Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

Resumo

Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório.

Resumo

A linhagem celular intersticial de Hydra inclui células estaminais multipotentes e seus derivados: células da glândula, nematócitos, células germinativas e células nervosas. As células intersticiais podem ser eliminadas através de dois tratamentos consecutivos com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão, eliminando o potencial de renovação das células diferenciadas derivadas das células estaminais intersticiais. Isso permite a geração de Hydra que carece de células nervosas. Um pólipo livre de nervos não pode abrir a boca para alimentar, por exemplo, ou regular a pressão osmótica. Tais animais, no entanto, podem sobreviver e ser cultivados indefinidamente no laboratório, se regularmente forçados e erguidos. A falta de células nervosas permite estudos sobre o papel do sistema nervoso na regulação do comportamento e regeneração dos animais. Os protocolos previamente publicados para a manutenção da Hydra sem nervos envolvem técnicas desatualizadas, como a pipetagem bucal com micropipetas tIps para alimentar e limpar a Hydra . Aqui, é introduzido um protocolo melhorado para a manutenção da hidra livre de nervos. As pinças de ponta fina são usadas para forçar a abertura da boca e inserir Artemia recentemente matada. Após a alimentação forçada, a cavidade do corpo do animal é lavada com meio fresco usando uma seringa e uma agulha hipodérmica para remover material não digerido, aqui referido como "eructo". Este novo método de alimentação forçada e eructação de hidratação livre de nervos através do uso de fórceps e seringas elimina a necessidade de pipetagem bucal usando pontas de micropipetas extraídas à mão. Isso torna o processo mais seguro e significativamente mais eficiente no tempo. Para garantir que as células nervosas no hipossêtomo tenham sido eliminadas, é realizada a imuno-histoquímica utilizando tirosina-tubulina.

Introdução

O sistema nervoso de Hydra consiste em uma rede nervosa, com neurônios associados a ambas as camadas de tecido epitelial ¹ . A rede nervosa é mais densa no hipossênero e pedúnculo e menos densa na coluna ² do corpo. As células nervosas são originárias de células estaminais intersticiais, que são células-tronco multipotentes que originam células secretoras, nematócitos, células germinativas e neurônios ¹ . É possível eliminar as células intersticiais de Hydra vulgaris através do tratamento com colchicina ^{3 , 4} , uma toxin....

Protocolo

1. Tratamento duplo de colchicina

1. Faça uma solução de 0,4% de colchicina (peso / volume) em Hydra medium ^{3 , 4 , 17} .
   Cuidado: Colchicina é extremamente tóxica, fatal se ingerido, pode causar defeitos genéticos e pode causar danos nos olhos. Pegue o pó em uma chaminé e use equipamentos de proteção pessoal completos (PPE).
2. Incubar Hydra vulgaris (estirpe AEP aqui utilizada) que foram submetidos à privação durante 24 horas em 0,4% de colchicina na proporção de 5 Hydra por mL de solução de colchicina em uma....

Resultados

Imediatamente após o tratamento inicial de 8 h de colchicina, todos os Hydra sobrevivem. Algumas dessas Hydra terão apenas os talões do tentáculo restantes ( Figura 3 A ), enquanto outros terão perdido completamente seus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante os seguintes 1 ou 2 dias, os tentáculos continuarão a diminuir até que todas as Hydra tenham perdido seus tentáculo.......

Discussão

As células intersticiais da Hydra podem ser eliminadas através de um tratamento com colchicina dupla ^{3 , 4} . Nos dias que se seguem ao primeiro tratamento, é fundamental evitar o contato entre Hydra individual para evitar a fusão de peças Hydra em Hydra deformada. Além disso, os animais que podem comer sem assistência após o primeiro tratamento devem ser removidos, pois o segundo tratamento com colchicina pode não ser.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colchicina	Acros Organics	227120010
Seringa de 1 mL	BD	301025
Camarão Salmoura Ovos	Camarão Salmoura Direto	N/A	Pode ser comprado localmente
Camarão Salmoura Prato de Incubação	Camarão Salmoura Direto	N/A
60 mm x 15 mm Placa de Petri	Celltreat	229663
30 G x 3/4" Agulha hipodérmica	Covidien	1188830340	Uma agulha 27G também pode ser usada
2 x pinças de ponta fina	Dumont	0109-5-PO
Rifampicina	EMD Millipore	557303
Cabra anti-rato lgG, Pab (Conjugado HRP)	Enzo	ADI-SAB-100-J
Albumina de soro bovino (BSA)	Fisher	BP9703-100
Bisturi	Soro Fetal Bovino Fisher	08-920A
(FBS)	Gibco	10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)	Invitrogen	D1306
PBS Comprimidos	MP Bio	2810305
Anti-Tubulina Monoclonal, Tirosina	Sigma	T9028
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Peróxido de hidrogênio	Sigma	216763
Paraformaldeído (PFA)	Sigma	P6148
Triton X - 100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P1379
de uretano	Sigma	U2500
	Tetra	77846-00
Pipeta de vidro Pasteur	VWR	53283-916	O comprimento da pipeta não importa Tubo de
15 mL Lixa	VWR	89039-670
P320	3M	IBGABBV00397	Pode ser comprado em uma loja local de materiais de construção

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