Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Resumo

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Resumo

Analisar tróficas é essencial para uma melhor compreensão dos ecossistemas. Por exemplo, comida web interações podem sofrer graves alterações causadas pela invasão de espécies não-nativas. No entanto, a identificação exata das interações predador-presa de campo é difícil em muitos casos. Essas análises são frequentemente baseadas em uma avaliação visual do conteúdo do intestino ou a análise de isótopos estáveis (δ¹⁵N e δ¹³C). Esses métodos exigem conhecimento abrangente sobre, respectivamente, diversidade morfológica ou assinatura isotópica de organismos individuais presas, levando a obstáculos na identificação exata dos organismos de rapina. Análises de conteúdo Visual intestino especialmente subestime organismos suave rapina encorpado, porque maceração, ingestão e digestão de presas organismos dificultam a identificação de espécies específicas. Portanto, estratégias de reação em cadeia (PCR) com base de polimerase, por exemplo o uso de primer grupo específico define, fornecer uma ferramenta poderosa para a investigação de interações web de comida. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para investigar o conteúdo do intestino dos consumidores de macroinvertebrados do campo usando conjuntos específicos de grupo primário para ácido desoxirribonucleico de ribosomal nuclear (rDNA). DNA pode ser extraído a partir de espécimes inteiro (no caso de pequenos táxons) ou do conteúdo do intestino de espécimes coletados no campo. Presença e eficiência funcional dos modelos de DNA precisam ser confirmada diretamente do indivíduo testado usar primer universal define visando a respectiva subunidade de DNA. Também demonstramos que presa consumida pode ser determinada mais para baixo ao nível de espécie através de PCR com primers de grupo específicas sem modificações combinadas com análises de polimorfismo (SSCP) conformação subsequente único fio usando géis de poliacrilamida. Além disso, mostramos que o uso de corantes fluorescentes diferentes como rótulos permite rastreio paralelo de fragmentos de DNA de presas diferentes grupos de várias amostras de conteúdo intestino através de análise automatizada de fragmento.

Introdução

Interações predador-presa, que constituem a maioria da comida da web dinâmica e interações tróficas, são aspectos fundamentais para caracterizar os fluxos de matéria e energia ao longo de teias de alimento dentro e entre os ecossistemas, o que é um dos principais objetivos da ecologia ¹. a determinação da fonte e fluxo de carbono e nutrientes é promover a compreensão da conectividade ecológica entre ecossistemas². No entanto, os ecossistemas, tais como rios e suas bacias hidrográficas, não estão ligados somente por fluxos de matéria orgânica e nutrientes, mas também pelos movimentos de organismos³. Assim, alterações de habitat, interrompendo o fluxo de recursos que associam esses sistemas podem fortemente alterar as teias alimentares de ambos os ecossistemas, não só diretamente, mas também indiretamente alterando a respectiva composição das comunidades de predador-presa. Por exemplo, alterações de teias alimentares foram mostradas para ser ligado aos movimentos de predador única espécie (por exemplo, truta arco-íris)⁴. Tais alterações potencialmente ameaçam a biodiversidade e o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Portanto, analisar interações predador-presa no campo é essencial para determinar o impacto das mudanças ambientais induzidas pelo homem, tais como as práticas de gestão de água, sobre a biodiversidade nativa dos ecossistemas aquáticos.

Desde ligações tróficas de rastreamento é difícil em sistemas complexos, várias abordagens foram estabelecidas que permitem a avaliação da alimentação interações no campo⁵. Tradicionalmente, as investigações de interações no campo de alimentação baseiam-se na identificação visual dos restos de presas nas entranhas dissecados e exigem um amplo conhecimento sobre diversidade morfológica presa. Análises de conteúdo Visual intestino forneceram introspecções na utilização dos recursos de vários grupos de consumidores (por exemplo, variação sazonal na dieta de lagosta peixe e^{6 7,8} ou alimentando preferências de copépodes). No entanto, o processo físico de digestão dificulta as análises de conteúdo visual do intestino e perde geralmente suave rapina encorpado-organismos⁹. Para a alimentação de espécies por ingestão de líquidos ou para alguns consumidores invertebrados que fragmentá intensamente sua comida antes de ingestão, como anfípodas, identificação visual das espécies de presas no conteúdo do intestino é impossível¹⁰. Devido a essas limitações, a análise molecular fornece uma alternativa promissora.

Análises moleculares tornaram-se uma ferramenta comum permitindo a deteção de presa rápida e precisa no conteúdo do intestino. A variedade de tais técnicas é diversa: estratégias baseadas em anticorpos monoclonais ou reacções em cadeia do polymerase (PCR) são frequentemente usadas, por causa de sua alta especificidade e sensibilidade¹¹. O desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais é demorada e de custo, portanto, a aplicação de outras técnicas moleculares é mais útil quando os anticorpos já não existem¹¹. Outra abordagem comum é a amplificação das regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA), como o ácido ribonucleico ribossômico (RNA) genes presentes na maioria das espécies, usando primer universal define^12,13. Ao usar essa técnica, muitas vezes não é possível identificar toda a gama de organismos presas dentro de fontes mistas de DNA¹⁴. Uma abordagem eficaz para evitar tal uma desvantagem é usar primer grupo específico define para análises de conteúdo genético do intestino. Projetado para amplificar apenas as regiões de ADN de determinados grupos-alvo e excluir todas as outras espécies^15,16, primers específicos de grupo possibilitam a identificação de organismos de rapina no nível taxonômico dos grupos especificados sem análises secundárias de tempo - e onerosos. No entanto, como todos estripá-análise de conteúdo, tais análises fornecem apenas um instantâneo do comportamento alimentar. Portanto, combinar as análises de conteúdo intestino molecular com análises de traçadores naturais-integração de tempo (por exemplo, isótopos estáveis) é considerado benéfico^1,2.

