Artigo de método

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

DOI:

10.3791/56130

⸱

22 de setembro de 2017

 ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado "células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células+ In Vivo." Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas1 as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD42 por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não permitir a detecção da localização espacial das pilhas de T antígeno-específicas para outras células e estruturas nos tecidos e atual técnicas de desagregação para extrair as células T necessários por citometria de fluxo tem limitada eficácia em tecidos não-linfoides3.

Nós e os outros têm desenvolvido métodos usando peptídeo carregado MHC-classe I e classe tetrâmero II ou multimer reagentes para manchar as células CD8 e CD4 T antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estes métodos permitem a determinação do local, abundância e fenótipo de células CD8 e CD4 T antígeno-específicos tecidos e fornecer um meio para detectar dessas células em relação a outras estruturas nos tecidos e células. Nosso grupo tem usado extensivamente MHC-eu tetrâmero coloração para estudar o vírus de imunodeficiência humana (HIV) - e o vírus da imunodeficiência símia (SIV) - células T CD8 específicas nos tecidos linfoides, genitais e retais para obter uma compreensão do HIV e SIV imunopatogênese e para identificar correlações de vacinação bem sucedida estratégias14,15,16,17. Além disso, também desenvolvemos uma técnica que combina o IST com hibridação in situ (ISH) para localizar e quantificar as células T CD8 de vírus específicos e células infectadas por vírus em tecidos e para determinar os níveis de efetor-alvo na vivo 18 , 19.

Aqui, descrevemos um protocolo utilizando peptídeo carregado MHC-eu tetrâmeros manchar as células T CD8 de antígeno-específicas em secções de tecido fresco, para tecidos de corante de contraste usando IHC e quantificar células com fenótipos específicos em compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são os mesmos que foram utilizados em nossa recente publicação por Li et al, em que determinamos a localização, abundância e fenótipo de células T específicas SIV em tecido linfoide durante a infecção crônica do SIV em macacos20.

Para este procedimento, tecidos frescos são seccionados e incubados durante a noite com MHC do peptide-carregado-eu tetrâmeros conjugados a moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Então, eles são fixos em paraformaldeído. Após a fixação do tecido, o sinal de tetrâmeros o MHC é amplificado usando anticorpos de coelho anti-FITC e incubadas com fluorescente etiquetados anticorpos IgG anticoelho que mais amplificam o sinal dos limite tetrâmeros. IHC é usado em conjunto com o IST para caracterizar as células T antígeno-específicas e células circundantes. Anticorpos que reconhecem epitopos na superfície das células ou no espaço extracelular são incluídos na incubação preliminar com os tetrâmeros. Anticorpos que reconhecem epítopos intracelulares exigem permeação da parede celular antes da coloração. As secções de tecido manchado são fotografadas usando um microscópio confocal e analisaram utilizando o software confocal. Pilhas etiquetadas são quantificadas utilizando microscopia confocal software ou ImageJ. O protocolo descrito pode ser usado para manchar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas em qualquer tecido para qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. dia 1: corte de tecido fresco e incubação primário

