Summary
Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour obtenir des résultats localisation subcellulaire de protéine sur la rétine de poisson-zèbre en corrélant la microscopie photonique Super-résolution et images de microscopie électronique à balayage.
Abstract
Nous présentons une méthode pour étudier la localisation subcellulaire de protéine dans la rétine de larves de poisson zèbre en combinant microscopie Super-résolution et microscopie électronique à balayage. Les capacités de résolution limite de diffraction sous des microscopes lumière Super-résolution permettent d’améliorer l’exactitude des données corrélées. En bref, 110 nanomètre cryo-coupes épaisses sont transférés à une plaquette de silicium et, après immunofluorescence souillant, sont imagés par microscopie optique Super-résolution. Par la suite, les sections sont préservées en méthylcellulose et platine avec une ombre avant imagerie dans un microscope électronique à balayage (SEM). Les images de ces deux modalités de microscopie sont facilement fusionnés à l’aide de repères de tissu avec des logiciels open source. Nous décrivons ici la méthode adaptée pour le larves de poisson zèbre de la rétine. Toutefois, cette méthode est également applicable à d’autres types de tissus et d’organismes. Nous démontrons que les renseignements complémentaires obtenus par cette corrélation sont en mesure de résoudre l’expression des protéines mitochondriales en relation avec les membranes et les crêtes des mitochondries ainsi quant à d’autres compartiments de la cellule.
Introduction
Méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines et leur relation avec les différents compartiments de la cellule sont des outils essentiels pour comprendre leurs fonctions et leurs interactions possibles. Microscopie de Super-résolution en combinaison avec la microscopie électronique fournit ces informations1. Microscopie de déplétion état fondamental suivie d’une molécule individuelle retour (GSDIM) est une technique de microscopie de Super-résolution compatible avec un large éventail de fluorophores organiques et génétiquement codé2 ainsi qu’une résolution latérale jusqu'à 20 nm 3. l’intégration des méthodes avec une résolution supérieure à la norme limitée par la diffraction microscopy améliore la précision de la corrélation4,5,6. Afin d’obtenir la meilleure corrélation d’expression de la protéine avec un compartiment subcellulaire spécifique et de réduire le volume de l’incertitude7 l’utilisation de la même section ultramince pour la microscopie photonique et électronique est recommandé. Parmi les différentes méthodes de sectionnement, Tokuyasu cryo-section protocole ne nécessite pas de déshydratation ou résine enrobage et, en outre, préserve l’antigénicité des nombreux épitopes et fournit bon tissu ultrastructure8. Plusieurs méthodes ont démontré l’applicabilité de ces dispositions dans la lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM)4,5,9,10.
La rétine de poisson-zèbre est un modèle utile pour étudier le développement visuel et les mécanismes de la maladie humaine compte tenus de sa structure hautement conservée et sa fonction dans les vertébrés. En particulier, rétinienne photorécepteurs affichage la même architecture que les photorécepteurs chez les mammifères, avec une synapse basale, un coeur apico-à la base allongée, regroupement des mitochondries dans le segment interne plus apical et un segment externe composé de membrane disques en position apicale plus11. Localisation des protéines aux divers compartiments cellulaires est conservée entre poisson-zèbre et humain, permettant l’étude de la fonction biologique des protéines propres à la maladie humaine12,13.
Nous présentons ici un protocole visant à préparer les larve zebrafish rétine échantillons de résoudre la localisation de la protéine de la membrane mitochondriale externe Tom20 en microscopie corrélative Super-résolution photonique et électronique. La méthode est basée sur la collecte de cryo-sections sur des plaquettes de silicium et obtention de contraste par informations topographiques produites après l’application d’une fine couche de platine. Ces étapes sont des améliorations techniques clairs en termes de facilité d’utilisation, la reproductibilité et le temps de toutes les expériences. Nous avons récemment démontré l’applicabilité de la méthode pour détecter les pores nucléaires et protéines mitochondriales dans souris tissu14.
