Artigo de método

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

DOI:

10.3791/56121

⸱

6 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Neste artigo

Resumo

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Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Resumo

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Microinjection in vivo é a técnica de transferência do gene mais comumente usados para analisar as funções do gene em mosquitos individuais. No entanto, esse método requer uma mais tecnicamente exigente operação e envolve procedimentos complicados, especialmente quando usado em larvas devido ao seu pequeno tamanho, cutícula relativamente fina e frágil e alta mortalidade, que limitam a sua aplicação. Em contraste, vetores virais para a entrega do gene foram desenvolvidos para superar barreiras extracelulares e intracelulares. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, gene alta eficiência de transdução, manutenção a longo prazo da expressão do gene e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) são específicos de mosquito, pequenos vírus de DNA único-encalhado que podem efetivamente entregar estrangeiros ácidos nucleicos nas células de mosquito; no entanto, a substituição ou a inserção de genes estrangeiros para criar vírus recombinantes normalmente provoca uma perda de habilidades de embalagens e/ou replicação, que é uma barreira para o desenvolvimento destes vírus como vetores de entrega.

Neste documento, nós relatamos utilizando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. São descritos os procedimentos detalhados para a construção, a embalagem e a análise quantitativa dos vetores rAaeDV e para infecção larval.

Este estudo demonstra, pela primeira vez, a viabilidade de desenvolver um com defeito não recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressão sistema, desta forma fornecendo uma poderosa ferramenta de análise funcional de genes no mosquito e estabelecendo uma base para o aplicação de paratransgenesis viral para controlar doenças transmitidas por mosquitos. Demonstrámos que instar as larvas do Aedes albopictus 1st podem ser facilmente e eficazmente infectadas introduzindo o vírus para o corpo de água das larvas reprodução local e que o rAaeDVs desenvolvido poderia ser usado para overexpress ou derrubar o expressão de um gene alvo específico em larvas, fornecendo uma ferramenta de análise funcional de mosquito genes.

Introdução

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Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a evolução da resistência no mosquito populações3,4. Por estas razões, há uma necessidade urgente de métodos alternativos de mosquito controle e o uso de métodos transgênicos para produzir mosquitos machos estéreis e o lançamento de mosquitos resistentes ao patógeno surgiram como promissoras novas estratégias de controle. Para desenvolver novo eficaz controlar métodos, tais como seguras e eficazes abordagens para na vivo entrega de gene, a análise abrangente da função do gene de mosquito é necessária.

Microinjeção direta de plasmídeo, dobro encalhado RNA (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno (siRNA) é o mais comumente usado em vivo gene entrega método em mosquitos. Na verdade, a produção de variedades transgênicas de mosquitos ainda dependem de um processo de embrião microinjeção5,6,7. No entanto, microinjeção tem várias limitações. Em primeiro lugar, esta técnica é tecnicamente exigente e envolve procedimentos complicados. Em segundo lugar, a injeção faz com que um insulto físico para o embrião, larvas, pupas e adultos, que afecta directamente a viabilidade do organismo alvo. Em terceiro lugar, é difícil imobilizar as larvas de mosquito para microinjection porque a maioria vive em um habitat aquático e possuem uma característica que se contorcendo de movimento. Em quarto lugar, o tamanho de 1st-2nd ínstar larvas é 10 a 20 vezes menor do que a de 4th ínstar e larvas mais velhas e as cutículas da antiga são mais delicadas. Estas características tornam difícil de manipular 1st-2nd ínstar larvas em comparação com aqueles em estágios mais antigos. Combinados, esses fatores contribuem para uma taxa de sobrevivência de pós-injeção reduzida para larvas (cerca de 5%) em comparação com adultos8. Sistemas de entrega baseada em viral foram desenvolvidos para superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, transdução de alta eficiência, a longo prazo e robustos níveis de expressão e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Portanto, gene entrega sistemas utilizando lentivírus, retrovírus e adenovírus foram amplamente utilizado linhas de células inmammalian e espécie de modelo. O sistema de expressão viral de Sindbis tinha sido anteriormente usado para analisar a função do gene no mosquito adulto; Além das preocupações de segurança biológica, no entanto, a injeção é ainda um processo necessário para infecção viral9. Embora, a entrega oral por larvas de imersão na solução dsRNA tem sido relatada anteriormente como um método de entrega viável, é inadequada para o pequeno RNA função análise10. Então, métodos de efetiva entrega viral ainda devem ser desenvolvidos para os mosquitos.

