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Artigo de método

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

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DOI:

10.3791/56092

⸱

10 de janeiro de 2018

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

Neste artigo

Resumo

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Resumo

O AWESAM (um low-custo easy stellate umstrocyte method) protocolo implica uma maneira rápida, simples e barata para gerar grandes quantidades de in vivo-como monoculturas de rato e rato astrocyte : As células do cérebro podem ser isoladas de regiões diferentes do cérebro, e após uma semana de cultura de células, as células não-hamartomas são sacudidas, colocando os pratos de cultura num agitador para 6 h na incubadora. Os astrócitos restantes são então passados para novas placas com meio astrocyte específicos (denominado NB + H). NB + H contém baixas concentrações de heparina-ligação EGF fator de crescimento semelhante (HBEGF), que é usado no lugar de soro no meio. Após ter crescido em NB + H, astrócitos AWESAM têm uma morfologia estrelada e processos bem característica. Além disso, estes astrócitos têm mais na vivo-como expressão do gene que astrócitos gerados pelos métodos anteriormente publicados. Imagem latente de CA2 + , dinâmica de vesículas e outros eventos perto da membrana, portanto, podem ser estudados no bem processos hamartomas em vitro, por exemplo, usando a célula viva confocal ou microscopia TIRF. Notavelmente, astrócitos AWESAM também apresentam espontânea Ca2 + sinalização semelhante de astrócitos na vivo.

Introdução

Astrócitos influenciam a função cerebral através de suporte trófica, fluxo sanguíneo, sinalização sináptica e plasticidade e comunicação intercelular - todos os quais são mecanismos que giram em torno dos processos hamartomas finos. O protocolo AWESAM descrito aqui permite que o estudo desses processos sem interferência de neurônios e outro glia, que é útil , por exemplo, porque a expressão de muitas proteínas e até mesmo de Ca2 + sinalização se sobrepõem em toda célula cerebral diferente tipos. Além disso, este método supera as limitações das técnicas anteriormente disponíveis. Em particular, o nosso protocolo fornece na vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos) e expressão gênica em um rápido, fácil e barata maneira.

Morfologia celular, expressão gênica e muitos outros processos regulatórios são diretamente influenciados pelo ambiente. Em um prato de cultura, refere-se a fatores liberados por células circundantes, mas também o meio no qual as células são cultivadas. Para astrócitos, HBEGF foi relatado anteriormente para induzir uma morfologia estrelado1 mas verificou-se, também, para diferenciar de astrócitos2. No entanto, concentrações de HBEGF foram usadas mais tarde para a geração mais na vivo-astrócitos como identificados por meio de sequenciamento de RNA em dois diferentes protocolos de3,4. Além disso, a morfologia astrocyte altera com a composição média, independentemente do protocolo4: Neurobasal médio com uma baixa concentração de HBEGF é ideal para o cultivo de astrócitos estrelados, enquanto outras composições médios (por exemplo, contendo soro DMEM) produzir células poligonais (mesmo em astrócitos recentemente isolados por immunopanning).

O protocolo AWESAM supera as desvantagens das técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte4. Técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte têm as seguintes desvantagens: morfologia poligonal, que é característico de astrócitos estrelado na vivo (método de MD)5; o comprimento e o custo do protocolo (astrócitos tomadas de células-tronco pluripotentes induzidas a preparar três meses e requer muitos reagentes, incluindo fatores de crescimento caros)6; as pequenas quantidades de material (método immunopanning)3; e a diferenciação dos astrócitos e exigência de uma matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. em contraste, o protocolo AWESAM fornece: no vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos); um rápido, fácil e barato método; grandes quantidades de material; e a maioria na vivo-como expressão de gene em comparação com immunopanned e astrócitos MD. Além disso, permite a cultura 2D para o estudo da sinalização de Ca2 + e vesículas de reciclagem em finos processos e em eventos perto da membrana (por exemplo, microscopia TIRF não é possível em culturas 3D).