  1. uso um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,5 cm de altura). Separadamente cada tecido para um êmbolo de cola e incorporá-los com 3-5 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 4% em PBS. Rotule o êmbolo com a informação do tecido usando um adesivo. Colocá-lo em um suporte refrigerado em um balde de gelo para solidificar o.
  2. Ativar o micrótomo e defina a espessura das seções a 200 µm. Instale uma lâmina de barbear o micrótomo e insira o êmbolo montada com tecido no banho de micrótomo.
  3. Preparar o tampão fosfato salino com heparina (PBS-H) adicionando-se 100 µ g/mL ou 18,7 U/mL heparina para PBS para preservar o RNA e para permitir que aplicações potenciais ISH a jusante. Encher a banheira do micrótomo, cobrindo o tecido incorporado, com 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Adicione cubos de gelo de PBS-H para o banho para manter a temperatura em 0 - 2 ° C. Start o micrótomo e corte o tecido em 200 µm seções.
    Nota: É importante manter os tecidos refrigerados no gelo para minimizar a atividade celular nos tecidos e porque o tecido fresco é mais fácil de seção quando é tranquilo. PBS sozinho pode ser usado se não existem planos para jusante ISH.
  4. Como alternativa, para tecidos que não cortadas com um micrótomo (por exemplo, intestino e pulmão), usar um bisturi ou lâmina de barbear para cortar o tecido em tiras finas como perto possível a 200 µm.
  5. Rotular a tampa das placas de cultura de tecidos de 24-bem com a informação da amostra experimental e colocar as câmaras de tecido em poços correspondentes. Use um pincel para transferir as seções para uma câmara de tecido conjunto no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço contendo 1 mL de refrigerados PBS-H.
    Nota: As câmaras de tecido reutilizável devem ser feitas antes de iniciar a coloração. Câmaras de tecido podem ser feitas usando um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo e engranzamento de fio. Use uma lâmina afiada para cortar a parte inferior de um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo. Corte a malha de arame em um círculo para caber o buraco no fundo do tubo. O círculo de malha de arame usando um bico de Bunsen, até ficar em brasa de calor. Definir o círculo de malha de arame para baixo muito rapidamente e empurre o tubo para dentro da malha. Verifique se o engranzamento de fio é firmemente ligado ao fundo do tubo e então cuidadosamente cortar o topo do tubo na marca de 3 mL, usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque até 3 seções de tecido em cada câmara de tecido, ou até 1 cm 2 de tecido por bem. Manter pelo menos um poço vazio entre poços com combinações de anticorpos diferentes para evitar a contaminação cruzada.
  6. Proceder ao primário tetrâmero e anticorpo que mancha imediatamente depois de terminar a transferência de todas as seções cortadas em câmaras de tecidos. Manter as seções submerso e refrigeradas em 1 mL de PBS-H em todos os momentos.
  7. Incubar as seções de tecido durante a noite com 0,5 µ g/mL de conjugado FITC, peptídeo-carregado MHC-eu tetrâmeros diluídos em PBS-H, com 2% de soro de cabra normal (NGS). Incluir o mouse ou outros anticorpos de coelho não dirigidos a epitopos extracelulares de interesse nesta incubação (por exemplo, os anticorpos de anti-CD8 rato diluída a 1: 500 em PBS-H, com 2% NGS). Coloque 1 mL de anticorpos diluídos em cada poço.
    Nota: Tenha cuidado ao selecionar o CD8 anticorpos, como alguns podem realçar e alguns podem inibir tetrâmeros MHC ligação a receptores de células T 4 , 21. O anticorpo de CD8 anti-humano rato descrito aqui é instável e às vezes resulta em coloração um pouco fraco. Ele é usado aqui para etiquetar triplo, porque é o único não-coelho e anticorpos de CD8 sem mouse testaram que as células T CD8 de macaco reso manchada.
  8. Use 1 mL de solução por alvéolo para o anticorpo primário e incubação do subsequentes todas as e realizar isso e todos incubação do subsequente a 4 ° C, com as placas em uma plataforma oscilante.
    Nota: Os tecidos devem flutuar livremente na câmara.

