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Artigo de método

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

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DOI:

10.3791/56124

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14 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

Resumo

Os mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia estão sendo utilizados em programas para controlar a propagação de arbovírus como dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-mosquitos infectados podem ser lançados no campo também reduzir tamanhos de população através de acasalamentos incompatíveis ou transformar as populações com mosquitos que são refratários a transmissão do vírus. Para estas estratégias ter sucesso, os mosquitos liberados no campo do laboratório devem ser do competidor com mosquitos nativos. No entanto, manter os mosquitos no laboratório pode resultar em endogamia, deriva genética e adaptação de laboratório que pode reduzir sua aptidão no campo e pode confundir os resultados de experimentos. Para testar a adequação de diferentes infecções Wolbachia para implantação no campo, é necessário manter os mosquitos em um ambiente de laboratório controlado através de várias gerações. Descreveremos um protocolo simples para manter mosquitos Ae. aegypti em laboratório, que é apropriado para ambos Wolbachia-mosquitos infectados e selvagem-tipo. Os métodos de minimizar a adaptação de laboratório e implementam cruzamento para aumentar a relevância das experiências para mosquitos de campo. Além disso, colônias são mantidas em condições óptimas para maximizar a sua aptidão para lançamentos de campo aberto.

Introdução

Os mosquitos Aedes aegypti são responsáveis pela transmissão de algumas dos arbovírus mais importantes do mundo, incluindo a dengue, Zika e chikungunya1. Estes vírus estão se tornando uma ameaça crescente à saúde global, como a distribuição generalizada do Ae. aegypti nos trópicos continua a expandir a2,3,4. Feminino Ae. aegypti preferencialmente se alimentam de sangue humano5 e, portanto, tendem a viver em estreita proximidade com os seres humanos, particularmente em áreas urbanas, onde as populações são mais densas. Através desta associação estreita com os humanos eles também se adaptaram para procriar em habitats artificiais, incluindo pneus, vasos, calhas e tanques de água6,7. Ae. aegypti também facilmente adaptar-se a ambientes de laboratório, onde eles podem ser mantidos sem quaisquer requisitos especiais após ser coletado diretamente do campo, ao contrário de algumas outras espécies do género Aedes 8, 9,10. Sua facilidade de manutenção tem visto amplamente estudados no laboratório em uma ampla gama de campos, em última análise, com o objetivo de controlar os mosquitos de doenças pode transmitir.

Tradicionalmente, o controle arboviral confia pesadamente sobre o uso de inseticidas para reduzir populações do mosquito. No entanto, há um crescente interesse em abordagens onde os mosquitos modificados são criados em laboratório e em seguida lançados em populações naturais. Os mosquitos liberados podem ser modificados geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, através de irradiação16, tratamento químico de17,18, ou para o conjunto de técnicas19 para suprimir as populações de mosquitos ou substituí-los por mosquitos que são refratários a transmissão arboviral20.

Wolbachia são bactérias que estão atualmente sendo usadas como um agente de controle biológico para arbovírus. Várias cepas de Wolbachia foram recentemente introduzidas Ae. aegypti experimentalmente utilizando microinjeção embrionárias21,22,23,24. Estas cepas reduzem a capacidade dos arbovírus para divulgar e replicar no mosquito, diminuindo sua transmissão potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecções são transmitidas da mãe à prole, no entanto certas estirpes induzem esterilidade quando machos infectados acasalam com as fêmeas não infectadas22. Wolbachia-machos infectados, portanto, podem ser liberados em grandes quantidades para suprimir as populações naturais de mosquitos, como recentemente demonstradas em outras espécies de Aedes 15,29. No entanto, desde que a Wolbachia também inibir a transmissão arboviral em Ae. aegypti, mosquitos também podem ser liberados para substituir as populações nativas com vetores mais pobres. Ae. aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia agora estão sendo liberados para o campo em vários países que utilizam esta última abordagem14,30,31.