Aqui, descrevemos um método detalhado de inquéritos baseados em PCR de interações predador-presa usando conjuntos de cartilha de grupo específicas para as regiões de ADN (rDNA) ribosomal nucleares deve ser combinada com análises de isótopos estáveis do mesmo espécime. Descrevemos a detecção de DNA de rapina única grupos através de eletroforese em gel de agarose. Além disso, apresentamos uma oportunidade para ainda mais a jusante análises de produtos PCR de tais primers específicos de grupo aplicáveis sempre que uma resolução taxonômica maior do que a especificidade dos primers é necessária. Porque o único encalhado DNA (ssDNA) fragmentos de conformações terciário de forma que são determinadas pela sua sequência primária¹⁷, pequenas variações em fragmentos amplificados por tais cartilhas específicas do grupo levam a mudanças conformacionais. Tais mudanças podem ser detectadas pelas análises de polimorfismo (SSCP) único filamento conformação com géis de poliacrilamida^17,18, permitindo uma identificação mais precisa de organismos de presa (até ao nível de espécie).

Enquanto a eletroforese em gel de agarose é uma ferramenta comum e de baixo custo para visualizar os fragmentos de DNA e determinar seu comprimento aproximado¹⁹, a resolução depende da quantidade de DNA e o corante de coloração usado²⁰. Geralmente, a visualização é direta quando se trabalha com amostras de DNA puras, mas potencialmente baixas quantidades de rapina DNA no conteúdo do intestino dos consumidores pode complicar a Pontuação dos resultados de eletroforese de gel de agarose. Ainda, esse método de deteção é viável para a tela de um baixo número de espécimes de consumidor do campo para um ou alguns grupos de presas, mas complicação o artilheiro faz a seleção de um número elevado de amostras para vários táxons de presas extremamente tempo intensivo e, portanto, impraticável. Um método de deteção mais sensível é a análise automatizada de fragmentos através de eletroforese capilar, que além disso permite a determinação do comprimento exato de fragmentos²¹. Vários microssatélites com base em estudos têm mostrado que usando diferentes corantes fluorescentes como rótulos, é possível detectar e determinar diferentes fragmentos de comprimento comparável por fragmento automatizado análise^{22,23, 24}. Portanto, apresentamos também um protocolo detalhado para a deteção paralela do DNA de várias presas grupos usando PCR com rotulado primeira demão específicas do grupo de moda e deteção através de análise de fragmento automatizado com um sequenciador automático. Além disso, apresentamos os resultados de um estudo de caso, demonstrando que a detecção de DNA de presas através de análise automatizada de fragmento é uma abordagem que também permite uma quantificação relativa de presas ingeridas.

Protocolo

1. coleta de macroinvertebrados do campo e preparar as amostras para análises de conteúdo genético Gut.