2. Dia 2: Fixação e incubação secundário

  1. após a incubação primária, lavar as seções duas vezes com 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min a cada lavagem. Para fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura de tecido de 24-bem diferente contendo 1 mL de PBS-H refrigerado em poços correspondentes.
    Nota: Tenha cuidado para não pingar o conteúdo de uma amostra experimental em outro quando se deslocam entre as câmaras de tecido. Para todos os subsequentes incubação do e lavagens, da mesma forma transferi a câmara de tecido para um prato limpo, contendo a solução adequada. Certifique-se de monitorar as seções nas câmaras de tecido durante o procedimento para certificar-se de que as seções não ficar preso aos lados das câmaras de tecido. Se eles, empurrá-los de volta para a solução.
  2. Corrigir as seções com 1 mL de fresco tampão PBS paraformaldeído 4% para 2 h à temperatura ambiente (não excessivamente corrigir). Lavagem com PBS-H frio duas vezes por 5 min.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado.
    Nota: Se a recuperação do antígeno e permeabilização é necessária para detectar intracellular epitopes, antígenos podem ser recuperados por ebulição as seções em ureia de mol 0,01 após a fixação do paraformaldehyde.
  3. Transferir as seções em placas de cultura 24-poço contendo ureia de mol 0,01 e colocar estas placas em um forno de microondas. Ferva as seções três vezes por cerca de 10 s cada um, para um total de 30 s.
    Nota: Tenha muito cuidado, como ferver a solução pode forçar as seções fora dos poços. Se isso acontecer, use um pincel de adiar as seções das paredes da câmara de tecido ou da tampa da placa na parte inferior da câmara de tecido apropriado.
  4. Prévio para a incubação do anticorpo secundário, permeabilize e bloquear as secções de tecido incubando-os em solução de bloqueio contendo PBS-H, 0,3% de detergente (PBS-H-T) e 2% NGS sobre um roqueiro para 1 h a 4 ° C. Perform subsequente incubação do anticorpo com NGS PBS-H-T/2%.
  5. Para a incubação secundária, transferir as seções nas câmaras de tecido para poços contendo coelho anti-FITC 1:10,000 de anticorpo diluído em NGS PBS-H-T/2%. Incubar durante uma noite.
  6. Perform counterstaining usando anticorpo anti-CD20 de rato diluído 1: 200 em PBS-H-T/2% NGS. Para essa opção, recuperar os epítopos, se necessário, permeiam as células e bloquear antes esta incubação, conforme descrito acima.

3. Dia 3: Incubação terciária

  1. após a segunda incubação, lavar as seções três vezes em PBS-H a 4 ° C, durante pelo menos 20 min.
  2. Realizar uma incubação final com o apropriado fluorescente etiquetado anticorpos (por exemplo, de cabra anticoelho conjugado amarelo esverdeado, cabra anti-rato conjugados tintura muito vermelha e cabra anti-rato tintura verde conjugado anticorpos diluído 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, respectivamente, em PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante uma noite.
    Nota: neste ponto, a incubação pode ser estendida por até três dias se necessário. Manter as seções protegidas da luz envolvendo as placas em folha de estanho durante este incupasso bation e, posteriormente, como luz sacia fluorophores.

4. Dia 4: As seções de montagem

  1. lavar as seções três vezes em PBS-H pelo menos 20 min.
    Nota: Se o planejamento para a jusante ISH 19, corrigir as seções em paraformaldeído 4% para 1 h para garantir os tetrâmeros e anticorpos no lugar e depois lavar as seções duas vezes com PBS-H por 5 min cada.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado.
  2. Usar um pincel para transferir as seções para uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para não cutucar o tecido demais. Cubra cada seção com glicerol/gelatina contendo 4 mg/mL de n-propil galato ou outro meio de montagem, contendo um fluoróforo conservante. Cobrir com uma lamela.
  3. Armazenar os slides em um recipiente protegido contra luz slide em -20 ° C. Lave as placas de cultura de tecidos e remover os rótulos nas tampas usando álcool.
    Nota: As placas podem ser reutilizadas..

5. Aquisição de imagens de microscópio Confocal

  1. captura imagens de alta resolução com um microscópio confocal, usando o apropriado lasers e filtros para cada fluoróforo ( figura 1A e B).
    Nota: Neste exemplo, um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais) foi usado. Imagens foram coletadas usando o 561 nm laser em 20% de energia para as células de T de antígeno-específicas rótulo amarelo esverdeadas, o laser de 488 nm em potência de 10% para as células B CD20-expressando de rótulo verde e 640 nm laser em 15% de energia para as células T CD8 de longe com rótulo vermelho. Utilizaram-se os 20 X objetivo e uma abertura numérica de 0,8.
  2. Sequencialmente coletar intervalos de z-série em 3 µm (ou outro) em três canais em vários campos de 800 x 800 pixels. Construir uma montagem dos campos coletados ( Figura 1 -E). Nomeie cada imagem de montagem com base nas informações do slide correspondente e salvar para análise.
  3. Realizar a análise quantitativa de imagem usando o software de análise e quantificação do respectivo microscópio confocal ou ImageJ.