O método de MD tem sido usado extensivamente desde sua publicação em 19805, oferecendo uma técnica simples e rápida para monoculturas astrocyte poligonal. Em breve, o método de MD implica crescente neurónios misto no soro fetal bezerro (FCS)-contendo DMEM, seguido por etapas que enriquecem para astrócitos (como todas as outras células cerebrais tipos desanexar do prato) e mais cultura no mesmo meio a tremer. DMEM suplementado com FCS é usado para muitos outros tipos de células, variando de fibroblastos e adipócitos para linhas de células de câncer diferentes, os quais compartilham a morfologia poligonal exibida por astrócitos MD na cultura. Até o início dos anos 20007, pouco tinha sido dada a mídia sob medida para astrócitos, especificamente favorecer sua morfologia típica estrelada encontrado em vivo. Um protocolo publicado em 2011 alcançar tal morfologia estrelada: chamado o método immunopanning, emprega meio livre de soro otimizado para cultivo de astrócitos3. Usando este método, as células do cérebro recentemente isolada estão expostas a uma série de pratos revestidos com anticorpos que se destinam a proteínas de células específicas do tipo de célula superfície, enriquecer para astrócitos. Apesar do mais na vivo-como perfil morfologia e expressão de astrócitos immunopanned, a maioria dos estudos em vitro ainda depende do método de astrocyte MD. O método de MD é simples e rápido, enquanto o método de immunopanning é composto por etapas mais complexas e demoradas no primeiro dia da cultura (tais como longos períodos de digestão enzimática, estratificação cuidadosa das soluções de diferente densidade, immunopanning em si, e vários centrifugação passos - tudo isso antes de chapeamento). No entanto, usando o meio mais especializado, o método AWESAM oferece tanto a velocidade do método MD e o na vivo-como a morfologia do protocolo immunopanning.

Em geral, o protocolo AWESAM é útil para estudar mais na vivo-gosto de astrócitos em 2D monoculturas isolados dos neurônios e outro glia (como anteriormente caracterizadas4 por immunostainings immunoblots e sequenciamento de RNA). Ele permite o estudo de processos hamartomas finos e fornece grande acessibilidade para a visualização de Ca2 + sinalização espontânea e eventos perto da membrana (por exemplo, fotografada por microscopia TIRF).

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Protocolo

Todas as experiências com animais aqui descritas foram realizadas em conformidade com as orientações para o bem-estar animal alemão.

Nota: A linha do tempo e as etapas principais do protocolo são ilustradas na Figura 1.

1. preparações

  1. Prepare as seguintes soluções.
    1. Preparar DMEM + para cultivo poligonais astrócitos MD: DMEM com 10% FCS, 100 de U de penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL.
    2. Prepare-se para cultivo astrócitos estrelados NB + H: neurobasal médio com 5 ng/mL HBEGF, 1 x suplemento B-27, 1 suplemento de glutamina x, penicilina de U 100 e 100 estreptomicina µ g/mL.
      Nota: Alíquotas de altas concentrações de HBEGF podem ser preparadas e armazenadas a-20 ° C a ser adicionado ao meio, sempre que necessário.
    3. Prepare o suporte de dissecação (10 mM HEPES em HBSS).
    4. Prepare alíquotas de 6-7 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e 6-7 mL 0,25% do trypsin-EDTA em tubos de 15 mL. Estas podem ser armazenadas a-20 ° C e descongeladas em banho maria a 37 ° C.
  2. O dia antes de começar o protocolo, casaco pratos de cultura de tecidos tratados de 10 cm com 5 mL de 0,04% o polyethylenimine (PEI) cada.
  3. No dia seguinte, retire o PEI e lavar a louça com água deionizada, destilada duas vezes. Adicionar 12 mL de DMEM + para cada placa e pre-equilibrar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 pelo menos 30 min antes de chapear pilhas.
  4. Preparar a área de dissecação: em uma capa de dissecação de fluxo laminar, coloque dois pratos de Petri de 10 cm preenchido com meio de dissecação no gelo. Para cada área do cérebro a ser isolado (por exemplo, córtex, hipocampo), prepare um 15-tubo preenchido com 14 mL de meio de dissecação e manter no gelo. Pulverizador ferramentas de dissecação (tesouras bem, Dumont #3 e #5 pinças) com 70% de etanol e coloque ao lado do microscópio de dissecação do capuz.