Wolbachia-abordagens com base para controle arboviral dependem de uma sólida compreensão das interacções entre Wolbachia, o mosquito e o ambiente. Wolbachia ocorrem naturalmente em uma ampla variedade de insetos, e as cepas introduzidas os mosquitos são diversas em seus efeitos,32. Como novos tipos de infecção de Wolbachia sejam introduzidos Ae. aegypti24, é necessário caracterizar cada estirpe para seus efeitos sobre a aptidão do mosquito, a reprodução e a interferência arboviral sob uma variedade de condições. Rigorosa experimentação em laboratório, portanto, é necessário para avaliar o potencial de Wolbachia cepas suceder no campo.

Lançamentos de campo aberto do Ae. aegypti com Wolbachia infecções muitas vezes podem exigir milhares a dezenas de milhares de mosquitos por zona de lançamento a ser criados a cada semana14,30,31. O sucesso dos lançamentos iniciais pode ser melhorado através da libertação de mosquitos de um tamanho grande para maximizar sua fecundidade33 e acasalamento sucesso34,35. Os mosquitos também devem ser adaptados às condições que eles experimentarão no campo, criação de laboratório no entanto a longo prazo pode causar alterações no comportamento e fisiologia, o que poderia afetar o campo desempenho36,37,, 38.

Descreveremos um protocolo simples para a criação de Ae. aegypti em laboratório usando equipamento básico. Este protocolo é apropriado para ambos selvagem-tipo e Wolbachia-infectadas de mosquitos, o último dos quais pode exigir atenção especial como algumas cepas de Wolbachia têm efeitos significativos no mosquito-história de vida características39, 40. as condições de criação evitar superlotação e competição por comida produzir mosquitos de um tamanho consistente, que é fundamental para a competência de vetor e experimentos de aptidão e garante que os mosquitos são saudáveis para a liberação do campo41 . Também tomamos precauções para minimizar a adaptação de laboratório e endogamia, reduzindo as pressões selectivas e garantindo que a próxima geração é amostrado de uma grande piscina aleatória. No entanto, ambientes de laboratório são distintamente diferentes das condições de campo, e manutenção a longo prazo sob condições relaxadas poderia reduzir a aptidão dos mosquitos após a liberação para o campo37,42,43 . Portanto, atravessamos fêmeas das linhas de laboratório para coleta de campo machos periodicamente, resultando em colônias que são geneticamente semelhantes para comparações experimentais e que são adaptados para o campo de destino população39. Os métodos não exigem qualquer equipamento especializado e podem ser ampliados para trás dezenas de milhares de indivíduos por semana para lançamentos de campo. O protocolo também prioriza a adequação de mosquitos dentro e através das gerações, uma consideração importante para destinado a estabelecimento em populações naturais de insetos. O protocolo é apropriado para a maioria dos laboratórios que requerem manutenção de Ae. aegypti, particularmente para comparações experimentais onde uma qualidade consistente de mosquitos e relatability para o campo são importantes.

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Protocolo

Sangue se alimentando de mosquitos em seres humanos foi aprovado pela Universidade de Melbourne Comitê de ética humana (aprovação #: 0723847). Todos os voluntários prestados informaram consentimento por escrito.

1. larval de criação

Nota: Os mosquitos são realizados em 26 ± 0,5 ° C e 50-70% umidade relativa, com um fotoperíodo de h (luz: escuro) 12:12 por este protocolo de manutenção de colônia. Estas condições são semelhantes às condições climáticas médias em Cairns, na Austrália e o intervalo térmico ideal para Ae. aegypti sobrevivência e desenvolvimento44,,45,46. Temperaturas elevadas podem resultar na perda de Wolbachia infecções das colônias de mosquito e devem ser evitada,47. Nós mantemos pelo menos 500 indivíduos por população para minimizar a consanguinidade; manutenção de colônias de tamanho menor pode ter consequências de aptidão [Ross et al não publicado]. Sob essas condições e assumindo uma nutrição adequada, o tempo de geração média é de 28 dias (ver tabela 1).

