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Artigo de método

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

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DOI:

10.3791/56118

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4 de março de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Szent István University

Neste artigo

Resumo

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Resumo

As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.

Introdução

Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo - e eficiência do trabalho2.

Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.

Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.

Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.

1. preparação do reagente

  1. Soluções conservadas em estoque
    1. Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
    2. Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
    3. Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
    4. Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
    5. Preparar a tripsina de 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) adicionando-se 75 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
    6. Prepare-se 1 mg/mL DNase eu (~ 3000 U/mg) pela adição de 5 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
    7. Prepare-se 0,4% trypan azul adicionando-se 40 mg de azul de Tripan a 10 mL de PBS. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL.
    8. Preparar a 200 mg/L de MS-222 (sulfonato de metano tricaina) adicionando-se 200 mg de MS-222 em 1 L de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente. Além disso, o MS-222 tampão com bicarbonato de sódio para um pH neutro de 7.0.
  2. Soluções para vitrificação
    1. Preparar a solução de equilíbrio (ES): preparar 2 mL de ES misturando 121.5 µ l de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 µ l de propilenoglicol (PG; 1,5 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l da solução estoque de trealose (0,1 M), 50 µ l de solução-mãe de HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l de L-15 em um 2 tubo mL.
    2. Preparar a solução de vitrificação (VS): preparar 2 mL de VS misturando 439 µ l de PG (3 M), 426 µ l de dimetil sulfóxido (Me2então; 3 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l de solução-mãe de trealose (0,1 M), 50 µ l de HEPES estoque solução (25 mM) e 685 µ l de L-15 em um tubo de 2 mL.
  3. Soluções para o aquecimento
    1. Preparar a solução de aquecimento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 450 µ l de solução de sacarose (3M) e 900 µ l de L-15.
    2. Preparar a solução de aquecimento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 150 µ l de solução de sacarose (1 M) e 1200 µ l de L-15.
    3. Preparar a solução de aquecimento 3 (WS3): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL por mistura de 150 µ l FBS (10%) e 1350 µ l de L-15.
  4. Preparar a solução de digestão: para cada amostra prepare 500 µ l da solução de digestão, misturando-se 50 µ l de solução colagenase (2 mg/mL), 50 µ l de solução tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l de DNase I (20 µ g/mL) e 390 µ l de L-15 em um 2 mL do tubo.
  5. Obter ferramentas de dissecação: tesoura, micro-tesouras, pinças, pinças curvas e agulhas de acupuntura.

2. testículos coleção

  1. Eutanásia o peixe, colocando-o em um prato contendo 200 mg/L de MS-222 (pH = 7). Antes de continuar com a dissecação, certifique-se que as brânquias têm parou de se mexer e pelo menos 10 min se passaram desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.
  2. Seque o peixe, acariciando-o em uma toalha de papel e coloque-o de lado dorsal em uma esteira de dissecação.
    1. Em primeiro lugar, corte as barbatanas peitorais e pélvicas para dissecação mais fácil.
    2. Horizontalmente, cortar a pele na barriga do peixe entre as barbatanas peitorais e cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga até a nadadeira anal.
    3. Abra a cavidade do corpo do peixe e fixar a parede corporal esquerda e direita para o tapete de dissecação com agulhas.
      Nota: Os testículos estão localizados acima os órgãos gastrointestinais em ambos os lados da natação bexiga (Figura 1).
  3. Para evitar contaminação, não retire os órgãos gastrointestinais, mas suavemente empurrá-los para um lado e retire o testículo do lado oposto. Os testículos estão ligados à parede do corpo então remova-os cuidadosamente e cortar o ligação peritônio por micro-tesouras.
  4. Além disso, a fim de evitar a contaminação, em primeiro lugar esterilizar os testículos colocando-os em etanol a 70% por 2 s e depois coloque-os em L-15 em uma placa de 96 poços no gelo.
    Nota: Se for necessário, testículos limpos de tecido adiposo e grandes vasos sanguíneos precisamente sob o microscópio estereoscópico