2. o rato ou dissecação do cérebro de rato

Nota: Ambos os ratos e ratazanas podem ser usadas. Mais velho do P8 também podem ser utilizados animais (nós testamos até P12), mas remover as meninges se tornará cada vez mais difícil. Além disso, o rendimento da célula e a saúde vão diminuir, desde que as células do cérebro de animais mais velhos serão formaram processos intrincados e conexões que podem quebrar durante a dissociação do tecido, levando à morte celular aumentada. Preparações corticais são descritas aqui, mas outras regiões do cérebro também podem ser usados.

  1. Coloque 0,05% do trypsin-EDTA em banho maria a 37 ° C.
  2. Eutanásia em animais (ratos grávidos para E19 filhotes ou animais P0-P8) levantando lentamente a concentração de CO2 e isolar o cérebro. As etapas a seguir requerem técnica estéril.
  3. Se trabalhar com tecido embrionário, primeiro remova os embriões no útero e abra os sacos embrionários, então imediatamente cortou a cabeça com uma tesoura. Quando todas as cabeças são cortadas, transferi-los em meio de dissecação pre-cooled.
    1. Uma vez que as cabeças estão submersos no meio, abra a pele e o crânio (os dois são muito moles em animais jovens) com fórceps e pitada do cerebelo. Alavanca com cuidado o resto do cérebro acima e do crânio.
      Nota: Dois a quatro E19 embriões produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.
  4. Para filhotes recém-nascidos ou mais velhos, cortou a cabeça com uma tesoura e isolar o cérebro medialmente cortando a pele em uma linha reta na parte de trás da cabeça até a ponta do nariz. Puxe a pele de lado e cuidadosamente corte o crânio esquerdo e direito, em seguida, elevador osso do crânio. Cortar o cerebelo e alavanca o resto do cérebro acima e do crânio.
    Nota: Dois ou três filhotes de P0-P8 produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.
  5. Separe o córtex da estrutura subjacente do mesencéfalo. Coloque a pinça dentro da fissura longitudinal entre os hemisférios, mova a pinça entre o córtex e mesencéfalo estruturas de um hemisfério (perpendicular à fissura longitudinal) para beliscar cada hemisfério livre.
  6. Usando a pinça, remover todas as meninges de cada hemisfério (e seu hipocampo), em seguida, separar o hipocampo. Se hippocampal astrócitos são necessários, mova cada hipocampo para um tubo de 15 mL cheio com 14 mL de meio de dissecação no gelo.
  7. Remova mais áreas do córtex de cada hemisfério se regiões específicas são necessárias (por exemplo, o córtex frontal). Corte qualquer tecido cortical a ser usado para a geração de astrócitos em pedaços não maiores que 1 mm3. Recolha todos os pedaços de tecido cortical em um tubo de 15 mL separado cheio com meio de dissecação no gelo.

