Artigo de método

Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo

DOI:

10.3791/56141

⸱

10 de dezembro de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ovário é o principal órgão do sistema reprodutor feminino e é essencial para a produção de gametas femininas e para controlar o sistema endócrino, mas as relações estruturais complexas e arquiteturas tridimensionais (3D) vasculatura do ovário não são bem descritas. Para visualizar as conexões 3D e arquitetura dos vasos sanguíneos no ovário intacto, o primeiro passo importante é tornar o ovário opticamente claro. Para evitar o encolhimento do tecido, usamos o hidrogel baseado em fixação passiva CLARITY (lipídios claro-trocadas rígida do acrilamido-hibridizado imagem / Immunostaining/In situ da hibridação-compatível com hidrogel de tecido) método para limpar um ovário intacto de protocolo . Immunostaining, avançado do multiphoton microscopia confocal e imagem-reconstruções 3D foram então usados para a visualização dos vasos ovarianos e capilares foliculares. Usando essa abordagem, mostrou uma correlação positiva significativa (P < 0,01) entre o comprimento dos capilares foliculares e volume da parede folicular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O folículo é a unidade estrutural e funcional fundamental do ovário, e seu desenvolvimento está altamente relacionada com a vasculatura dentro do ovário. Vasos sanguíneos fornecer nutrição e hormônios para os folículos e, portanto, desempenhar um papel importante no crescimento e maturação dos folículos1.

Uma combinação de tecnologias, incluindo marcadores seletiva dos vasos sanguíneos, modelos do rato transgénico e desenvolvimento farmacêutico, aumentaram nosso conhecimento sobre redes vasculares no ovário, angiogênese e a função dos vasos sanguíneos Foliculogénese. O ovário é conhecido como um órgão ativo porque ele remodela vários tecidos e redes vasculares durante Foliculogénese e ovulação. Tal ativo remodela o tamanho e a estrutura dos vasos é necessária para a função biológica de desenvolvimento e de recrutamento de folículos.

Métodos tradicionais de histológica e histomorfométrica usando seções no ovário e immunolabeling dos vasos sanguíneos estão limitados a imagens bidimensionais (2D)2. Com o desenvolvimento de tecnologias de reconstrução tridimensional (3D), imagens em 2D de fatias de tecido podem ser sobrepostas para fazer uma estrutura 3D, mas esse método ainda tem algumas limitações — corte do tecido pode destruir as microestruturas, algumas partes do tecido são muitas vezes ausentes, e significativo trabalho está envolvido em fazer reconstruções 3D a partir de imagens obtidas de fatias. Imagem 3D todo-tecido com microscopia confocal pode ultrapassar muitas dessas limitações, mas esses métodos limitam-se à avaliação da angiogênese no ovário embrionário3. Usar o tecido inteiro limpando métodos tais como clareza4 pode aumentar o volume visualizado a fim de resolver estes problemas nos ovários pós-natal e adultos, e tais métodos fornecem acesso óptico do ovário sem deformações estruturais. Imagem da arquitetura 3D do ovário intacto fornece um banco de dados de imagem exata para software de análise de imagem, tais como o pacote de software hottie utilizado neste trabalho.

Remodelação do ovário durante a vida adulta é parte de um sistema fisiológico dinâmico, e isso faz com que o ovário um excelente modelo para investigações sobre a regulação da angiogênese. Além disso, avaliar o papel de vasos ovarianos em condições patológicas do sistema reprodutor feminino, tais como a síndrome do ovário policístico ou cancros ovarianos pode ser estudada através da imagem do tecido ovariano toda. O desenvolvimento do método passivo clareza e o uso de software de análise avançada de imagens apresentaram informações espaciais detalhadas sobre as relações entre os vasos sanguíneos e ovário estruturas tais como folículos.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais seguiram as orientações do Comitê de ética Animal em Xangai Medical College, Universidade de Fudan (número de aprovação 20160225-013).