  1. Mergulhe os ovos no substrato em bandejas (figura 1A), que contém 3 L de água (água de osmose reversa ou água da torneira envelhecido, gerada, deixando a água da torneira em bandejas para 24 h antes da sua utilização), ~ 300 mg de comida de peixe (um esmagado da tabuleta, consulte Tabela de materiais) e um alguns grãos de fermento seco ativo para induzir a incubação de48.
  2. Um dia após a eclosão, use uma pipeta de vidro para transferir aproximadamente 500 larvas para bandejas contendo 4 L de água (figura 1B), conta usando um contador de controle remoto. Adicione dois comprimidos de comida de peixe moído para cada bandeja. Se necessário, use recipientes de tamanhos diferentes para a criação de larvas (figura 1A), mas manter a densidade larval abaixo de 0,5 larvas/mL para evitar superlotação.
  3. Verifique as bandejas diariamente para garantir que as larvas têm comida suficiente; Adicione aproximadamente dois comprimidos de comida para as bandejas em dois dias. Fornecer alimentação ad libitum , mas certifique-se que 0,5 mg/larva/dia está disponível durante este período para garantir o desenvolvimento é síncrono e tamanho de corpo é consistente, caso contrário os resultados dos experimentos podem ser confundidos (ver resultados de representante).
  4. Tome cuidado para evitar a superalimentação de larvas, particularmente em recipientes menores criação com menos água, volume e área de superfície. Se a água parece nublada ou se houver significativa mortalidade larval, substituí-lo com água fresca; mortalidade deve ser insignificante se larvas são alimentadas de forma otimizada.

2. adulto surgimento

Nota: As larvas começará a empupar de cinco dias após a eclosão, se bem alimentados e a maioria deve pupate por sete dias após a eclosão. Adultos começará emergentes aproximadamente dois dias após a pupação se otimamente a 26 ° C (ver Resultados de representante). Desenvolvimento larval é normalmente afetado pela Wolbachia infecções quando amplo alimento é fornecido23,39,49.

  1. Sete dias após a eclosão despeje todo o conteúdo da bandeja através de uma malha fina (tamanho de poro 0,4 mm). Manter a água filtrada larval para uso posterior em ovicups (consulte a seção "Sangue alimentação e oviposição"). Inverter a malha e mergulhá-lo em um recipiente plástico com 200 mL de água para transferir as pupas. Fornece alimento adicional se qualquer larvas permanecem.
  2. Prepare as gaiolas de emergência de adultos (Figura 1) fornecendo dois copos de solução de sacarose 10% (Figura 1F) e duas xícaras de algodão úmido para evitar a dessecação (Figura 1E).
  3. Se as pupas não precisa ser classificados por sexo, coloque os recipientes extraível de pupas na gaiola e deixe a tampa entreaberta para permitir que os adultos a emergir dentro da jaula. Como alternativa, coloque um funil invertido sobre o recipiente para minimizar a afogar-se. Certifique-se de todos os adultos têm surgido antes de retirar o recipiente da gaiola para evitar selecionando contra desenvolvedores lentos.