3. dissociação e digestão do tecido

  1. Uma vez que todas as peças de tecido são coletadas, esperar por eles para resolver a parte inferior do tubo e, em seguida, Aspire tanto médio quanto possível.
  2. Adicionar 2-3 mL de 0,05% do trypsin-EDTA usando uma pipeta sorológica e incubar os tubos num banho de água de 37 ° C por 20 min.
    Nota: Versão do trypsin-EDTA todos da pipeta rapidamente para misturar as peças de tecido e deixar repousar novamente.
  3. Aspire cuidadosamente com o tripsina-EDTA, deixando pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível, na parte inferior do tubo.
  4. Adicione 5 mL de meio de dissecação pre-cooled para lavar fora o restante do trypsin-EDTA. Pipetar para o lado da parte superior do tubo para alcançar misturando as peças de tecido.
  5. Aspire o meio de dissecação e deixar os pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível. Repita essa etapa de lavagem com meio pre-cooled dissecação mais duas vezes.
  6. Após a etapa de lavagem final, adicione 1 mL de DMEM + (aquecido à temperatura) usando uma ponta da pipeta 1.000 µ l e triture o tecido pipetando cima e para baixo sem a introdução de bolhas.
    Nota: É importante evitar a produção de bolhas, como isso pode mudar o pH da solução, para que os astrócitos são bastante sensíveis.
  7. Coloque um filtro de célula de 100 µm na abertura de um tubo de 50 mL e pre-molhado o filtro com 4,5 mL de DMEM pre-cooled +.
  8. Pipetar 1 mL da suspensão de tecido dissociado no filtro da célula e adicionar outro 4,5 mL pre-refrigeração DMEM + lavar as células através do filtro de célula.

4. célula chapeamento para enriquecimento do Astrocyte por passagem

  1. Conte as células, por exemplo, por diluir 10 µ l da suspensão celular com 10 µ l trypan azul e pipetagem a mistura para um hemocytometer.
  2. Placa de 500.000 células em 12 mL DMEM + por prato de 10 cm.
    Nota: DMEM + é útil para o crescimento de hamartomas, mais ainda do que para os neurônios ou microglia. Durante a agitação, as forças físicas atuando sobre as lamelas de vidro dentro de poços são muito mais fortes do que aqueles atuando sobre os pratos de 10 cm (sem lamelas). Se as células são sacudidas em placas de 24-bem, eles se tornam insalubres ou morrem. Só placa astrócitos em placas de 24 poços após agitação.
  3. Manter as culturas celulares na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por sete dias.
  4. No dia 6, no dia anterior a tremer e a passagem de células, prepare as placas de cultura de PEI-revestido, conforme descrito na etapa 5.

5. as células de passagem

  1. No dia anterior passagem, revestimento placas de cultura celular com PEI de 0,04%.
    1. Por imunocitoquímica, transdução viral ou transfeccao Plasmideo, use placas de 24 poços ou 6-poços (cada um contendo um esterilizado 12 mm ou 25 mm lamela de vidro, respectivamente).
    2. Esterilizar as lamelas de vidro de incubação em etanol a 70% pelo menos 1 h e, em seguida, lave três vezes em água destilada, deionizada antes de colocar as lamelas em poços.
    3. Adicione pelo menos 70 µ l PEI 0,04% por 12mm lamela em placas de 24 poços e 600 µ l 0,04% PEI por lamela de 25 mm em placas 6-boas.
    4. Por Western blot ou análise de RNA-Seq, os pratos de 10 cm, já que contém as células após a dissecação podem continuar a ser utilizados. Pratos só precisam ser sacudido, em seguida, as células são lavadas com PBS 1x e tratadas com NB + H (não transferir para novos pratos).
  2. No dia em vitro (DIV) 7 após a dissecação, coloque os pratos de 10 cm com células em DMEM + num agitador de laboratório na incubadora e agitar os pratos a 110 rpm para 6 h.
  3. Lave o PEI de lamelas revestidos com água deionizada, destilada duas vezes. Adicione meio NB + H para as placas (500 µ l por alvéolo para placas de 24 poços e 2 mL por bem para placas boas 6). Pre-equilibrar as placas na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 enquanto tremem os pratos de 10 cm, ou pelo menos 30 min.
  4. 20-30 min antes do final do abanar de 6h, pré-aquecer 1 x PBS, DMEM +, NB + H e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria.
  5. Após 6 h de tremer, tirar os pratos da cultura o agitador e substitua imediatamente o meio (que contém abalada-fora os neurônios, oligodendrócitos e micróglia) com 10ml pré aquecido 1X PBS por prato.
    Nota: É importante aspirar imediatamente o velho meio contendo células isoladas para evitar as células não-hamartomas anexar novamente.
  6. Remover a PBS e adicionar 3 mL previamente aquecido do trypsin-EDTA por prato. Incube cada prato por 4 min na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: Se preparar amostras para Western blot ou RNA-Seq, não adicione do trypsin-EDTA. Em vez disso, substituir a PBS com 12ml pré aquecido NB + H, após o qual culturas podem ser colocadas de volta na incubadora.
  7. Adicione 5 mL DMEM + previamente aquecido para o 3 mL do trypsin-EDTA em cada prato, pipetar as células fora do prato usando uma pipeta sorológica 5ml e coletar a suspensão de células em um tubo de 50 mL.
    Nota: Pipetar diretamente do fundo do prato - o piso do prato deve tornar-se mais claro, como separar as células. Só uso soro contendo médio (no lugar de DMEM +), como soro inactivates tripsina.
  8. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 3.220 x g a 20 ° C por 4 min.
  9. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL pré aquecido NB + H.