Mosquito densoviruses (MDVs) fazem parte da subfamília Densovirinae de Parvoviridaee uma queda do género Brevidensovirus11. Virions MDV são não-envelopado e consistem de um genoma de DNA (ssDNA) single-stranded e um capsídeo icosaédrica (20 nm de diâmetro). O genoma viral é aproximadamente 4 kb em tamanho e é replicado dentro dos núcleos das células do hospedeiro. MDVs são relativamente estáveis no ambiente e mostram uma gama de hospedeiros estreitas com alta especificidade para os mosquitos. Estes vírus têm o potencial para se espalhar e persistir naturalmente em populações de mosquito e podem invadir quase todos os órgãos e tecidos desses insetos, incluindo o midgut, Malpighi túbulos, gordura corporal, massa muscular, neurônios e glândulas salivares12.

Genomas MDV intactas podem ser subcloned em vetores do plasmídeo para produzir clones infecciosos baseados no plasmídeo; Quando estes clones são entregues em células de mosquito, o genoma viral é extraído do vetor do plasmídeo, e partículas virais infecciosas são produzidas. Porque MDV tem um genoma pequeno ssDNA, clones infecciosos são facilmente construídos e o genoma viral pode ser facilmente manipulado11,13. Estas características fazem MDV um valioso agente para examinar a biologia do mosquito. No entanto, porque quase toda a sequência do genoma viral é essencial para proliferação viral, a criação de vírus recombinantes através da substituição ou inserção de genes estrangeiros provoca uma perda na capacidade de embalagens e/ou replicação viral, que cria um barreira para o desenvolvimento de MDVs como vetores de entrega do gene. Neste documento, nós relatamos usando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um rAaeDV não-defeituoso na vivo RNA entrega sistema que tem as vantagens da construção fácil do plasmídeo e a manutenção de um vírus funcional que pode produzir estável e de longo prazo expressão em células hospedeiras, sem a necessidade de vírus do tipo selvagem. Além disso, este método permite a fácil transdução de larvas.

Os protocolos para as etapas a seguir são descritos neste estudo: linha 1) projeto de rAaeDVs codificação uma gaveta intrônicas expressão pequeno-RNA, 2) produção de partículas de vírus recombinantes usando a célula de empacotamento C6/36, 3) análise quantitativa de célula livre rAaeDV genoma copiar números e 4) infecção do Ae. albopictus larvas por introdução directa de vírus para o corpo de água do habitat larval. Em geral, este trabalho demonstrou que RNAs pequeno específico genes-alvo podem ser overexpressed ou derrubados em larvas de mosquito, usando o sistema de entrega MDV desenvolvido.

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Protocolo

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todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê ético de Southern University Medical.

1. projetar um intrão Artificial

Nota: O intrão artificial utilizado neste trabalho é 65 bp em comprimento e a sequência é 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. Coloque o Hpa eu restrição site em ambas as extremidades do intron artificial então esse Hpa eu digestão pode liberar o intrão de plasmídeos (consulte a Figura 1 A).
  2. Lugar os dois Xba eu sites de restrição do intron então aquele Xba eu digestão pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão.
  3. Ordenar a síntese química de sequências de DNA completos do intrão artificial de um fabricante de DNA. O sintético DNA criado é de clonagem em um plasmídeo padrão pUC19.
    Nota: Os componentes essenciais do intrão artificial incluem vários elementos de nucleotídeos de consenso, incluindo um 5 ' site de tala doador (DS) com a sequência GUAAGAGU, uma sequência conservada ponto de ramificação (BPS) com a sequência UACUAAC, uma poli-pirimidina tracto (PPT), com a sequência UCUUC(U) 10 e um 3 '-site de tala aceitador (AS) com a sequência de GAUAUCCUGCAG ( Figura 1 A). Dois Xba eu sites de restrição foram introduzidas entre o DS e BPS que pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão. A capacidade de efetivamente emendar esta intrão artificial de células de mamíferos e mosquito foi previamente confirmados 14.

