Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.
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Artigo de método
Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.
Introdução
O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradi....
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Protocolo
1. preparação
-
Fazer fichas e Microarrays do anticorpo de impressão
- Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip.
Nota: Vários produtos químicos superficiais foram testados para sua adequação com gotículas endereçáveis. 5 superfície químicas podem precisar de ser otimizado para agentes de captura alternativos. Isoladores ADM estão disponíveis comercialmente, ou podem ser produzidas por acrílico de corte do laser (CAD para isolador usado neste trabalho é fornecido como um download de arquivo; consulte o ....
- Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip.
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Resultados
O número de cópia absoluta proteína basal de p53 foi determinado com resolução única célula em uma linhagem de células de câncer de cólon humano, células BE. Demonstramos como expressão de p53 pode variar ao longo de várias ordens de grandeza e mostrar uma correlação positiva fraca entre número de cópia tamanho e proteína celular dentro da população de célula BE descanso.
Endereçável Droplet Microarrays formam-se quando gotícula.......
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Discussão
Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.
Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o anticorpo local e interface óle.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
ASR projetado experimentos, desenvolveu protocolos e analisados dados. SC e PS realizaram experimentos de tamanho de célula. ASR e OC escreveram o manuscrito. Os autores desejam reconhecer com gratidão o apoio do Prof David R. Klug para fornecer acesso a equipamentos. Os autores desejam agradecer a faculdade Imperial de Hackspace avançada para acesso às instalações de prototipagem e fabricação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cultura de células | |||
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM de alta glicose | Sigma | D6429 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| Corning | SIAL0639 | ||
| Tripsina/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, Reino Unido | OmniGrid Micro | |
| Micro pino | ArrayIt, Lamínulas USA | 946MP2 | |
| (Nexterion) | Schott, Europa | 1098523 | Tamanho (mm): 65.0 x 25.0; Espessura (mm) 0.17 |
| anticorpo de captura p53 | Enzo | ADI-960-070 | |
| anticorpo de detecção p53, Alexa Fluor 488 rotulado | Santa Cruz | sc-126 | concentração de estoque 200μ g / mL |
| Tampão de citrato de soro fisiológico | Gibco | 15557-044 | |
| Betaína | Sigma | 61962 | |
| Sulfato de dodecil de sódio | Sigma | L3771 | |
| Placa de 384 poços (baixo volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Cilindro de gás nitrogênio | BOC | Grau industrial, livre | |
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Droplets | |||
| Micromanipulador | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Microinjetor Manual | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipeta | Origio, Dinamarca | MBB-FP-L-0 | |
| Bombas de seringa | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μ Seringa L | Hamilton | 81020 | Estanque a gás, PTFE Luer lock |
| Seringa de 1 mL | Hamilton | 81327 | Estanque a gás, PTFE Luer lock |
| Isolador de silicone | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | Isolador de silicone de 6x4 poços com adesivo |
| Cortador a laser | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | para corte a laser de isoladores personalizados |
| Folha | de acrílico de 1 mm de espessuraWeatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | para corte a laser de isoladores personalizados |
| Folha adesiva | 3M | usada para aderir isoladores personalizados a lamínulas microdispostas | |
| Super cola | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μ m ID/360 μ tubo de sílica fundida m OD | IDEX | FS-115 | |
| 1,0 mm ID/1/16" Tubulação OD PFA | IDEX | 1503 | |
| 0.014" Identificação / 0,062 " Tubulação de PTFE OD | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP tubulação | IDEX | 1673 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Óleo mineral | Sigma | M5904 | |
| Água ultrapura | Millipore, Alemanha | MilliQ | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Microscopia & Microscópio óptico | |||
| TIRF com platina XY codificada | Nikon, Japão | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Irlanda | IXON DU-897E | |
| Fonte de excitação a laser | Vortran, EUA | Stradus 488-50 | |
| Fonte de laser de lise óptica | Continuum, EUA | Microscópio Surelite SLI-10 | |
| cubo de filtro para TIRF | Chroma, EUA | z488bp | |
| Cubo de filtro de microscópio para laser de lise óptica | 2000, Reino Unido | LPD01-532R-25 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Software de análise de imagem | |
| Matlab | Mathworks | versão 7.14 ou superior | Software de análise de imagem |
Referências
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development.....
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Reimpressões e permissões
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