1. preparação do ovário Mouse transparente

  1. Preparação das soluções
    1. Preparar a solução de tampão fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) com 0,1% Triton X-100 (PBST). Para fazer 1 L de solução estoque de PBS x 10, misture 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O e 28,7 g de Na2HPO4 ·12H2O. Adicionar dH2O distilada ~ 2 h. ajustar para pH 7,4 e 1 L com 1 N de NaOH e armazenam à temperatura ambiente. Diluir esta solução estoque 10 x por 1/10 usando O dH2e depois fazer 0,1% Triton X-100 em PBS.
    2. Prepare a solução de hidrogel (pH 7,5) por mixagens 4% (wt/vol) solução de paraformaldeído (PFA), 4% (wt/vol) acrilamida, bisacrylamide 0.05% (wt/vol) e iniciador de VA-044 0,25% (wt/vol) em água bidestilada no gelo.
    3. Prepare a solução de limpeza (pH 8,5) pela mistura de 200 mM de tampão de borato de sódio contendo 4% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água bidestilada.
  2. Preparação de perfusão e ovário Transcardial
    1. Mantenha todas as soluções no gelo durante todos os procedimentos.
    2. Anestesia tipo selvagem feminino adulto C57BL/6 rato com uma injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital (0,35 mg/kg). Uma vez que ele não mostra nenhuma resposta do dedo do pé-pitada, o mouse corretamente é anestesiado.
    3. Uso de fita adesiva para fixar o mouse com os membros esticada sobre uma placa plana da espuma.
    4. Expor o coração por uma incisão no processo xifoide, através do tórax, pele e ossos, com uma tesoura.
    5. Fazer uma incisão no átrio direito do animal e em seguida perfundir o ventrículo esquerdo com 20 mL de PBS gelado 1 x 10 mL/min.
    6. Perfundir o animal com pelo menos 20 mL de solução de hidrogel em 10 mL/min.
    7. Incise a pele ao longo do abdômen ao longo da linha de medioventral com uma tesoura, que expõe o enterocoelia inteiro, e remover os intestinos. Recolha os ovários, bem como o útero para manter a integridade da morfologia ovariana.
    8. Remova os tecidos de gordura ao redor do ovário sob um microscópio.
  3. Desgaseificação
    1. Coloque os ovários em 10 mL de solução de hidrogel a 4 ° C para fixação por 3 dias.
    2. Transferência do ovário em um tubo de 5 mL e encher o tubo com solução de hidrogel. Esticar o parafilm sobre a parte superior do tubo e em seguida, enrole parafilm ao redor do pescoço do tubo.
      Cuidado: Certifique-se que não há nenhuma bolha entre o parafilm e a solução de hidrogel.
    3. Coloque o tubo num agitador na incubadora a 37 ° C por um período máximo de 3 h para permitir que o hidrogel polimerizar.
    4. Remover o ovário do gel usando uma espátula e remova cuidadosamente o excesso de gel ao redor do ovário por lenços de papel. Lave o ovário quatro vezes com PBS 1x.
  4. Compensação passiva
    1. Submergi o ovário em 10 mL da solução de limpeza. Agite suavemente a 80 rpm a 37 ° C para iniciar o processo de compensação.
    2. Na primeira semana, altere a solução em 3 dias. Depois de uma semana, atualize a solução de limpeza uma vez por semana até o ovário torna-se claro. Geralmente este processo demora cerca de 2-3 semanas.
      Nota: O ovário pode ser diretamente immunostained ou pode ser armazenado em azida de sódio (0,02%) em PBS a 4 ° C, durante várias semanas antes de imunocoloração.