1. Coleta de macroinvertebrados em cada local, resolver indivíduos da espécie de consumidores de interesse nos tubos simples e diretamente, congelá-los em nitrogênio líquido ou gelo seco para evitar afastamento do intestino e degradação do DNA.
   Nota: Evite armazenar as amostras em álcool, porque alguns macroinvertebrados tendem a regurgitar antes o álcool mata-los.
2. Use somente o trato gastro-intestinal de grande e médio porte (aproximadamente > mm 3) espécies de macroinvertebrados para análises de conteúdo genético do intestino para que a matéria restante da amostra pode ser usada para outros procedimentos (por exemplo, isótopo estável análise). Note que isto não é aplicável quando investigando táxons muito pequenas como água ácaros. Portanto, as etapas 1.2.1 e 1.2.2 podem ser puladas.
   1. Ligeiramente descongelar um indivíduo e dissecar cuidadosamente seu trato gastro-intestinal sob um estereomicroscópio usando pinça fina de aço inoxidável. Certifique-se de não perfurar o trato gastro-intestinal para evitar a perda de matéria.
   Pinça de
   2. limpe usando solução de descontaminação para remover contaminações de DNA e RNA após a preparação de cada trato gastro-intestinal. Portanto, incube o fórceps para 10 min na solução de descontaminação. Depois, enxague com água estéril para remover traços residuais e limpe-os com uma toalha de papel fiapos.
   3. Transferência do trato gastrointestinal dissecado para uma reação de bloqueio seguro de 2,0 mL do tubo com tampão de extração de sal 440 µ l (é possível 450 µ l para o uso da pipeta repetitivo) [SEB; 0,4 M de cloreto de sódio (NaCl), 10 mM Tris (hidroximetil)-aminometano cloridrato (Tris-HCl) pH 8.0 e sal de dissódico do ácido etilenodiaminotetracético 2mm desidratam pH (EDTA) 8.0]. Loja preparada amostras em − 20 ° C, imediatamente até a extração de DNA. Certifique-se de que dentro de alguns dias será extraído DNA.
3. Usar um protocolo de extração de elevado-sal modificado ²⁵ para extrair DNA.
   1. Tirar amostras do congelador. Usar fórceps para adicionar uma esfera de aço inoxidável de 5mm para cada tubo de amostra e deixar as amostras congeladas no banco à temperatura ambiente (RT) para descongelar. Use um moinho de esfera para homogeneizar as amostras por 1 min em 15 Hz.
   2. Spin para baixo de amostras com um curto prazo de uma centrífuga. Usar pipetas microlitro para adicionar 90 µ l (100 µ l possível para o uso da pipeta repetitiva) de sódio Dodecil sulfato de sódio solução a 10% (SDS) e 5 µ l de proteinase 10mg/mL K.
   3. Vortex amostras cuidadosamente e incuba as misturas por 1h a 60 ° C, com agitação constante a 400 rpm em um thermomixer. Além disso, completamente vórtice amostras cada 10min para promover Lise.
   4. Spin para baixo de amostras com um curto prazo de uma centrífuga, adicionar 350 µ l de 5 M NaCl, com uma pipeta microlitro e vórtice abundantemente durante aproximadamente 0,5 - 1 min. Centrifugar as amostras por 40 min 16.200 x g no 5 ° C.
      Nota: Se vários conjuntos em uma linha tem que ser feito, o ajuste da temperatura do centrifugador deve ser ligeiramente elevado (não superior a 10 ° C) porque SDS tende a flocular se a temperatura for muito baixa.
   5. Uso microlitro pipetas para transferir cerca de 600 µ l sobrenadante para um novo tubo de reação de 1,5 mL. Tenha cuidado para não retirar nada a pelota.
   Grânulos
   6. inox ponta fora os tubos de reação em um coador de chá de aço inoxidável, limpe-os com água corrente e incube-os em uma placa de Petri com a solução de descontaminação por 10 min. enxaguar cuidadosamente a solução de descontaminação com estéril água e armazenar grânulos limpos em etanol (> 99%, grau p.a.) ou seco até reutilização.
      Nota: Limpeza de grânulos não precisa ser feito nesta etapa diretamente, mas um pouco pode ser feito sempre que há tempo de espera nas etapas a seguir.
   7. Adicionar 600 µ l de isopropanol gelado (grau de a.a.) para o sobrenadante com um microlitro pipeta e inverter cuidadosamente o tubo de um par de vezes. Armazenar as amostras durante a noite em -20 ° C.
   8. Tirar amostras do freezer e centrifugá-los por 20 min no 16.200 × g e temperatura de quarto. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e secar o tubo cuidadosamente com papel de seda de fiapos. Observe que se a temperatura for elevada (mais de 25 ° C), centrifugar a 5 ° C, para evitar as bolinhas escorregando ao descartar o sobrenadante.
   9. Lavagem pelotas contendo DNA com etanol a 70%. Para fazer isso, adicione 200 µ l de etanol gelado (70%, grau p.a.) usar uma pipeta microlitro e centrifugar as amostras durante 10 minutos a 16.200 x g e temperatura ambiente (ou 5 ° C, se necessário). Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e secar o tubo cuidadosamente com papel de seda de fiapos. Utilização de uma pipeta de 10 µ l ajustado a aproximadamente 8 µ l para pipetar cuidadosamente fora o sobrenadante restante. Certifique-se de não perturbar a pelota.
   10. Secar a pelota para cerca de 5 a 20 min a 60 ° C ou à temperatura ambiente no banco até que todos o etanol é evaporado.
   11. Pelota de dissolver em 50-100 µ l livre de nuclease (vapor esterilizados e tratada DEPC) água (ddH ₂ O), espere pelo menos 1 h (embora os melhores resultados serão obtidos durante a noite a 4 ° C).
   12. Medir a quantidade de DNA contido em cada amostra com um Espectrofotômetro de micro-volume, de acordo com o fabricante ' instruções s. Fazer uma diluição de trabalho de cada amostra contendo aproximadamente 2-10 ng DNA / µ l. manter a solução em estoque no freezer. Manter a solução na geladeira e certifique-se que a amostra mais o processamento é feito logo.

