Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.
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Artigo de método
Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar
Neste artigo
Resumo
Resumo
A degeneração dos neurônios ocorre durante o desenvolvimento normal e em resposta a lesões, estresse e doença. As características celulares da degeneração neuronal são notavelmente semelhantes em humanos e invertebrados, assim como os mecanismos moleculares que conduzem esses processos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster , fornece um organismo modelo genético poderoso e simples para estudar as complexidades celulares das doenças neurodegenerativas. Na verdade, aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila e uma infinidade de ferramentas e ensaios foram descritos usando moscas para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Mais especificamente, a junção neuromuscular (NMJ) em Drosophila provou ser um sistema eficaz para estudar doenças neuromusculares devido à capacidade de analisar as conexões estruturais entre o neurônio e o músculo. Aqui, relatamos um teste de lesão do neurônio motor in vivo em Drosophila , queInduz de forma reprodutiva neurodegeneração no NMJ por 24 h. Usando essa metodologia, descrevemos uma seqüência temporal de eventos celulares resultando em degeneração de neurônio motor. O método de lesão tem diversas aplicações e também foi utilizado para identificar genes específicos necessários para a neurodegeneração e para dissecar as respostas transcricionais à lesão neuronal.
Introdução
A degeneração neuronal ocorre durante o desenvolvimento normal e pode ser causada pelo processo de envelhecimento natural, lesão, estresse ou estados de doença. Drosophila melanogaster , a mosca comum da fruta, fornece um organismo modelo simples e poderoso para estudar a neurodegeneração devido às semelhanças notáveis nos mecanismos moleculares que conduzem à degeneração dos neurônios. Essas semelhanças são destacadas pelo fato de que aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila . 1 Além disso, vários ensaios e ferramentas tecnológicas para estudar doenças neurodegenerativas h....
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Protocolo
1. Preparação de Reagentes e Equipamento
- Prepare 1x tampão de dissecção (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,02, MgCl2 20 mM, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de sacarose, trealose a 5 mM, HEPES a 5 mM; pH 7,2).
- Prepare 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
- Prepare 1x PBT usando 1x PBS com Triton X-100 a 0,01%.
- Prepare placas de agar de suco de frutas. 14 Em resumo, misture 30 g de agar em 700 mL de H 2 O e autoclave. Dissolver 0,5 g de metilparabeno em 10 mL de etanol e adicionar solução a 300 mL de concentrado de suco de fruta (uva ou maçã). Misture o concentrado na soluç....
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Resultados
Usando o procedimento apresentado aqui, demonstramos que a lesão neuronal mecânica permite a dissecção temporal de eventos neurodegenerativos. 14 , 18 A sequência de eventos foi previamente caracterizada e começa com uma ruptura imediata do citoesqueleto, seguida de defeitos de tráfico axonais, acumulação de proteínas ubiquitinadas e posterior neurodegeneração 24 h pós-lesão. Antes da lesão, WT NMJ mostra o marcador de zona activ.......
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Discussão
A lesão mecânica neuronal descrita anteriormente e demonstrada aqui pode ser utilizada para induzir lesão / estresse nos nervos segmentares das larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental tem sido empregada anteriormente para dissecar a seqüência temporal de eventos que conduzem à neurodegeneração, bem como para examinar as alterações transcricionais nos corpos cel.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Keller e Magie Labs na Quinnipiac University por sugestões úteis. Em particular, gostaríamos de agradecer Barron L. Lincoln II pelo desenvolvimento deste ensaio de lesões no Keller Lab. Também gostaríamos de agradecer a Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid concedida à LC Keller.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tesoura de microdissecação | Ferramentas de Belas Ciências | 15000-08 | |
| Dumont #3 Fórceps | Ferramentas de Ciências Finas | 11231-30 | Algumas pessoas preferem o tamanho 3, enquanto outras preferem o tamanho 5 |
| Dumont #5 Fórceps | Ferramentas de Ciências Finas | 11251-30 | Algumas pessoas preferem o tamanho 3, enquanto outras preferem o tamanho 5 |
| CO2 Tanque de Ar Tech | Air | UN 1013 | Vários tamanhos de tanques podem ser adquiridos |
| CO2 Aparelho | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Pinos de aço inoxidável, tamanho 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Elastômero de silicone, base e agente de cura | Dow Corning | 3097358-1004 | Para derramar placas de dissecação |
| de Bouin | Sigma | HT 10132-1L | Os anticorpos devem ser testados quanto à sua eficiência em Bouin e PFA |
| 4% Paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Os anticorpos devem ser testados quanto à sua eficiência em Bouin e PFA |
| Microscópio Estereoscópico de Dissecação | AmScope | SM-1BZ | |
| Fonte de Luz | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anticorpo anti-nc82 | Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma | nc82-s | |
| anti-discos grande anticorpo | Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-peroxidase de rábano | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | Você pode Alexa Fluor® 488, 594 ou 647 |
| Flystuff Suco de Uva Ágar Pré-mistura | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Lâminas de microscópio | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverstiles | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Usado para criar câmara úmida para recuperação larval |
Referências
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
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Reimpressões e permissões