2. Projetando um Artificial intrônicas pequeno RNA expressão Cassette

Nota: para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências que codificam miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre o DS e BPS. Para servir como um exemplo, um precursor endógeno de miRNA de Ae. albopictus aal-deixe-7 foi selecionado para construir vetores virais recombinantes para miRNA superexpressão e nocaute. Uma esponja let-7 foi projetada de acordo com os métodos anteriormente descritos, 15. Para derrubar os genes alvo em larvas, nós projetamos miRNA artificial específico (amiRNA) ou sequências de RNA (shRNA) gancho de cabelo curto usando software online 16 ,, 17; para servir como um exemplo, a subunidade V-ATPase um mRNA (não de adesão. AY864912) foi selecionado como um gene alvo neste estudo. O amiRNA será referido como amiVTP agora em diante. Todos os detalhes de sequências de pre-miRNA, esponja, amiRNA e shRNA são descritos no quadro suplementar 1.

  1. Ordenar a síntese química de sequências de cDNA completos do precursor miRNAs, miRNA esponjas e shRNA com Xba eu locais da limitação em ambas as extremidades de um fabricante de DNA.
  2. Depois de receber o DNA ordenado, rotação dos tubos contendo blocos de DNA em 10.000-14.000 x g por 1 min garantir que tudo seco DNA é na parte inferior do tubo.
  3. Resuspenda o DNA secado em água livre de DNase para atingir uma concentração final de 10 ng / µ l.
  4. Digerir a espinha dorsal do plasmídeo e DNA sequências com Xba eu a 37 ° C, durante 1 h e em seguida dephosphorylate a 5 ' extremidades da coluna vertebral do plasmídeo linear com bezerro intestinal fosfatase alcalina (CIAP) de acordo com o fabricante ' protocolo s .
  5. Inativar CIAP por aquecimento durante 60 minutos a 65 ° C.
  6. Executar um gel de agarose 1,0% e cortar a espinha dorsal linear. Em seguida, extrair o DNA da fatia gel usando um kit de extração de gel após o fabricante ' instruções de s.
  7. Ligam o fragmento de DNA para o backboneby T4 DNA ligase (5 U / µ l) a 22 ° C, durante 1 h.
  8. Transformar os produtos da reação da ligadura de células passo 2.7 em competentes de Escherichia coli (e. coli) e placa em uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).
    1. Executar a transformação através de um choque de calor método 18 e uso o apropriado Escherichia coli cepa. Por exemplo, usar a estirpe de e. coli DH5α para transformação de choque do calor.
  9. Escolher uma única colônia de passo 2.8 e incubá-los numa cultura de 3 mL enriquecido média contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).
  10. Extrair o ADN do plasmídeo de cultura bacteriana, usando um kit de mini-preparação seguindo o fabricante ' instruções s. Enviar a amostra para uma empresa de sequenciamento de DNA.
    Nota: Para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências de codificação miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre os dois Xba eu sites. Todas as construções de expressão ou esponja miRNA devem ser menores do que 400 bp (10% do comprimento do genoma viral), devido ao limite de empacotamento dos vírus 19.

3. Gerando um rAeaDV construção clonando uma miRNA ou shRNA Cassette de expressão em um Backbone de plasmídeo

Nota: pUCA, um clone infeccioso consistindo de um plasmídeo pUCA contendo o genoma de AaeDV (3.981 nt) 19, foi gentilmente cedido pelo Prof Jonathan Carlson e tem sido descrita anteriormente em detalhe 11. p7NS1-DsRed expressa uma proteína não-estruturais 1 (NS1)-proteína de fusão da proteína fluorescente vermelha (DsRed) o promotor p7 e tem sido descrito em detalhe em outro lugar 14. Um precursor de humanos específicos miR-941-1 20 e sua esponja, um shRNA mexido (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), também subcloned AaeDV como controlo negativo.