2. Verificar a eficiência funcional do DNA-extratos para a deteção subsequente de rapina recentemente ingerida.

1. Para garantir a presença e a eficiência funcional de modelos, testar cada extrato de DNA (passos 1.1 para 1.3.11) usar o primer universal define apropriada para a fonte de alimento respectivos (de invertebrados , por exemplo, ^{16 , 26}) que está direcionando a mesma subunidade nuclear como o primer grupo específico, usado para detecção subsequente de rapina ^{25 , 27}. As etapas a seguir referem-se ao uso de conjuntos de primer universal NSF1419/20 e NSR1642/16 ¹⁶ e LSU D1, D2 fw1 e LSU D1, D2 rev2 ou LSU D1, D2 rev4 ²⁶. Para provar que a reação de PCR tem sido bem sucedida e que não há contaminação ocorreu, use um controle positivo contendo DNA que já tinha sido ampliado com êxito e uma amostra de controlo contendo ddH ₂ O em vez de DNA dentro de cada PCR executar.
   1. Para preparar a primeira demão soluções de trabalho que contêm uma concentração final de 10 µM de primer, pipetar a quantidade adequada da primeira demão respectivas ações solução e ddH ₂ O (dependendo da concentração da solução-mãe) em um tubo de reação fresca 1,5 mL utilizando micropipetas.
   2. Adicionar cartilhas, mistura de deoxynucleotide (dNTPs), amortecedor da reação, Taq DNA polimerase e ddH ₂ O em um 1,5 ou 2,0 mL (dependendo do número de amostras a serem processadas) tubo da reação, então vórtice esta mistura. Detalhadas de volumes para a mistura de reação padrão para uma reação de PCR de 10 µ l são dadas na tabela 1 (para obter detalhes dos produtos químicos utilizados, consulte Tabela de materiais).
   3. Uso microlitro pipetas para transferir cada 1 µ l de DNA extrair em 9 µ l do thmistura de reação padrão e dentro de um tubo PCR (ou um bem de uma placa PCR). Fechar o tubo de reação ou nos poços de reação da placa (com listras cap).
   4. Programa do thermocycler: é o protocolo padrão para o conjunto de primeira demão NSF1419/20 e NSR1642/16 ¹⁶: 94 ° C por 4 min (desnaturação), seguido de 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 50 ° C (temperatura do recozimento) por 30 s, 72 ° C para 90 s e uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Para a primeira demão LSU define ²⁶, use o seguinte: 94 ° C por 4 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C por 20 s, 52,5 ° C, durante 20 s, 72 ° C por 90 s e uma extensão final a 72 ° C por 8 min.
   5. Lugar da polimerase ou placas para o thermocycler, feche a tampa do reciclador e iniciar o respectivo programa.
   6. Prepare um agarose 1,5% do gel usando uma solução tampão contendo Tris base, ácido bórico e EDTA (amortecedor de TBE) e agarose. Para a preparação de um gel de agarose 1,5%, usando uma gel de bandeja de fundição com dimensões totais de 10 × 7,5 cm × 3 cm, pesa 0,45 g agarose num erlenmeyer, usar uma proveta graduada para medir 30 mL de tampão de x TBE 1 (89 mM Tris pH 7,6, o ácido bórico 89 mM e 2 mM EDTA, pH 8.0) e deite-o no Erlenmeyer. Aqueça a mistura usando um microondas. Pare o microondas sempre que haja grandes bolhas e cuidadosamente agite o frasco até que a solução tem apenas uma fase.
   7. Arrefecer a solução para cerca de 60 ° C, agitar o frasco num banho de água. Rapidamente despeje a solução em uma bandeja de fundição de gel, remover as bolhas de ar e inserir os pentes. Esperar cerca de 20 min até gel é endurecido.
   Unidade de eletroforese
   8. preenchimento com 0.5 x TBE e inserir gel de fundição da bandeja que contém o gel de agarose. Certifique-se que o gel de slots são livre de bolhas de ar.
   9. Spin para baixo os produtos PCR usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Use uma pipeta microlitro misturar cada 3 µ l de produto PCR com 1 µ l de 6 x carregamento tintura (40% de sacarose e 0,25% bromofenol) e carregá-lo nas ranhuras do gel do gel do agarose. Pipete 1,5 µ l de uma escada de DNA bp 100 para um slot de cada linha com uma pipeta microlitro como tamanho padrão. Substitua a tampa da unidade de electroforese corretamente e ligar os fios para uma fonte de alimentação. Funcione o gel a 100 V/cm por 35 min.
   10. Para preparar um banho de coloração, despeje 1.000 mL de 1 x TBE numa caixa quadrada plástica impermeável à luz. Adicionar 50 µ l de brometo de etídio com uma pipeta microlitro, feche a tampa da caixa de plástico e agitá-lo para garantir a distribuição igualitária de brometo de etídio.
   11. Retire o gel da unidade de eletroforese e colocá-lo para o banho de coloração por aproximadamente 10 min. Em seguida, tomar o gel de banho de coloração e coloque-a sobre um sistema de documentação do gel e visualizá-lo de acordo com o manual.
   12. Analisar amostras única que mostraram resultados positivos (fragmentos de tamanho adequado visual em gel de agarose) em termos de presença e eficiência funcional de modelos para a deteção subsequente de rapina recentemente ingerida.

< t d > 0.25 μl de de

PCR-mistura	solução de trabalho de concentração	Mix para 10 reação de PCR µ l	concentração Final no PCR
Primer FW	µM 10	μl 0.5	0.5 µM
Primer RW	10 µM	0.5 & #956 ; l	0,5 µM
amortecedor da reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16mm (NH4) 2SO4 e concentrações finais de 2 mM MgCl2)	1 µM	1 μl	1 µM
dNTP	10mm	0,25 mM
5 U	Taq polimerase	0,1 μl	0.05 U
ddH 2 0		6,65 μl
< stro ng > Total mistura de reacção quantidade		9 μl
DNA		1 μl

Tabela 1: protocolo para a preparação da mistura de reação padrão para uma reação de PCR de 10 µ l detalhado.

3. detectar presas recentemente ingeridos alimentos/com conjuntos de Primer grupo específico usando electroforese em Gel.

1. Realizar PCR usando que a solução de trabalho de DNA extrai (preparado de acordo com passos 1.1 para 1.3.11) e o conjunto de primer grupo específico (sem rótulo, ou seja, sem modificação) apropriado para o grupo de presas alvejado como descreveram em 2.1.1 a 2.1.3 os passos (por variações na mistura de reação para o conjunto da respectiva cartilha, ver tabela 2). Executar o PCR usando o protocolo padrão dado na etapa 2.1.4 (para recozimento de temperaturas para o conjunto da respectiva cartilha, ver tabela 2).
   1. Usar um controle com DNA puro de um espécime pertencentes ao grupo de destino correspondente (controle positivo) e um controle negativo com DNA puro da espécie do consumidor em cada PCR executar.
2. Verificar o sucesso da reação de PCR utilizando eletroforese em gel de agarose descrito nos passos 2.1.6 para 2.1.11. A reação de PCR foi bem sucedida, se um fragmento de tamanho apropriado (ver quadro 2) é visível para o controlo positivo, mas não para o controle negativo. Se um ou ambos destes critérios estão insatisfeitos, repetir a PCR.
3. Uso agarose gel eletroforese, conforme descrito nas etapas 2.1.6 para 2.1.11, para detectar se o grupo de presas alvo tinha sido consumido pelo consumidor diferentes espécimes testados (através de julgamento se o fragmento de tamanho apropriado é visível ou não). Certifique-se de não perder fragmentos com baixa resolução visual.
4. Produtos de PCR de loja a 4 ° C, se mais análises serão concluídas dentro as próximas 24 horas, ou a-20 ° C, se as análises devem ser executadas mais tarde.

