Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Resumo

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Resumo

As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.

Introdução

Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências¹. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam². Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação o....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.

1. preparação do reagente

1. Soluções conservadas em estoque
   1. Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH₂Mix O. bem até que se dissolva completamente.
   2. Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH₂Mix O. bem até que se dissolva completamente.
   3. Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH₂Mix O. bem até que se dissolva completamente.
   4. Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5....

Resultados

Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados também. Por outro lad.......

Discussão

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária^10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish²<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de Leibovitz (L-15)	Sigma-Aldrich	L1518	suplementado com L-glutamina
Soro bovino fetal (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Tricaine metanossulfonato (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Sacarose	Acros Organics	57-50-1
Trealose	Acros Organics	99-20-7	Dihydrate
Metanol	Reanal	20740-0-08-65
Propilenoglicol	Reanal	08860-1-08-65
Dimetilsulfóxido Reanal		00190-1-01-65
Colagenase	Gibco	9001-12-1
Tripsina	Sigma-Aldrich	T8003
DNase I	Panreac AppliChem	A3778
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	Comprimidos para preparação de 200 ml de solução PBS