Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microinjection in vivo é a técnica de transferência do gene mais comumente usados para analisar as funções do gene em mosquitos individuais. No entanto, esse método requer uma mais tecnicamente exigente operação e envolve procedimentos complicados, especialmente quando usado em larvas devido ao seu pequeno tamanho, cutícula relativamente fina e frágil e alta mortalidade, que limitam a sua aplicação. Em contraste, vetores virais para a entrega do gene foram desenvolvidos para superar barreiras extracelulares e intracelulares. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, gene alta eficiência de transdução, manutenção a longo prazo da expressão do gene e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) são específicos de mosquito, pequenos vírus de DNA único-encalhado que podem efetivamente entregar estrangeiros ácidos nucleicos nas células de mosquito; no entanto, a substituição ou a inserção de genes estrangeiros para criar vírus recombinantes normalmente provoca uma perda de habilidades de embalagens e/ou replicação, que é uma barreira para o desenvolvimento destes vírus como vetores de entrega.
Neste documento, nós relatamos utilizando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. São descritos os procedimentos detalhados para a construção, a embalagem e a análise quantitativa dos vetores rAaeDV e para infecção larval.
Este estudo demonstra, pela primeira vez, a viabilidade de desenvolver um com defeito não recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressão sistema, desta forma fornecendo uma poderosa ferramenta de análise funcional de genes no mosquito e estabelecendo uma base para o aplicação de paratransgenesis viral para controlar doenças transmitidas por mosquitos. Demonstrámos que instar as larvas do Aedes albopictus 1st podem ser facilmente e eficazmente infectadas introduzindo o vírus para o corpo de água das larvas reprodução local e que o rAaeDVs desenvolvido poderia ser usado para overexpress ou derrubar o expressão de um gene alvo específico em larvas, fornecendo uma ferramenta de análise funcional de mosquito genes.
Introdução
Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a e....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê ético de Southern University Medical.
1. projetar um intrão Artificial
Nota: O intrão artificial utilizado neste trabalho é 65 bp em comprimento e a sequência é 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Coloque o Hpa eu restrição site em ambas as extremidades do intron artificial então esse Hpa eu digestão pode liberar o intrão de plasmídeos (consulte a Figura 1 A).
- Lugar os dois Xba eu sites de restrição do intron então aquele <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Estratégias para a construção de rAaeDV
Um vetor de rAaeDV com defeito foi gerado para expressar o gene DsRed em larvas do mosquito. O plasmídeo resultante continha uma gaveta de proteína NS1-DsRed fusão com a proteína VP eliminada (Figura 1A). rAaeDV plasmídeos contendo a expressão construções para miRNA, amiRNA, Plasmideo e miRNA esponja foram projetados (mostrado na Figura 1B
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
É importante superar dois das principais barreiras que limitam a construção rAaeDV. O primeiro é a produção de vírus recombinantes com defeito. Tem sido relatado que o MDV pode ser usado como um vetor para expressar apropriadamente dimensionada genes estrangeiros, tais como neurotoxins20 de inseto específico de escorpião e a proteína GFP; no entanto, independentemente da estratégia de construção, uma vez que as ORFs do MDV são inserido ou substituído com genes exógenos, virions não podem formar independentemente a menos .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio financeiro da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1200500 de Chen Xiao Guang), Nacional Natural Science Foundation da China (81672054 e 81371846), a equipe de investigação do Natural Fundação de ciência de Guangdong (2014A030312016) e o programa científico e tecnológico de Guangzhou (201508020263). Reconhecemos com gratidão Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) para gentilmente fornecendo os plasmideos pUCA e p7NS1-GFP e ler criticamente este manuscrito.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Máquina centrífuga | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Sistema de Centrífuga | Beckman Coulter | 363118 | |
| Kit de Extração de Gel GeneJET | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Kit Midi de Plasmídeo | Omega Biotech | D6904 | |
| Ágar Purificado | OXOID | LP0028A | |
| Fosfatase alcalina termossensível FastAP (1 U/µ L) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µ L) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Célula Quimicamente Competente | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicilina | Pequim Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Verde) | Pequim Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