4. Determinar posteriormente consumidas presas ainda mais a jusante usando análise SSCP através do Gel de Polyacrylamide.

1. Prepara um gel do acrilamido de 9% para a electroforese do SSCP. Preparar as soluções de trabalho em uma capa de laboratório.
   1. Para preparar uma solução de trabalho de acrilamida 200ml, encher uma proveta com 20 mL de 10 x TBE (109 g da base Tris, 55 g de ácido bórico e 40 mL de EDTA de 0,50 M, pH 8.0, dissolvido em 1000 mL de DDQ ₂ O) e outro com 45 mL de 40% (29:1) mistura de acrilamida. Despeje a mistura TBE e acrilamida num frasco graduado (uma garrafa de vidro graduado com uma marca de 200 mL é também apropriada aqui) e adicione ddH ₂ O até a marca de 200 mL. Continue trabalhando solução na geladeira (4 ° C) até que seja necessário. Não use solução de trabalho de mais de uma semana.
   2. Pesar 0,1 g de persulfato de amónio (APS; uso um equilíbrio com uma precisão pelo menos 0,01 g) para um balão aferido de 1 mL e dissolver ele adicionando ddH ₂ O até a graduação marcar para preparar uma solução de reserva 10% APS. Transferir alíquotas (aproximadamente 350 µ l) para tubos de reação fresca.
      Nota: Uma alíquota é necessária para cada gel de poliacrilamida. Armazenar o restante aliquOTS-20 ° c e descongele apenas alíquotas logo antes que eles são necessários.
   3. Montar uma fita de gel de comprometida de duas placas de vidro, um branco e um vidro entalhado (cada 20 cm x 20 cm), com espaçadores (1,5 mm de espessura) entre eles subindo dos lados do vidro. Use cada três clipes de dobra-back (32mm) do lado direito e esquerdo para fixar a fita de gel ( Figura 1).
   4. Mix 5 g de agarose e 250 mL de 1 buffer de x TBE em um Erlenmeyer para preparar a solução para um agarose 2% gel. Aquecer e arrefecer depois mistura conforme descrito nas etapas 2.1.6 e 2.1.7. Rapidamente, despeje a solução em uma caixa de plástico em forma de quadrado (21 x 6,5 cm x 5 cm) e coloque a extremidade inferior da fita gel (etapa 4.1.3) para a solução de agarose. Ajuste os clipes de dobra-back na extremidade inferior da fita gel a uma altura para que sentam-se na borda da caixa plástica quadrada ( Figura 1). Espere aproximadamente 20-30 min até que o plugue de agarose completamente endureceu.
   5. Preencher um 100ml de medição do cilindro com a solução de trabalho de acrilamida (etapa 4.1.1) até a marca de 60ml e coloque a solução em um béquer. Use uma micropipeta para adicionar 300 µ l de uma alíquota da solução estoque de APS (etapa 4.1.2) e posteriormente adicionar 37,5 µ l de tempted (TEMED). Rapidamente, despeje a solução entre as placas de vidro da fita gel. Alternativamente, injetar a solução entre as placas de vidro com uma seringa descartável de 100ml com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l ajustada na cabeça de injeção da seringa.
   6. Insira cuidadosamente um pente padrão espessura de 1,5 mm na extremidade superior entre as placas de vidro. O pente deve ser cercado pela solução da metalurgia. Espere aproximadamente 1 h até que o gel de poliacrilamida é polimerizado. Evitar a ventilação durante a polimerização, na medida do possível, porque aumenta o tempo necessário para o gel polimerizar.
      Nota: É possível armazenar géis fundidos dentro de sacos de plástico selados com um lenço molhado na geladeira até 3 dias.

Figura 1: imagem ilustrando o construção para derramar o gel de poliacrilamida. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coloque a fita de gel, contendo o gel de poliacrilamida, preparado, em uma unidade de eletroforese vertical. Preenchimento da unidade de eletroforese com a quantidade adequada de 0.5 x TBE e fixe a unidade até 10 ° C, usando um circulador refrigerado (dependendo do tipo de unidade de electroforese).
3. Para desnaturação do ADN, Preaqueça um bloco térmico /-reciclador de 96 ° C. Prepare buffer de desnaturação com 95% formamida (grau de 99.5% a.a.) e 5% solução aquosa contendo 0,25% de bromofenol e 40% (p/v) de sacarose.
4. Levar os produtos PCR fora da geladeira ou freezer e descongele-os. Spin para baixo os produtos PCR usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Em seguida, misture a cada 4 µ l de um produto PCR com 4 µ l de tampão de desnaturação. Aqueça a mistura por 5 min a 96 ° C, imediatamente seguido por uma etapa de resfriamento em água gelada por 10 min.
   Nota: As amostras devem ser carregadas para o gel de poliacrilamida (etapa 4.5) imediatamente após este.
5. Retire o gel de poliacrilamida (etapa 4.1.6) pente e use uma micropipeta para carregar completamente cada amostra em um slot de gel. Execute eletroforese em 8 W por gel enquanto constantemente de refrigeração da unidade de electroforese para 10 ° C. executando o tempo necessário depende do tamanho do fragmento a ser separados. Para tamanhos de fragmento de aproximadamente 210 bp, uma duração de cerca de 3,5 h considera-se adequado.
6. Para preparar um banho de coloração, despeje 1.000 mL de 1x TBE em um plástico quadrada caixa impermeável à luz e adicionar 30 µ l de coloração tintura (adequada manchar o único ADN encalhado) com uma pipeta microlitro. Feche a tampa da caixa de plástico e agitá-lo para assegurar a distribuição igual da tintura coloração.
7. Remover a fita de gel da câmara de eletroforese e separar cuidadosamente a placa de vidro entalhado do gel. Deslize o gel de poliacrilamida da placa de vidro em branco para o banho de coloração. Coloque o coloração banho em um gel de plataforma e mancha agitação por 20 a 30 min com agitação constante.
8. Tomar o gel cuidadosamente fora da banheira de coloração e coloque-a sobre a mesa de UV de um sistema de documentação.
   Nota: Devido à instabilidade do gel é aconselhável manipular o passo prévio com duas pessoas. Uma pessoa segurará o coloração banho próximo à tabela de UV e outro deve chegar sob o gel com as duas mãos, levá-lo para fora e deslize-o sobre a mesa UV.
9. Fechar a tampa ou porta do sistema de documentação e tirar uma fotografia de acordo com o fabricante ' manual de instruções s.