  1. Ligate a pre-miRNA, esponja, shRNA ou uma gaveta de expressão amiVTP para o Hpa eu site da região AaeDV NS1-codificação na espinha dorsal do plasmídeo pUCA conforme descrito na etapa de protocolo 2.4 para 2.7.
  2. Transformar o DNA em Stbl3 competentes de Escherichia coli células e selecione um clone positivo conforme descrito na etapa 2.8 a 2.10.
  3. Seguindo isso, extrair o plasmídeo rAaeDV de células bacterianas usando um kit de preparação maxi seguindo o fabricante ' instruções de s.
    Nota: Células Stbl3 ou Stbl4 e. coli devem ser utilizadas para transformação de DNA rAaeDV para minimizar indesejada recombinação ITR. Uma preparação maxi deve ser usada para extrair o plasmídeo rAaeDV para obter uma grande quantidade de DNA (> 100 µ g). Antes de gerar o vírus, a integridade da sequência do plasmídeo rAaeDV sempre deve ser analisada por sequenciamento de DNA 21.

4. Transfecting células C6/36 com plasmídeos de rAaeDV

  1. cultura C6/36 células em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio de 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina em uma incubadora de 28 ° C.
  2. No dia 0, as células em dez frascos de cultura de 2 25 cm da placa 18-20 h antes do transfection dividindo 90-95% confluentes em uma diluição de 1:2.
    Nota: Por dia 1, as células devem chegar a confluência de 90-95%.
  3. No dia 1, transfect as células com a série de rAaeDV plasmídeos 22.
    1. Diluir 10 µ g/ml DNA 600 µ l de meio RPMI-1640 em um tubo de microcentrifugadora e misture delicadamente. Enquanto isso, preparar 600 µ l de meio RPMI-1640 e 25 µ l de reagente de transfeccao por transfecção.
    2. Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, adicione 625 µ l da mistura reagente de Transfeccao de 1640 à mistura de DNA de plasmídeo-1640.
    3. Incubar esta mistura durante 20-30 min à RT Antes de transfeccao, lave as células duas vezes com 2 mL de meio RPMI-1640.
    4. Incubação após o RT (passo 4.3.3), adicione the1640-transfecção reagente DNA plasmídeo mistura no balão de cultura 25 cm 2 e incubar durante 6 h a 28 ° C.
    5. Em aproximadamente 6 h pós-do transfection, remover a mídia de transfeccao, lavar as células duas vezes com 5 mL de meio RPMI-1640 e em seguida, adicione o meio RPMI-1640 com 10% FBS.
      Nota: rAaeDV mostra altas taxas de infecção (95%) em Ae. albopictus larvas; no entanto, em nossa experiência, em quase 50% de larvas infectadas, a infecção era restrita aos locais de infecção primária (por exemplo, células de cerdas e papila anal) sem divulgação 23. Portanto, se há uma necessidade de infectar as larvas em vários tecidos, um defeituoso vírus recombinante expressando a proteína fluorescente deve ser co-infectados para permitir a visualização dos locais de infecção. Por exemplo, para produzir defeituoso vírus recombinante expressando DsRed, p7NS1-DsRed deve ser co transfectada com um plasmídeo ajudante em células C6/36, de acordo com o procedimento descrito acima (a relação de concentração de cotransfection deve ser de 2:1).