3. pupa sexagem para cruzamento

  1. Se as pupas precisam ser classificados por sexo (por exemplo, para o cruzamento), pipetar as pupas de bandejas larvas e separar os sexos (Figura 2) em recipientes de plástico (figura 1A) com 200 mL de água cada 24h até o número desejado de cada sexo. foi alcançado. Coloque as tampas nos recipientes e deixá-los fechados.
  2. Adultos vão surgir nas gavetas; Confirme o seu sexo antes de liberar em gaiolas (Figura 2). Remova qualquer adultos sexados incorretamente com um aspirador dentro de 24 h de emergência antes de atingirem a maturidade sexual. Uma vez confirmados os sexos, solte os adultos em gaiolas cada 24 h.
  3. Para obter a Wolbachia-colônias infectadas de um fundo genético similar a uma população natural, outcross adicionando Wolbachia-infectados fêmeas de colônias de laboratório para gaiolas de machos não infectados derivados de ovos recolhidos por Leishmania em o campo39, mantendo a densidade prescrita de 500 indivíduos por população.
    1. Repeti o cruzamento há pelo menos três gerações consecutivas produzir colônias que estão pelo menos 87,5% geneticamente semelhante a população de campo39. Crítica: Certifique-se de que os sexos estão corretos nesta fase (ver passo 3.1).
  4. Feminino Ae. aegypti são geralmente refratários a inseminação mais horas de acasalamento50. Quando o cruzamento de colônias, permitir que as fêmeas e machos amadurecer em gaiolas separadas por dois dias e depois Aspire as fêmeas para a gaiola do macho fornecer uma oportunidade igual para todos os homens.

4. sangue alimentação e oviposição

  1. Espere pelo menos três dias após a última fêmea surgiu antes sangue alimentando para permitir tempo suficiente amadurecer. As fêmeas de alimentação de sangue dentro de duas semanas de emergência para evitar a mortalidade excessiva, particularmente para os mosquitos com Wolbachia infecções que afectam negativamente a longevidade22,24,49. Remova as xícaras de açúcar o dia antes da alimentação para melhorar as taxas de alimentação.
    1. Pedir um voluntário para inserir a gaiola para permitir que os mosquitos fêmeas alimentar seu antebraço. A maioria das fêmeas devem alimentar para repletion dentro de 5 min, mas para reduzir a seleção contra alimentadores lentas, deixe o antebraço na gaiola por 15 min, ou até que todas as fêmeas são visivelmente ingurgitadas; uma luva de látex para proteger a mão de mordidas é opcional mas recomendado.
    2. Dois dias após a alimentação de sangue, coloque dois copos de plástico contendo água criação larval e revestidas com uma fita de lixa (Figura 1) (ou papel de filtro (Figura 1 H)) dentro da gaiola para as fêmeas que põem ovos. Parcialmente, mergulhe a tira de lixa na água para mantê-lo úmido. Remova outras fontes de água para evitar que as fêmeas botando seus ovos fora da Copa de oviposição.
      Nota: água da torneira pode ser usado nos copos, mas incentiva a criação de larvas de água oviposição51,52 e fêmeas colocarão seus ovos mais sincronicamente.

5. ovo coleção e condicionamento

  1. As fêmeas colocarão ovos sobre a lixa apenas acima da linha de água; recolher e substituir as tiras de lixa diariamente até que não mais ovos. Observe que a oviposição pode continuar por mais uma semana.
  2. Tiras de lixa parcialmente seco borrando-los delicadamente sobre uma toalha de papel por 30 s, tomando cuidado para não deslocar os ovos. Em seguida, enrole as tiras em uma folha de toalha de papel seca e coloque-o em um saco plástico vedável (Figura 1I).
  3. Verifique o estado dos ovos sob um microscópio dissecação (Figura 3). Se a folha de lixa tiras são muito molhada, os ovos podem eclodir antes de ser submerso em água (Figura 3B), mas se secado muito duramente, ovos podem entrar em colapso (Figura 3).
  4. Os ovos podem ser incubados a qualquer momento, além da coleção pós três dias; pôr todos os ovos em cada colônia, coletados através de todos os dias, no mesmo recipiente de água para garantir que a próxima geração é amostrada de uma grande piscina aleatória de indivíduos.
  5. Para armazenamento a longo prazo, mantenha os ovos em um recipiente selado em uma umidade alta (> 80%) a cerca de 20 ° C. Nestas condições, os ovos sem Wolbachia podem ser armazenados por vários meses, mantendo a escotilha altas taxas53,54.
  6. Como algumas infecções Wolbachia reduzem a viabilidade dos ovos com idade49,55, chocar os ovos de Wolbachia-infectados linhas dentro de uma semana de coleta para evitar mortalidade excessiva para o relevante estirpes. Sangue alimenta as fêmeas novamente depois de uma semana, se são necessários mais ovos.
DiaPasso
0Ovos de escotilha
1Contagem de larvas em bandejas
7Transferência de larvas e pupas para gaiolas de colônia
17Sangue alimenta adultos femininos
21Começar a coleta de ovos
25Terminar a coleta de ovos
28Ovos de escotilha