5. Detectar múltiplos ingeriram recentemente grupos de presas em paralelo usando análises automatizadas fragmento.

1. Analisar o conteúdo do intestino DNA extrai usando o primer grupo específico 16 define determinado na tabela 2, com um primer de um conjunto rotulado devido a modificação com um corante de coloração (ver tabela 2 coluna intitulada modificação) e usar os métodos de detecção paralelo de um sequenciador automático.
   1. o uso da solução de trabalho de extratos de DNA (preparados de acordo com passos 1.1 para 1.3.11) e conduta separar PCRs para cada primeira demão definida como descrito nos passos 2.1.1 para 2.1.5 (variações na mistura são apresentadas na tabela 2). Use pelo menos um controle com DNA puro de um espécime pertencentes ao grupo de destino correspondente (controle positivo) e um controle negativo com DNA puro da espécie do consumidor em cada PCR executar.
   2. PCRs executar no thermocycler usando o protocolo PCR padrão dado na etapa 2.1.4, ajustado para a respectiva temperatura do recozimento (e número de ciclos) para cada primer conjunto determinado na tabela 2.
      Nota: Utilize a mesma alocação de DNA dos poços de reação para PCR com cada um dos 16 cartilha diferentes conjuntos para simplificar subsequente partilha dos produtos PCR para loteados automatizada de análises fragmento.
   3. Loja PCR produtos a-20 º C até todos os PCRs pertencentes a um lote para a análise automatizada de fragmento (ver tabela 2) está acabada. Manter os produtos de PCR no escuro e não armazená-los mais de 1 semana antes da análise do fragmento.

tabela 2: detalhes dos 2 lotes de 15 pares específicos de grupo primário estabelecido pelo Koester et al (2013) e o par de primer Jae28S recém-projetado amplificar regiões do rDNA 18S ou 28S de 16 grupos-alvo de macroinvertebrados aquáticos. f, primers para a frente; r, primers reversos; 18s, cartilha destina-se a subunidade de 18S rDNA; 28s, cartilha destina-se a 28S subunidade de rDNA. " Hydrobiologia, é Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) um ' camarão assassino ' no sistema Rio Reno?, 768, 2016, tabela S1, material suplementar página 2, Koester Meike Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internacional de publicação Suíça 2015) " com permissão de Springer. clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

2. para detectar os fragmentos amplificados de todos os conjuntos de 16 cartilha conduzir análises automatizadas fragmento em 2 lotes descritos na tabela 2. Usar um padrão de tamanho interno (DNA tamanho padrão Kit - 400 [Grupo B] e - 600 [Grupo A], respectivamente) para determinar o comprimento do fragmento. Prepare a placa de sequenciamento e sequenciador automático conforme descrito nas etapas a seguir. Note que este procedimento pode ter que ser ajustada se usando uma outra plataforma do que o indicado na tabela de materiais.
   1. Para executar cada lote-amostra, prepare uma mistura contendo solução de carregamento da amostra (SLS) e o respectivo tamanho padrão. Pipetar 21,6 µ l de SLS e 0,4 µ l de DNA tamanho padrão Kit - 600 por amostra do lote A e, respectivamente, com 21,7 µ l de SLS e 0,3 µ l de DNA tamanho padrão Kit- 400 por amostra do lote B.
   2. Levar os produtos PCR de 8 PCRs pertencentes ao respectivo lote do freezer e descongele-os. Certifique-se de que ainda são mantidos no escuro.
   3. Usar uma pipeta microlitro para carregar o número de poços de uma placa de sequenciamento necessários (número de amostras a serem analisados) com cada 22 µ l da mistura respectiva descrita na etapa 5.2.1. Spin para baixo os produtos PCR de cada um dos 8 PCRs usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Transferir cada 1 µ l por produto PCR de cada um dos 8 PCRs para os respectivos poços da placa de sequenciamento com uma pipeta microlitro.
   4. Cuidadosamente spin para baixo esta mistura dentro da placa de sequenciamento com um curto prazo de uma centrífuga mini placa e sobreposição de cada um dos poços utilizados com uma gota de óleo mineral. Preencher poços de reacção respectivos de uma placa de reserva com 250-300 µ l de tampão de separação do DNA.
   5. Usar o software para o sequenciador capilar para criar uma configuração de amostra de acordo com o fabricante ' instruções s. Atribua os métodos para controlar conjuntos de amostra e determinar a sequência de métodos a serem usados para processar dados (ver tabela 3 para a execução de condições adequadas para uso com o padrão de tamanho dado na Tabela de materiais). Note-se que é crucial que a repartição das amostras dentro da configuração de amostra corresponde a alocação da amostra na placa de sequenciamento (incluindo controles positivos e negativos, consulte a etapa 5.1.1) e que o método adequado para fragmento analisa com os respectivos tamanho padrão é escolhido.
   6. Encha uma bandeja de umectação com água desionizada e insira a placa de sequenciamento, placa de reserva e umectante bandeja no sequenciador capilar. Inserir um cartucho de gel que contém uma quantidade suficiente de gel fresco da separação do DNA que é necessário para executar o exemplo. Verifique a placa de sequenciamento usando a configuração de amostra preparada.