6. célula chapeamento para culturas de Astrocyte Final

  1. Conte as células.
  2. Placa de 20.000 células por poço em placas de 6 boas (em 2 mL de meio de NB + H por alvéolo) ou 5.000 células por poço em placas de 24 poços (em 500 médio NB + H µ l por alvéolo).
  3. Manter as culturas de células na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 até tratamento adicional ou análise.
  4. Troca de meio a meio de uma vez por semana.
    Nota: Em ambientes de baixa-nutriente, astrócitos parem se proliferando, mas qualquer microglia restante irão proliferar (embora em nossa experiência, não microglia apareceu em culturas AWESAM). Troca de meio a meio de uma vez por semana evita enriquecimento de qualquer potencialmente restantes microglia8, e as monoculturas permanecem saudáveis pelo menos três semanas.

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Resultados

Astrócitos que são cultivados co com neurônios e cultivados em meios NB + aparecem estrelados após 2 semanas da cultura (Figura 2). Além de NB + médio, os astrócitos co cultos também estão expostos a fatores desconhecidos neurônio-derivado que provavelmente contribuem para a sua sobrevivência e morfologia. Em contraste, astrócitos MD crescidos em DMEM + como monoculturas (após agitação fora outros tipos de células antes de passagem) aparecem poligonais após 2...

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Discussão

Quatro etapas dentro do protocolo são fundamentais: 1) preparando a concentração HBEGF precisamente 5 ng/ml, uma vez que pequenos aumentos na concentração podem levar a culturas imaturas, por exemplo, 10 ng/mL HBEGF diferenciará de astrócitos4; 2) evita bolhas nas soluções que contêm tecidos ou células, que podem alterar o pH e impedir a saúde astrocyte; 3) pre-desenroscada mídia para atingir o pH ideal e a temperatura para o crescimento saudáveis astrócitos; 4) troca de apenas metade da ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos que o financiamento do Conselho Europeu de investigação (7. º PQ/260916), a Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% de tripsina-EDTAGibco25300054quente em 37 &�rdm; C banho-maria antes do uso
0,25% tripsina-EDTAGibco25200-056quente em 37 º C em banho-maria antes
do uso Suplemento B-27Gibco17504-04450X estoque
GlutamaxGibco35050-061100X estoque
Penicilina / estreptomicinaGibco15070-06350 estoque; penicilina: 5000 U/ml; estreptomicina: 5000 µ g/ml
Meio neurobasalGibco21103049sem L-glutamina
DMEMGibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 μ m filtro de células de nylonBD352360
Trypan BlueSigmaT8154 
Incubadora de cultura de célulasThermo Fisher ScientificHera Cell 240i incubadora
Agitador de laboratórioHeidolphRotamax 120 uso dentro da incubadora de cultura de células
CentrífugaEppendorf5810 R 
de cultura de células

Referências

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