3. ultrarápido arrefecimento do tecido Testicular

  1. Agulhas de Mark com Etiquetas apropriadas, dependendo do exemplo digite e preparem a equilibração (ES) e soluções de vitrificação (VS).
  2. Transferi os testículos para uma placa bem maior ou prato e pino dois ou três testículos (ou mais dependendo do tamanho da agulha) em uma agulha estéril de acupuntura.
    1. Em primeiro lugar, posição do testículo no topo curvas pinças. Coloque a ponta da agulha no meio do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima, com a pinça.
    2. Após a punção do testículo, gentilmente puxe-o para cima em direção ao topo da agulha. Certifica-se de que os testículos são separados uns dos outros e que não estão caindo ou deslizar para baixo.
    3. Lugar cheio de agulhas com testículos fixados em um tubo de 2 mL com L-15 até vitrificação (em 25 ˚ c; tempo de armazenamento não deve exceder 1 h).
      Nota: Condecorando os testículos a agulha deve ser feito rapidamente para evitar que os testículos de secar.
  3. Transferir a agulha com testículos para a solução de equilíbrio e incubar durante 5 min à 25˚C.
  4. Transferir a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 s em 25˚C.
  5. Retire a agulha a partir da solução de vitrificação, rapidamente e suavemente absorver o restante da solução do tecido por uma toalha de papel estéril. Tome cuidado para evitar os testículos degola para a toalha de papel ou cair.
  6. Rapidamente Coloque a agulha no nitrogênio líquido, colocado em uma caixa de isopor.
    Nota: Fazer este passo rapidamente para evitar a exposição do tecido para o vapor de nitrogênio líquido. Use volumes baixos de nitrogênio líquido para evitar a contaminação das amostras.
  7. Manter a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por 5-10 min.
  8. Precool um criotubo abriu 4,5 mL e sua tampa na mesma caixa.
  9. Após 5-10 min, transfira cada agulha em um separado criotubo sob a superfície do nitrogênio líquido e fechar o criotubo.
    Atenção: Sempre use roupas de proteção (como luvas isoladas) quando trabalhar com nitrogênio líquido como exposição pode levar a graves queimaduras.
  10. Coloque o criotubo com um bastão de metal e colocá-lo no recipiente do cryobank mais rápido possível. Armazenar as amostras em um armazenamento de cilindro dewar até utilização posterior.

4. procedimento de aquecimento

  1. Cada agulha quente separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem ser a 25 ° C.
  2. Desanexe o criotubo da cana-de-metal e mergulhá-lo no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.
  3. Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido (usando fórceps) e liberar a agulha para o nitrogênio líquido.
  4. Transferir a agulha muito rápido para a primeira solução de aquecimento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar o seu aquecimento no ar durante a transferência.
  5. Transferir a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por 3 min (a 25 ° C).
  6. Transferir a agulha para a terceira solução de aquecimento e incubar durante 5 min (a 25 ° C).
  7. Libere os testículos da agulha deslizando-as para baixo com uma pinça curvada. Lugar cada testículo aquecido individualmente em um poço separado (placa de 96 poços) repleto de 250 µ l de L-15 suplementado com 10% FBS. Certifique-se que os poços são rotulados de acordo com a amostra. Manter a placa bem no gelo até que todas as amostras são aquecidas e até trabalhos futuros.

5. tecido digestão

  1. Prepare-se para cada amostra em tubos separados 2 mL 500 µ l da solução de dissociação. Etiquete os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução preparada de dissociação por 5 min à temperatura ambiente.
  2. Adicione o tecido aquecido para a solução de digestão e corte em pedaços pequenos pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena.
  3. Incube o tecido cortado em uma placa de agitação durante 90 minutos a 25 ˚ c.
  4. Parar o processo de digestão, adicionando a 400 µ l de L-15 e 100 µ l de FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitar a solução e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
  5. Filtre a solução obtida através de 50 µm de filtros em um tubo de 1,5 mL. Rotule os tubos em conformidade.
  6. Centrifugue a solução filtrada em 200 × g por 10 min a 25 ˚ c.
  7. Retire o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em 20 µ l de L15 suplementado com 10% FBS. Manualmente, agite o tubo até a pelota é completamente dissolvida. Manter a suspensão de células no gelo ou no 4 ˚ c até nova utilização.

6. viabilidade avaliação e contagem de células

  1. Mistura de 5 µ l de suspensão de células e 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo PCR apropriadamente rotulado 0,2 mL. Se forem usados diferentes volumes, certifique-se de que a razão de diluição de 1:1 permanece.
  2. Incube a esta suspensão para 1 a 3 min à temperatura ambiente (25 ° C).
  3. Verifica a viabilidade de cada amostra em um hemocytometer sob o microscópio.
  4. Conte o número de células vivas (inocente por trypan blue) em 15 campos. Calcule o número total de células em 20 µm da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação a jusante.
    Nota: Ao otimizar o procedimento para as outras espécies com maior tamanho corporal, use fragmentos de testículo de peso igual. Use os testículos de um indivíduo para todos os grupos experimentais a fim de evitar a variabilidade individual nos resultados. No caso de zebrafish, tiramos proveito do fato de que esquerda e direito testículo deve conter um número igual (ou muito semelhante) de células germinativas13 (Ver os resultados do representante). O testículo esquerdo foi mantido como um controle enquanto o testículo direito foi vitrificados/aquecido. Porcentagem de viabilidade foi calculada o número de células isoladas de testículo vitrificados/aquecido em relação ao número de células isoladas de testículos frescos.

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Resultados

Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados também. Por outro lad...

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Discussão

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish2<...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meios de Leibovitz (L-15)Sigma-AldrichL1518suplementado com L-glutamina
Soro bovino fetal (FBS)Sigma-AldrichF9665
Tricaine metanossulfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
SacaroseAcros Organics57-50-1
TrealoseAcros Organics99-20-7Dihydrate
MetanolReanal20740-0-08-65
PropilenoglicolReanal08860-1-08-65
Dimetilsulfóxido Reanal00190-1-01-65
ColagenaseGibco9001-12-1
TripsinaSigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417Comprimidos para preparação de 200 ml de solução PBS

Referências

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