	desnaturar		separe		Capilar	injetar
	Temperatura	tempo	tensão	tempo		tensão	tempo
tamanho padrão 600	90 ° C	120 s	4.8 kV	60 min	50 ° C espera para Temp: Sim	2.0 kV	30 s
tamanho padrão 400	90 ° C	120 s	6 kV	45 min	50 ° C espera para Temp: Sim	2.0 kV	30 s

tabela 3: condições específicas para as análises do fragmento sobre o sequencer automatizado usando os padrões de tamanho dados na tabela de materiais.

3. para analisar os resultados exportar dados brutos e carregar os dados para um programa de análise de fragmento. Escolher a tintura padrão ordens de cor do respectivo fabricante para definir os canais de cores de tintura.
   1. Criar um painel no intervalo esperado do comprimento do fragmento amplificado por um único primer grupo específico de estrutura de tópicos define dentro de um lote de acordo com o manual do usuário do programa.
   2. Para processar os dados, selecione o respectivo painel adequado tamanho padrão, cor padrão e tipo de análise e executar o procedimento. Escolha a opção electroferograma para exibir as intensidades de sinal fluorescente de instrumentos de eletroforese capilar como um traço da linha única para cada cor de tinta. Conjuntos de marcadores/primer serão exibidos indicando o intervalo respectivo fragmento e o comprimento exato do fragmento detectado associado com o centro de cada pico chamado será destacado (na maioria dos programas por coloração ou nome atribuído) automaticamente.
   3. Para cada amostra, calcular como estreitamente a amostra ' s interno tamanho padrão coincide com o padrão de tamanho selecionado para tranquilizar o sucesso da chamada tamanho. A maioria dos programas de análises de fragmento tem uma opção para automaticamente calcular e visualizar esta partida. Se o chamado tamanho falhou, repita o fragmento análises para as amostras.
   4. Visualmente verificar novamente a electroferograma de cada amostra e confirmar/unconfirm cada pico chamado para cada marcador/primer definido separadamente. Inserir manualmente picos desnecessário que preenche os critérios de um conjunto de marcador/primer ou excluir erradas de acordo com o manual do usuário do programa utilizado. Aplicar o nome de tamanho ou bin de pares de base no ' alelo rótulo '. Calcular e exibir as especificações de pico no ' tabela de pico '.

Resultados

Usamos com sucesso as etapas descritas neste protocolo para análises de dieta dentro de diferentes estudos. Nesta seção, apresentamos exemplos descrevendo a aplicabilidade das diferentes secções do protocolo.

Por exemplo, para demonstrar a eficácia dos conjuntos específicos de grupo primário estabelecido pelos autores²⁸ e o potencial de mais a jusante as análises de produtos PCR por análises SSCP, foi con...