Tabela 1: Visão geral do programa de manutenção de colônia Ae. aegypti em 26 ° C. O momento da sangue feminina-alimentação e a eclosão dos ovos é flexível, mas longas durações nestas fases devem ser evitadas, particularmente para os mosquitos infectados com Wolbachia, a fim de minimizar a mortalidade. Seguindo esta agenda minimiza seleção contra mosquitos que são rápidos ou lentos para desenvolver ou amadurecem em todas as fases da vida, desde que as larvas são alimentadas de forma otimizada.

figure-protocol-1
Figura 1: Equipamento utilizado para a criação de Ae. aegypti em laboratório. Recipientes de plástico (A) usados para ovos para incubação ou criação de larvas com volumes de 500, 750 e 5.000 mL (da esquerda para a direita). (B) bandejas utilizadas para a criação de larvas em uma densidade controlada, geralmente 500 larvas 4 litros de água. (C) 19,7 L e (D) L 3 gaiolas utilizadas para adultos de habitação. Uma densidade de 25 adultos ou menos por litro deve ser mantido para proporcionar espaço suficiente. (E) 35 mL do copo com lã de algodão úmido fornecido como uma fonte de água para adultos. (F) 35 mL do copo com solução de sacarose fornecida através de um cabo ou pavio dental como uma fonte de açúcar. (G–H) Copos cheios de água criação larval e forrado com um substrato de oviposição de lixa ou papel de filtro (G e H, respectivamente). (eu) Zip-lock saco usado para armazenamento de tiras de lixa ou papel de filtro. Manchas pretas na lixa são os ovos do mosquito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Lateral (A) e dorsal (B) vista de pupas e adultos Ae. aegypti (C) demonstrando seu dimorfismo sexual. Os machos estão posicionados à esquerda e as fêmeas à direita de cada painel. Quando otimamente alimentados, pupas masculinas e femininas distinguem-se pelo tamanho; as fêmeas são maiores que os machos (A) e tem um cefalotórax relativamente bulbosa, em comparação com os machos que têm partes planas (B). Adultos do sexo masculino são facilmente distinguidos das fêmeas sob todas as condições de criação, principalmente pelos seus plumose antenas e palpos longos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3. Quatro dias de idade Ae. aegypti ovos sob diferentes condições. (A) Intact ovos em tiras de lixa, mantidas em uma umidade alta (> 80%), mas sem qualquer umidade visível. Taxas de hachura devem ser acima de 90% para o selvagem-tipo Ae. aegypti se mantida corretamente. (B) ovos que eclodem antes de ser submerso em água (incubação precoce) distinguem-se por uma tampa isolada de ovo e larva visível. Isso indica que a tira de lixa foi mantida muito úmida. (C) ovos que são secas muito duramente podem entrar em colapso e são claramente visíveis pela aparência côncava. Se a folha de lixa torna-se duro também indica que os ovos podem ser muito secos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A Figura 4 demonstra os efeitos da nutrição de qualidade inferior no desenvolvimento de larvas de Ae. aegypti . Quando recipientes são fornecidos com 0,25 mg de alimento por larvas por dia ou menos, o tempo de desenvolvimento aumenta para machos e fêmeas, e é menos síncrona do que em recipientes munida de 0,5 mg de comida. Se não for fornecida para uma alimentação adequada durante toda a duração do desenvolvimento larval, isto poderia ter um impacto ...