2. imunocoloração

  1. Lave o ovário duas vezes em PBST no dia 1 a 37 ° C, um agitador.
  2. Incubar o ovário num agitador na solução de anticorpos primários/PBST (tabela 1) no dia 2-3 a 37 ° C. No trabalho apresentado aqui, os anticorpos primários foram a molécula de adesão plaquetária-endothelial da pilha 1 (CD31) e tirosina hidroxilase diluído em 01:10 e 01:50 em PBST, respectivamente.
    Cuidado: Se são usados dois ou mais tipos de anticorpo primário, certifique-se que existem diferentes fontes animais.
  3. Lave os anticorpos primários com tampão PBST a 37 ° C no dia 4, um agitador.
  4. Incube o ovário com os desejado anticorpos secundários em PBST no dia 5-6 a 37 ° C, um agitador. O trabalho aqui apresentado, os anticorpos secundários foram Alexa 488 farinha para tirosina hidroxilase e Alexa farinha 594 para CD31 diluído em 01:50 em PBST.
  5. Lave os anticorpos secundários com tampão PBST a 37 ° C no dia 7 um agitador.
  6. Transferi o tecido para índice de refração correspondente solução para homogeneização de índice de refração no dia 8. Colocar o tecido em um papel com linhas de grade para verificar sua clareza visual, verificando se as linhas de grade podem ser vistas. Uma vez que o tecido tem sido totalmente esclarecido, isso pode ser fotografado.
  7. Faça um cilindro de massa que poderia envolve apenas o tecido e então moldá-la em forma de ferradura e pressione o cume exterior firmemente na placa de vidro para fazer um espaço fechado. A altura da massa deve ser um pouco mais alta do que o ovário.
  8. Coloque o ovário esclareceu cuidadosamente no centro do putty e adicionar solução de correspondência de índice de refração. Coloque um prato fundo de vidro sobre o putty firmemente e use massa para consertar o prato.

3. Confocal da microscopia

  1. Para a imagem latente com um microscópio confocal, no painel "Ni-E" escolha a lente (em imersão neste caso água 25 X lente objetiva, 1.1-NA, 2 mm-WD) com a distância de trabalho adequada (nesse caso 2,0 mm).
  2. No painel de "Aquisição", selecione o número de canais. Aqui, use três canais.
    1. Primeiro, use a guia "porto de olho" e o joystick de controlador XY para mover o tecido para o centro do campo, verificando através das oculares do microscópio.
    2. Depois de desligar a luz do obturador, clique na guia "ao vivo" para ajustar o "poder do laser", "HV (ganho)", e "deslocamento" para cada canal separadamente. Maior potência do laser e a alta tensão podem levar a sinais de maiores e maior deslocamento pode reduzir o ruído de fundo.
    3. Selecione o tamanho adequado"Scan" e "Count". Use um tamanho de varredura de 1024 x 1024 µm2 e uma contagem de 4 a 8.
  3. Depois de definir a qualidade de imagem para definir a profundidade do tecido no painel "Correção de intensidade de Z" e depois localizar a lente na camada superior do ovário (no centro do tecido) e ajuste a aquisição para a camada superior, clique o "plus" botão para definir a camada superior.
    1. Mover a lente para baixo e definir o HV apropriado e poder do laser para a parte inferior do tecido e adicionar as informações de camada mais baixas na tabela de correção de Z-intensidade. Clique em "Ao ND" para sincronizar a configuração com o painel de "Aquisição de ND".
  4. Painel em "ND aquisição", primeiro conjunto, o número de digitalização passos. Em seguida, marque as guias "Z" e "Imagem grande".
    1. Vá para a janela de "Varredura de imagem grande" para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido com a ajuda de visualização do tecido através das oculares. Volte para o painel de "Aquisição de ND" para o tamanho da área de digitalização ("campos") de entrada e escolha a sobreposição entre 10% e 15%.
    2. Clique em "Run Z correção", não "executar agora", para automaticamente definir o HV, poder do laser e deslocamento apropriado para cada camada e esperar a imagem processar.