Protocol
toutes les expériences ont été effectuées conformément à la déclaration d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvées par les autorités locales.
1. préparation des coupes ultrafines sur des plaquettes de silicium
fixation d’échantillon- préparer la solution de fixation contenant 0,1 % de glutaraldéhyde, formaldéhyde à 4 % dans un tampon cacodylate 0,1 M.
Remarque : attention ! Soyez prudent lorsque vous travaillez avec tampon glutaraldéhyde, formaldéhyde et cacodylate, porter un équipement de protection individuelle approprié et travailler sous une hotte. - Euthanasier 5 jours après la fécondation (dpf 5) des larves de poisson zèbre avec tricaïne (méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle, 0,4 % p/v dans du PBS (tampon phosphate salin, pH 7)) comme décrit précédemment 15.
- Fixer les larves par immersion dans une solution fixateur préalablement refroidie sur la glace. Retirez la tête et incuber une nuit à 4 ° C, avec balancement doux.
- De disséquer les yeux en taillant les tissus autour de le œil à l’aide de pince fine et un scalpel microdissection (sous jumelles) en solution de fixation réfrigérée sur une plaque de gel d’agarose-lités de 1 %. Transférer les yeux dans un tube avec fixateur préalablement réfrigéré fraîche.
- Laver deux fois dans du PBS (tampon phosphate salin, pH 7,4) pendant 5 min chaque lavage à température ambiante (RT).
- préparer la solution de fixation contenant 0,1 % de glutaraldéhyde, formaldéhyde à 4 % dans un tampon cacodylate 0,1 M.
- Infiltration de gélatine et de montage
- Warm up 15 mL nourriture locale marque gélatine 12 % p/v dans PB (tampon phosphaté, 0,1 M, pH 7,4) à 40 ° C. Retirer le PBS et ajouter la solution de gélatine pour les tubes contenant les yeux. Appuyez sur le tube doucement pour s’assurer que les gélatine infiltrats l’échantillon et incuber pendant 10 à 30 min à 40 ° C dans un thermoblock avec agitant doucement ou dans un bain d’eau. Silicium
- remplir 12 x 5 x 3 mm ou polyéthylène plat intégrant des moules avec de la gélatine chaude dans un bain d’eau de 40 ° C. Ajouter deux yeux par moule à l’aide d’une pipette, alignez-les correctement sous jumelles à l’aide d’une aiguille de dissection et laissez les feuilles de gélatine refroidir à température ambiante pendant 1 min et durcir à 4 ° C pendant 20 min.
- Re-tailler le bloc de gélatine sous les jumelles pour s’adapter à un seul œil par bloc à l’aide d’une lame de rasoir.
- Transfert aux yeux de gélatine incorporé à 2,3 M de sucrose dans PB sur la glace. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Exchange à la nouvelle solution de sucrose à 2,3 M et conserver à 4 ° C ou -20 ° C ; après cette étape, les échantillons sont prêts pour le sectionnement ou peuvent être stockés à-20 ° C pendant plusieurs semaines ou mois.
- Re-tailler le bloc de gélatine à presque la taille de le œil avant de les transférer à une broche-cryo. Congélation dans l’azote liquide et le transfert d’une cryo-ultramicrotome.
- Cryosectioning
- coupe 110 nm d’épaisseur-sections à-120 ° C avec un couteau de diamant dans la cryo-ultramicrotome.
- Choisir les sections avec une boucle filaire contenant une goutte de 2 % de méthylcellulose (en eau) et de solution de saccharose de 2,3 M (1:1). Transfert en sections d’une plaquette de silicium de 7 x 7 mm. Stocker les sections à 4 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
2. Immunomarquage
- gaufrettes de lavage avec du PBS à 0 ° C pendant 20 min sur quatre gouttes en plaçant les plaquettes à l’envers sur les gouttes. Laver dans du PBS 2 x 2 minutes à température ambiante.