5. Colheita rAaeDV Virions de Transfected C6/36 células

  1. colher as células 5 dias depois do transfection. Desalojar e suspender as células nos pratos por um conta-gotas de vidro de 5 mL, Pipetar para cima e para baixo com o meio de cultura. Transferir todas as suspensões celulares para tubos estéreis de 15 mL.
  2. Congelar a-80 ° C ou em um banho de gelo seco (etanol) por 30 min e depois descongelar em 37 ° C. Vortex para 1 min. repetir o procedimento de congelamento e descongelamento vezes 3.
  3. Centrifugar a amostra a 4.800 x g por 20 min em 4 °C.Collect o sobrenadante e descartar a pelota. Em seguida, passe o sobrenadante através de um filtro de seringa descartável 0,22 µm. Alíquota e loja o vírion final purificado estoques no -80 ° C.
    Nota: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

6. Quantificar rAaeDV

  1. preparar o DNA padrões. Linearizar todo rAaeDV plasmídeos com Hpa e purificar os produtos digeridos com um gel de extração kit 24.
  2. Construir a curva padrão quantitativa absoluta e medir do título do vírus de acordo com os métodos anteriormente descritos 25.

7. Transdução de mosquito

  1. lavagem 100 1 st ínstar Ae. albopictus as larvas três vezes usando água deionizada água e em seguida, transferir as larvas em um béquer contendo 95 mL de água desionizada. Adicionar 5 mL de rAaeDV ações (concentração final de 1,00 x 10 10 cópias/mL).
  2. Incubar por 24 h a 28 ° C, lavar as larvas três vezes usando água deionizada e depois transferir as larvas para as placas e alimentar regularmente.
  3. Monitorar o nível de expressão do gene alvo em larvas com qPCR ou Western blot (representante resultados são mostrados nas figuras 3 e 4).
    Nota: O método de deteção do sinal de fluorescência pode ser usado para isolar as larvas infectadas, mais precisamente. Por exemplo, para detectar sinais fluorescentes de larvas infectadas com vírus recombinante expressando DsRed, as larvas podem ser colocadas em um slide de concavidade e observadas sob um microscópio de fluorescência invertido cada 8 h até pós-infecção 2 dias. Uma vez que as larvas fluorescentes são detectadas, eles devem ser separados em copos de plástico de teste individual para permitir a observação contínua subsequente. Larvas com vários tecidos infectados podem ser identificadas usando esse método.

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Resultados

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Estratégias para a construção de rAaeDV
Um vetor de rAaeDV com defeito foi gerado para expressar o gene DsRed em larvas do mosquito. O plasmídeo resultante continha uma gaveta de proteína NS1-DsRed fusão com a proteína VP eliminada (Figura 1A). rAaeDV plasmídeos contendo a expressão construções para miRNA, amiRNA, Plasmideo e miRNA esponja foram projetados (mostrado na Figura 1B

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Discussão

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É importante superar dois das principais barreiras que limitam a construção rAaeDV. O primeiro é a produção de vírus recombinantes com defeito. Tem sido relatado que o MDV pode ser usado como um vetor para expressar apropriadamente dimensionada genes estrangeiros, tais como neurotoxins20 de inseto específico de escorpião e a proteína GFP; no entanto, independentemente da estratégia de construção, uma vez que as ORFs do MDV são inserido ou substituído com genes exógenos, virions não podem formar independentemente a menos ...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem o apoio financeiro da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1200500 de Chen Xiao Guang), Nacional Natural Science Foundation da China (81672054 e 81371846), a equipe de investigação do Natural Fundação de ciência de Guangdong (2014A030312016) e o programa científico e tecnológico de Guangzhou (201508020263). Reconhecemos com gratidão Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) para gentilmente fornecendo os plasmideos pUCA e p7NS1-GFP e ler criticamente este manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Máquina centrífugaThermo Scientific75004260
Sistema de CentrífugaBeckman Coulter363118
Kit de Extração de Gel GeneJETThermo ScientificK0691
E.Z.N.A. Kit Midi de PlasmídeoOmega BiotechD6904
Ágar PurificadoOXOIDLP0028A
Fosfatase alcalina termossensível FastAP (1 U/µ L)Thermo ScientificEF0651
FastDigest HpaIThermo ScientificFD1034
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µ L)Thermo ScientificEL0011
TransStbl3 Célula Quimicamente CompetenteBeijing Transgen BiotechCD521-01
Ampicilina Pequim Tiangen BiotechRT501
Proteinase KPromegaMC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Verde)Pequim Tiangen BiotechFP205

Referências

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