6. Análise quantitativa de imagem

Nota: análise quantitativa de imagem pode ser realizado usando software de análise e quantificação do microscópio confocal ou usando o software ImageJ. Aqui, o ImageJ foi usado como exemplo.

Montagem de
  1. aberto por confocal arrastando-o para a janela do ImageJ ( Figura 2A).
    Nota: ImageJ pode abrir diretamente montagens coletadas por muitos diferentes microscópios confocal. Se a montagem não pode ser aberta diretamente pelo ImageJ, exportar o z-scan selecionado como um arquivo TIFF para abri-la
  2. Duplicar o z-scan selecionado para análise (" imagem "-> " duplicar ") ( Figura 2B).
  3. Dividir os diferentes canais (" imagem "-> " cor "-> " Split canais ") ( Figura 2).
  4. Desenhar o ROI da análise quantitativa no canal correspondente para ser objectivo e adicioná-lo ao gerente do ROI pressionando " T " no teclado. Medir a área de.
    Nota: O Gerenciador de ROI do ImageJ mostra a área em µm 2 ( Figura 2D).
  5. Ajustar o brilho da fluorescência e contraste do canal a ser analisado (" imagem "-> " ajuste "-> " brilho/contraste ") ( Figura 2E).
  6. Achatar o ROI na imagem (" Gerenciador de ROI "-> " Flatten ") ( Figura 2F).
  7. Quantificar as células positivas a imagem usando o " multi-ponto " ferramenta ( Figura 2).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 1 mostra como coletar imagens confocal, usando um microscópio confocal. A Figura 2 demonstra a análise quantitativa de imagem usando o ImageJ. Figuras 3 e 4 mostram representante imagens dos tecidos do nó de linfa de uma SIV infectado macaque do rhesus manchado com tetrâmeros de MHC e CD8 anticorpos anticorpos CD20 e servem para demonstrar a especificidade da MHC-tetrâmero de coloração. ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano, rato, ou out...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede a partir do National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
central de tetrâmero demonômero MHC-INIH Materiais para preparação de MHC-tetrâmero
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Materiais para preparação de MHC-tetrâmero
Soro de cabra normalJackson Immunoresearch005-000-121
Baixa agassede fusão PromegaV3121
HeparinaSigma-Aldrich
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreiaJ.T.Baker4204-05
Gelatina de glicerolSigma-AldrichSLBH2672V
galato de n-propilaSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Anticorpo instável, use alíquota
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vector6022201
cabra-a-m-A488 (1:2.000)Jackson Immunoresearch124083
cabra-a-rb-Cy3 (1:5.000)Jackson Immunoresearch106232
cabra-a-rato-Cy5 (1:5.000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
Placas de cultura de tecidos de fundo plano de 24 poçosFalcon353226
Lâmina de microscópioGlobe scienfitic Inc.#1321
Lâmina de barbearTed Pella, Inc121-6
Bisturi descartável de penasFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
Pincel redondo # 2PRINCETON ART & ESCOVA CO.4350RPode aparar conforme necessário com navalha
Microscópio ConfocalOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus
Instalação SLBL6391Vcongelada de uso único

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519(2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679(2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561(2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Colora o In SituImunohistoqu micaMicroscopia ConfocalCitometria de FluxoSeccionamento de TecidosFixa o com Paraformalde doAnticorpos Conjugados com Fluoresc nciaImagem em S rie Z

Artigos relacionados