4. 3D reconstrução de folículos individuais e seus Vasculatures

  1. Primeiro, use o ImageJ5 para abrir o arquivo original do NIS. Clique no botão "Imagem" e escolher a "cor" e os canais de"Split". Em seguida, clique em "Arquivo" e salve separadamente os canais como série de arquivo tiff usando a opção de "Sequências de imagem" em "Salvar como".
  2. Use Imaris para abrir uma das séries de arquivo tiff. Clique no botão "Editar" e escolha "Adicionar canais" para adicionar o resto dos canais. O nome e a cor do canal podem ser alterados nas guias "Ajuste de tela". A espessura do tecido talvez precise ser corrigido no painel "Propriedades da imagem" na lista drop-down sob "Editar".
  3. Para o corte das imagens finais e remoção de excesso peças 3D, clique no botão "Editar" e escolha "Crop 3D". O tamanho do campo pode ser ajustado arrastando a borda.
  4. Para reconstruir os sinais de navio com o algoritmo de filamentos no painel Surpass, clique no botão "Filamentos" para criar um novo filamento e clique em Avançar.
    1. Para definir o maior e o mais fino diâmetro, vá para o painel de "Fatia" e encontrar o navio de rastreamento. A distância será automaticamente mostrada no painel "Medida", selecionando dois pontos com a largura máxima da embarcação.
    2. Voltar para o painel "Surpass" e a medida largura de entrada e clique em Avançar.
  5. Ajuste o limite de ponto de partida e sementes. No painel "Câmera", escolha "Selecionar". Se algumas das esferas automaticamente produzidas precisam ser removidos, Pressione shift e clique no ponto. Escolhendo a "Navegar" e movendo o mouse, a estrutura pode ser girada para garantir que todos os pontos corretos foram mantidos e clique em Avançar.
  6. Escolher o limite mais alto para o contraste local e clique em Avançar. Não selecione "Detectar espinhos" e continuar finalizar a reconstrução do cilindro vaso sanguíneo. A cor pode ser editada clicando na aba "Cores". Os dados estatísticos podem ser extraídos no painel "Estatística" do filamento reconstruído. Peças em excesso podem ser removidas do painel de "Editar".
    Nota: Outros algoritmos podem ser usados para medir o volume dos folículos totais ou paredes foliculares. O trabalho aqui apresentado, os oócitos foram marcados pela autofluorescência de ambos os anticorpos secundários. Devido à grande quantidade de dados, utilizou-se um servidor de estação de trabalho para a análise de dados.

5. análise estatística

Nota: Dados de análise de imagem são apresentados como média ± erros-padrão.

  1. Realizar comparações entre os folículos usando teste t de amostras independentes e usar o teste de correlação de Pearson para comparar os coeficientes de correlação da parede folicular e comprimento capilar. Definir um valor de P < 0,05 como o limite de significância estatística.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptamos o método passivo de clareza em um método rápido e simples para limpar enquanto preserva a arquitetura folicular e vascular e obtendo o maior sinal fluorescente de marcadores rotulados de navios e folículos do ovário passivo. A arquitetura 3D da vasculatura folicular foi determinada por imunocoloração para CD31, um marcador para células endoteliais6. CD31 coloração nos ovários de camundongos adultos foi rastreado usando o algoritmo de filamento e mostrou a...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No estudo atual, apresentamos a imagem para avaliar as relações entre os capilares e folículos de crescimento individuais 3D. Em nosso trabalho anterior, usando o mesmo protocolo n º 9, estudamos os papéis de grande vascularização, interações entre os folículos e a localização de folículos nos ovários intactos do mouse. A abordagem passiva de clareza nos permitiu estudar macro e micro --vasculatures, Foliculogénese e as inter-relações entre o alaranjado e folículos, bem como para reconstruir a arq...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi suportado por subvenções do fundo especial chinesa para pós-docs (n º 2014T70392 de YF), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n º 81673766 de YF), o novo fundo de escorva de professor, a Fundação de Zuoxue da Universidade de Fudan e o desenvolvimento Projeto de Shanghai pico medicina integrativa-disciplinas (20150407).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcrilamidaVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Diluição 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Diluição 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrilamidaAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Prato de fundo de vidro de parede preta (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Ácido bóricoSinopharm Reagente químico10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Reagente Químico10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm BemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldeídoSinopharm Químico Reagente80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1 / CD31, molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias 1 (Diluição 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Fotoiniciador VA044Wakova-044 / 225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Azida de sódioSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
Cloreto de sódio (NaCl)Reagente químico Sinopharm10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH < sub>2< / sub>PO4< / sub> 2H < sub>2< / sub > O)Reagente químico Sinopharm20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Dodecil sulfato de sódioSinopharm Reagente Químico30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Hidróxido de Sódio (NaOH)Sinopharm Reagente Químico10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Reagente Químico30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tirosina hidroxilase (TH, Diluição 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

Referências

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3D ReconstructionMultiphoton Confocal MicroscopyImmunostaining CD31Follicular CapillariesHydrogel FixationTissue ClearingImage Analysis

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