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Discussão

Seguindo o protocolo aqui apresentado para a manutenção de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deverão assegurar que mosquitos saudáveis de uma qualidade consistente são produzidos para experimentos e abrir campo de lançamentos. Em contraste com outros protocolos que priorizem a produção de grandes quantidades de mosquitos (ver referência57), os métodos estão focados em maximizar sua aptidão, tanto dentro de gerações implementando relaxadas condições de criação e do outro lado geraç...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Reconhecemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig por suas contribuições para o desenvolvimento dos nossos métodos de manutenção de colônia e três revisores anônimos pelas suas sugestões que ajudaram a melhorar o manuscrito. Nossa pesquisa é suportada por um programa grant e comunhão para AAH do saúde nacional e Conselho de pesquisa médica e uma tradução concedem partir Wellcome Trust. PAR é um destinatário de um bolsa de programa de treinamento de investigação australiano governo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tipo selvagem Aedes aegyptiColetado de locais de campo em Queensland, Austrália, consulte Yeap e outros39 para detalhes
w Aedes aegyptiFornecido pela Monash University. Consulte Walker e outros23 para obter informações sobre a cepa
w infectada com AlbB Aedes aegyptiFornecido pela Monash University. Consulte Xi e outros21 para obter informações sobre a cepa
w infectada por MelPop Aedes aegyptiFornecido pela Monash University. Consulte McMeniman e outros22 para obter informações sobre a cepa
Levedura seca instantâneaLowanEstimula a eclosão dos ovos. Encontrado em supermercados em geral. Outras marcas podem ser usadas
Banheira de plástico de 5 LQuadrantQ110950Usado para incubação e criação de larvas. Outros produtos podem ser usados
Ração para peixes (Tetramin Tropical Tablets)Tetra16152Fornecido às larvas como fonte de alimento. Endereço do sítio Web: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
RecipientesUtilizados para a criação de larvas. Qualquer recipiente de plástico acima de 500 mL deve ser adequado
PipetaUsado para transferir larvas e pupas entre recipientes. Endereço do site: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Contador ClickerRS Pro710-5212Utilizado para auxiliar na contagem de larvas, pupas e ovos. Endereço do sítio Web: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Bandejas de criaçãoGratnellsUtilizado para a criação de larvas. Endereço da Web: http://www.gratnells.com
MalhaUsado para transferir larvas e pupas para recipientes de água doce. Outras marcas podem ser usadas. Endereço da web: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
CagesBugDormDP1000Abriga mosquitos adultos. Produtos alternativos podem ser usados. Endereço da Web: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
copo de plástico de 35 mLHuhtamakiAA272225Usado para fornecer água ou sacarose a mosquitos adultos. Outras marcas podem ser usadas
Tampa de copo de plástico de 35 mLHuhtamakiGB030005Usado para fornecer sacarose a mosquitos adultos. Outras marcas podem ser usadas
AlgodãoCutisoft71841-13O algodão úmido é fornecido como fonte de água para adultos. Outras marcas podem ser usadas
AçúcarFornecido como fonte de açúcar para mosquitos adultos. Encontrado em supermercados em geral
RopeM Recht AccessoriesC323C/WUsado para fornecer solução de sacarose para adultos. Outras marcas podem ser usadas. Endereço da Web: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Copo de plástico (grande)Usado como recipiente de oviposição. Qualquer copo de plástico que contenha 100 mL de água deve ser adequado
LixaNorton Master PaintersCE015962Fornecido como substrato de oviposição. Produtos alternativos podem ser usados, mas usamos esta marca porque é relativamente inodora. Cores mais claras são usadas para contraste com ovos. Endereço do site: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Papel de filtroWhatman1001-150Usado como substrato alternativo de oviposição. Outras marcas podem ser usadas
Luvas de látexSemperGuardZ560979Previne picadas de mosquito nas mãos durante a alimentação de sangue. Outras marcas podem ser usadas. Endereço do sítio Web: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/
de plástico de vidro de nylon Branco

Referências

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