para garantir uma eficiência elevada do transfection.

Embora o método fosse altamente eficiente em nossas mãos, ele pode requerer algumas modificações que dependem principalmente de dois parâmetros: 1) a qualidade da preparação do Ilhéu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio confocal vertical de varredura a laser	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha	TCS-SP5	inclui LAS AF, o software de aquisição de imagem
Câmara de imagem	Warner instruments	RC-26
Plataforma de câmara de imagem	Warner instruments	PH-1
22 x 40 lamínulas de vidro	Daiggerbrand	G15972H
Vacuum graxa de silicone	Sigma	Z273554-1EA
Sistema de perfusão multicanal	Warner instruments	VC-8
Aquecedor de solução única	em linha Warner instruments	SH-27B
Controlador de temperatura	Warner instruments	TC-324C
Bomba de sucção peristáltica	Pharmacia	P-1
placa de Petri de 35 mm, VWR		10861-586
CMRL tratado sem cultura de tecidos Médio, sem glutamina	ThermoFisher	11530037
FBS, inativado por calor	ThermoFisher	16140071
L-Glutamina 200	mM ThermoFisher	25030081
solução de NaCl 5 M	Sigma	S5150
3 M Solução KCl	Sigma	60135
1 M CaCl2 solução	Sigma	21115
1 M MgCl2 solução	Sigma	M1028
Albumina de soro bovino	Sigma	A2153
1 M Solução HEPES	Sigma	H0887
Filtro de vácuo	VWR	431098
D-Glucose	Sigma	G8270
bromidrato de poli-D-lisina	Sigma-aldrich	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I5879
Forskolin	Sigma	F3917