- Incuber 3 fois à 0,15 % de glycine dans du PBS, pendant 1 min chaque. Laver 3 fois pendant 1 min/laver avec du PBS. Avant incubate avec PBG (PBS avec 0,5 % d’albumine sérique Bovine BSA et 0,2 % gélatine type B) pendant 5 min.
- Incuber avec lapin anti-Tom20 (voir la Table des matières) dans PBG (4 µg/mL) pendant 30 min à température ambiante.
- Laver 6 x 1 min/lave en photonique. Avant incubate avec PBG pendant 5 min à RT. Incuber avec anti-lapin Alexa 647 F(ab') 2 (voir la Table des matières) dans PBG (7,5 µg/mL) pendant 30 min.
- Laver 6 x 1 min/lave en photonique. Laver 3 x 2 min dans du PBS. Incuber au DAPI (4 µg/mL) dans du PBS pendant 10 s. lavage, 2 x 2 min dans du PBS.
3. Microscopie de Super-résolution
- incuber la gaufrette brièvement (10 s) en le plaçant sur une goutte d’une solution de 1:1 de glycérol (80 %) et l’imagerie tampon contenant un oxygène nettoyage système (200 mM tampon Phosphate contenant 10 % de glucose, 0,5 mg/mL oxydase, catalase de µg/mL 40, chlorhydrate de bêta-mercaptoethylamine de 15 mM (MEA HCL), pH 8,0).
- Imagerie tampon (comme à l’étape 3.1) et de transférer les gaufres (section vers le bas) dans un plat de Pétri de verre bas (épaisseur 170 ± 5 µm) sur une nouvelle goutte du mélange 1:1 de glycérol (80 %).
- Enlever de tous les côtés, avec une pipette, la plupart du liquide sous la plaquette. Utiliser des bandes de silicone pour fixer la plaquette au fond de la boîte de Pétri.
NOTE : Bandes de Silicone sont faites de silicone-colle à deux composants (3 x 12 mm). - Image sections sur un microscope inversé à l’aide d’une grande ouverture numérique (par exemple 160 X / NA 1,43 ; Voir la Table des matières) objectif dédié Super-résolution à immersion à huile. Avant l’imagerie, laisser l’échantillon est proportionnelle à la température de microscope afin de minimiser/réduire la dérive latérale et axiale.
- Centre de la zone d’intérêt et acquérir les premières images de référence widefield épifluorescence. Remplacez le mode de fonctionnement de super résolution. Régler la durée d’exposition de la caméra à 15 ms et fixer l’électron multipliant gain (EM) au maximum de 300.
- Échantillon s’allument avec le 642 nm onde entretenues laser à puissance maximale de laser (correspondant à ~2.8 kW/cm 2) en mode épifluorescence. Dès que la molécule unique clignote sont bien séparées dans chaque cadre, afin que la probabilité est faible que des signaux individuels se chevauchent, la valeur de la puissance du laser à ~0.7 kW/cm 2. Enregistrer l’image raw en épifluorescence mode en acquérant un minimum de 30 000 images.
NOTE : Tous ces paramètres peuvent varier selon différents spécimens et étiquetage densités. - Partir des données brutes, générer une liste d’événements de reconstruction (localisations de chaque clignotement seule molécule dans l’image raw) en utilisant un seuil de détection de 30 photons (doit être ajustée selon l’exemple) en cliquant sur " Evaluate " dans le ' t-series analyse ' sous ' outils '.
- Visualiser l’image de Super-résolution par raccord gaussien 16 appliquer une taille de pixel de rendu de 4 nm en cliquant sur " créer une Image " dans les ' panneau de traitement liste événement ' sous ' outils. '
Remarque : Les outils logiciels intégrés du système utilisé dans cette étude étaient employées pour générer l’image super résolu. Toutefois, l’imagerie décrit super résolution pouvait être effectuée sur n’importe quel autre système de localisation basée seule molécule et les données ont été traitées avec des outils logiciels open source comme orage 17.