Discussão

Aqui, apresentamos um método fácil e custo-eficiente para determinação de PCR-baseados de interações predador-presa de amostras de campo através de cartilhas específicas do grupo para as regiões de rDNA, que podem ser combinadas com outras análises non-molecular dos mesmos espécimes. No entanto, existem várias etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, assegurando a especificidade dos primers usados é essencial. Em segundo lugar, é fundamental evitar contaminação e perda de material de conteúdo intestino dur...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
nitrogênio líquido	Qualquer	NA	Para transporte de amostras de campo de macroinvertebrados para o laboratório.
Tubos de reação de 1,5 ml - Safelock	Any	NA	Para coleta de amostras de consumo no campo e posterior conservação em tubos de reação de nitrogênio líquido não precisam necessariamente ser limpos por PCR. Para evitar a explosão dos tubos, a tampa dos tubos deve ser perfurada com uma agulha.
Estereomicroscópio	Qualquer	NA	Certifique-se de que a ampliação seja adequada para preparar o trato gastrointestinal do tamanho do consumidor de interesse.
Placas de Petri	Qualquer	NA	Para dissecar o trato gastrointestinal de amostras de consumo sob o estereomikroscópio.
Foceps de aço inoxidável: Pinça Dumont No. 7	Bioform	B40d	Esta pinça curva de aço inoxidável às vezes pode ser muito útil para manter a amostra fixa entre a parte curva sem perfurar o trato gastrointestinal.
Focep de aço inoxidável: Pinça Dumont Eletrônica nº 5	Bioform	B40b	Esta pinça fina de aço inoxidável é ideal para a preparação do trato gastrointestinal de espécimes de consumo.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Solução de descontaminação para a remoção de contaminações por DNA e RNA
de papel sem penugem	Qualquer	de laboratório NA
Qualquer	precisão	NA	precisa ser de pelo menos 0,01 g.
Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	Quaisquer	NA
Safe-Lock 2,0 ml	VWR	211-2165	É crucial que estes tubos de reação estejam livres de inibidores de DNA, DNase, RNase e PCR (PCR clean)!
Tubos Safe-Lock 1,5 ml	VWR	211-2164	É crucial que estes tubos de reação estejam livres de inibidores de DNA, DNase, RNase e PCR (PCR clean)!
Cloreto de sódio ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	Para tampão de extração de sal (SEB) e solução de NaCl 5M necessária para extração de DNA.
Tris(hidroximetil)-aminometano Tris	carlroth	4855.2	Para tampão de extração de sal (SEB) e tampão TBE
Pipetas de microlitro (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	carlroth	8043.1	Para tampão de extração de sal (SEB) e tampão TBE
Ácido bórico ≥ 99,8 %, a.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	Para tampão TBE. Não é necessário se for obtido tampão TBE disponível comercialmente.
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	carlroth	4360.1	Para extração de DNA
proteinase K liofil.	carlroth	7528.1	Preparar uma solução de trabalho contendo 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Moinho de esferas para homogeneização das amostras.
Contas de aço inoxidável, 5 mm	Quiagen	69989	Para homogeneização de amostras.
Aquecimento Thermoshaker	Qualquer	misturador de
	Qualquer	NA
Centrífuga refrigerada: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Centrífuga refrigerada usada para centrifugação durante a extração de DNA (Protocolo 1).
Isopropanol	carlroth	6752,5
Etanol 99,8 %, a.a.	Qualquer	de NA
Grau de biologia molecular (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	água livre de nuclease (esterilizada por fluxo e tratada com DEPC) usada para ressuspensão de DNA e sempre que referida a ddH2O dentro do manuscrito
Olegonucleotídeos não modificados	Eurofins MWG Operon	NA	Primers não rotulados
Olegonucleotídeos	modificadosMetabion International AG	NA	Primers rotulados
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive para misturas de reação PCR (tampão de reação Y e S, dNTPs e MgCl2)
Termociclador de gradiente avançado Primus 96 ou peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Os conjuntos de primers foram originalmente estabelecidos em um termociclador de gradiente avançado Primus 96. Como este ciclador era bastante antigo, verificamos se nossos conjuntos de primers são eficientes e específicos nas mesmas condições usando o peqSta96x (que também poderia simular o modelo mais antigo). No entanto, os testes mostraram que nossos primers funcionam bem e ainda são específicos (ver Koester et al. 2013) sem usar a simulação da máquina antiga.
Placas de PCR padrão de 96 poços	VWR Peqlab	732-2879	Usado para reações de PCR.
Faixas de tubo de baixo perfil 0,15 ml com listras de tampa plana	VWR Peqlab	732-3223	Listras de tampa usadas para fechar as placas de PCR.
Agarose	Peqlab	35-1020	Usado para eletroforese em gel.
Microondas	Qualquer	balão
	Qualquer	NA
Cilindro de medição	Qualquer	NA
Unidade de eletroforese horizontal e respectivos pentes com dentes	Qualquer	NA	Para eletroforese em gel de agarose.
Fonte de alimentação de eletroforese PS3002	Life Technologies	NA
Solução de brometo de etídio 1 %	carlroth	2218.1	Usado para preparar banho de coloração para géis de agarose.
Formamida	carlroth	6749.1	Necessário para o tampão de desnaturação para análises SSCP.
Azul de bromfenol	AppliChem	A3640.0010	Necessário para o corante de carregamento para eletroforese em gel de agarose.
Carlroth	de sacarose	4621.1	Necessário para o corante de carregamento para eletroforese em gel de agarose.
100 bp-DNA-Ladder estendido	carlroth	T835.1	Como padrão de tamanho para eletroforese em gel de agarose.
Sistema de documentação UV	Qualquer	NA	Para visualizar os resultados da eletroforese em gel.
Rotiphorese NF-Acrilamida/Solução de Bis 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	Para a preparação de géis de poliacrilamida.
Peroxidissulfato de amônio	carlroth	9592.2	Para a preparação de géis de poliacrilamida.
clipes dobráveis (32 mm)	Qualquer	NA	Para a preparação de géis de poliacrilamida.
caixa de plástico quadrada (21 &vezes; 6,5 &vezes; 5 cm)	Qualquer	NA	Para a preparação de géis de poliacrilamida.
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	carlroth	23.67.1	Para a preparação de géis de poliacrilamida.
Béquer	Qualquer	chiller digital NA
RC 10	VWR	462-0138	Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Unidade de eletroforese vertical P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	Para análises SSCP usando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Placa de vidro entalhada	VWR	730-0261	Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Placa de vidro em branco	VWR	730-0260	Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Espaçadores	VWR	730-0262	Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Pente com 25 dentes	VWR	730-0294	Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.
Plataforma de agitação	Qualquer	NA	Para agitação constante do banho de coloração.
Mancha de ácido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	Para coloração de géis de poliacrilamida.
Kit Padrão de Tamanho de DNA GenomeLab 400bp	AB Sciex	608098	Para análises automatizadas de fragmentos. Padrão de tamanho para o lote B.
Kit Padrão de Tamanho de DNA GenomeLab 600bp	AB Sciex	608095	Para análises automatizadas de fragmentos. Padrão de tamanho para o lote A.
Solução de Carregamento de Amostras (SLS)	AB Sciex	608082	Para análises automatizadas de fragmentos.
Placa de sequenciamento - 96 Poços de polipropileno PCR Microplate	Costar	6551	Para análises automatizadas de fragmentos.
Centrífuga de placas, centrífuga de mini placas PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	usada para desfiar produtos de PCR.
Placa tampão - 96 poços EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	Para análises automatizadas de fragmentos.
GenomeLab Tampão de separação	AB Sciex	608012	Para análises automatizadas de fragmentos.
Gel de Separação - LPAI	AB Sciex	608010	Para análises automatizadas de fragmentos.
Sequenzer - CEQ8000 Sistema de Análise Genética	Beckman Coulter	NA	Para análises automatizadas de fragmentos.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	Para analisar os resultados de análises automatizadas de fragmentos.