4. Observation en situation de platine
- enlever les rayures de silicium et ajouter une goutte de PBS à proximité des bords de la gaufrette pour la soulever vers le haut de la boîte de Pétri. Laver la gaufrette 2 x 2 min dans du PBS, puis post Fixez-le avec 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBS pour 5 min. laver 2 fois pendant 2 min/cycle de lavage en PBS.
- Incuber les plaquettes deux fois pour 5 min/incubation dans 1 goutte de méthylcellulose 2 % dans de l’eau sur la glace. Insérer la plaquette dans un tube à centrifuger et centrifuger à 14 100 x g pendant 90 s. Mont il sur une ébauche d’aluminium SEM sous la direction de ciment carbone.
- Ajouter une couche de 2 à 10 nm de platine/carbone sur l’échantillon par ombrage rotatif à 8° à l’aide d’un électron faisceau de paramètres de périphérique d’évaporation : 1,55 kV, 55 mA, à 0,3 nm/s et un angle de 8°, niveau de rotation 4.
5. Microscopie électronique à balayage
- sections de l’Image avec un balayage électronique microscope à 1,5 kV, 2 mm de travail à distance et avec un objectif détecteur d’électrons secondaires.
6. Alignement de lumière et d’Images de microscopie électronique
- ouvert les deux types d’images avec Fidji 18 en cliquant sur " fichier | Ouvert ". Ajustez la taille du canevas en cliquant sur " Image | Ajuster | Taille du canevas " et porter les deux images à une pile en cliquant sur " Image | Piles | Images à empiler ". Économiser la pile en tant que type de fichier tiff.
- À Fidji, ouvrez une nouvelle interface de 19 TrackEM2 en cliquant sur " fichier | nouveau | TrackEM2 (nouveau) ". Importer la pile avec les deux images en un clic droit sur la fenêtre noire et en sélectionnant " pile d’importation ". Image de microscopie
- Align lumière à l’image de microscopie électronique manuellement avec des points de repère en utilisant un clic droit de la souris sur l’image puis sélectionnez " Align | Aligner le calque manuellement avec des points de repère ".
- Pick select tool (flèche noire) pour ajouter des points de repère. Utilisez la forme des noyaux comme référence pour sélectionner les arêtes de mêmes dans les deux images (supplémentaire Figure 1). Ajouter plusieurs points (minimum de trois points doivent être choisis). Appliquer l’alignement avec un modèle affine en droit de la souris en cliquant et en sélectionnant " appliquer transformation | Modèle affine ".
- Changer la couche de transparence (voir figure1 supplémentaire) pour évaluer la qualité de l’alignement.
Representative Results
L’expression de la protéine Tom20, une sous-unité de la translocase la membrane mitochondriale externe complexe20, a déterminé, dans les sections minces de rétine de larves de poisson zèbre, par microscopie photonique Super-résolution (Figure 1) et cette information a été complété avec le signal topographique obtenu par microscopie électronique à balayage après occultation platine des mêmes sections. Ces données corrélatives confirment la localisation d’une protéine en liaison avec un compartiment en particulier, la membrane mitochondriale externe et, en outre des informations sur la relation de la protéine avec les autres organites de la cellule.
Figure 1 : CLEM sur rétine zebrafish. A. image de widefield faible grossissement d’une section rétinienne de 5 dpf poisson-zèbre, noyaux colorés au DAPI (cyan). B. microscopie électronique de la même région. C. image de widefield grossissement supérieur du cadre B. noyaux colorés au DAPI (cyan) et Tom20 mitochondrial coloration apparaît en rouge. D. Widefield image de section même à fort grossissement. Le modèle d’expression Tom20 est à l’amas des mitochondries. E. Expression de Tom20 (points rouges) en microscopie GSDIM. Les noyaux colorés au DAPI (cyan). F. même section sous la forme E combinant Super-résolution corrélative et microscopie électronique à balayage. Tom20 coloration (points rouges) apparaît au pôle mitochondrial (M) à la membrane externe des mitochondries. Signal de fluorescence DAPI dans le noyau (N) correspond à la topographie de l’image de la SEM. G. image fort grossissement d’encadrement en F. L’image de microscopie électronique à balayage fournit le contexte à l’image GSDIM (points rouges). Crêtes mitochondriales sont clairement visibles et la coloration de Tom20 est localisée dans la membrane externe des mitochondries. Les membranes du segment externe les photorécepteurs (OS) sont clairement résolues. Image pixels taille 5 nm. Barreaux de l’échelle : A, B et c : 10 µm ; D: 2 µm ; E et F: 1 µm et G: 0,2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : alignement des images de microscopie photonique et électronique. A. capture d’écran d’interface TrackEM2 avec image SEM et repères numérotés (jaunes) le long de différents noyaux. B. capture d’écran d’interface TrackEM2 avec image de fluorescence et repères numérotés (jaune) le long de différent DAPI teinté de noyaux. Pour modifier la transparence du calque les curseurs sur la partie supérieure gauche du menu peuvent être utilisés. Echelle : 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cette méthode combine la localisation des protéines Super résolu avec les informations de contexte pour déterminer la position précise des protéines dans un organite. Nous démontrons ici l’achèvement de l’expérience de visualiser l’expression de Tom20 dans la membrane externe des mitochondries et sa relation aux autres organelles comme noyaux ou des segments externes des photorécepteurs de la rétine de larves de poisson zèbre.
Tokuyasu cryo-découpe nécessite une formation pour acquérir des sections bien préservées. Toutefois, il s’agit d’une méthode employée dans de nombreux laboratoires avec succès démontré21. Transfert des sections à la plaquette de silicium est très simple et sans considérations particulières sont nécessaires. L’utilisation de glycérol dans la mémoire tampon d’imagerie est une étape très critique pour éviter le séchage des sections. Pour l’imagerie de Super-résolution les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la plaquette est très près du fond de verre de la boîte de Pétri. Les bandes de silicone aident à maintenir la gaufrette dans cette position. Une attention particulière doit être prise tout en éliminant les bandes afin d’éviter d’endommager les sections.
L’épaisseur des cryo-sections, environ 100 nm, plus mince que la résolution optique dans la dimension Z, facilite en outre la précision de cette méthode corrélative que le signal de microscopie de Super-résolution vient seulement de cette fine couche et le microscope électronique à balayage signal affiche la topographie de l’échantillon. Cette méthode peut également être combinée avec imagerie multicolore. Cependant, spécial il faut que l’échantillon peut être photographiée sous les mêmes conditions (p. ex. imagerie tampon) et la diaphonie devraient être évitée.
Une des limites de la méthode est ses deux dimensions approcher, car seul un nombre limité de coupes sériées (environ de 3 à 7 par plaquette) peut être collecté. Ainsi, les projets consacrés à l’analyse du volume ne serait pas idéales. Cependant, c’est une méthode qui peut être utilisée pour détecter l’expression de la protéine dans n’importe quel type de tissu par simple sectionnement de l’échantillon. Nous fournissons une méthode sans utilisation d’agents de contraste classique comme citrate acétate ou plomb d’uranyle. Le contraste par occultation platine offre un contraste topographique très instructif, mais dans certains cas, les membranes sont difficiles à résoudre. Cela peut poser des problèmes pour les projets qui doivent, par exemple, pour déterminer l’expression de protéines en petites vésicules.
Notre protocole, basé sur Tokuyasu cryo-sections, utilise l’équipement standard pour obtenir des résultats corrélatives de Super-résolution et microscopes électroniques à balayage. La collection des sections sur des plaquettes de silicium et l’utilisation du platine pour un contraste sont des étapes simples pour assurer la stabilité et la reproductibilité de la préparation de l’échantillon.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financement des ions et RVB : Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE accorde PZ00P3 142404/1 et PZ00P3 163979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
| Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
| Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| Sucrose | Merck | #1.07687 | |
| Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
| Glycine | Sigma | #G-7126 | |
| Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
| BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
| Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
| Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
| Wired loop "Perfect loop" | |||
| Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc - 11415 | |
| AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
| SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
| Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
| Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
| SEM - Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| FIB-SEM - Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
References
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