Method Article

Solubilidade de Compostos Hidrofóbicos em Solução Aquosa Usando Combinações de Peptídeos Automontados e Aminoácidos

DOI:

10.3791/56158

⸱

September 20th, 2017

 ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, University Health Network, 2Department of Pediatrics, British Columbia Children's Hospital & University of British Columbia, 3Institute of Medical Science, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um meio clinicamente aplicável de dissolver compostos hidrofóbicos em um ambiente aquoso, usando combinações de montagem auto soluções de peptídeos e aminoácidos. Nosso método resolve uma limitação importante da terapêutica hidrofóbica, desprovidas de meios seguros e eficientes de solubilidade e entrega métodos em situações clínicas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptídeos auto-montagem (SAPs) são veículos promissoras para a entrega da terapêutica hidrofóbica para aplicações clínicas; suas propriedades de anfifílicos lhes permitem dissolver compostos hidrofóbicos no ambiente aquoso do corpo humano. No entanto, soluções de peptídeo auto-montagem tem compatibilidade de sangue pobre (e.g., baixa osmolaridade), dificultando sua aplicação clínica através de administrações intravenosas. Recentemente desenvolvemos uma plataforma generalizada para a entrega da droga hidrofóbico, que combina sucos com soluções de ácido aminado (SAP-AA) para aumentar a solubilidade da droga e aumentar a osmolaridade de formulação para atingir os requisitos para usos clínicos. Esta estratégia de formulação foi exaustivamente testada no contexto de três compostos hidrofóbicos estruturalmente diferentes – PP2, rottlerin e curcumina – a fim de demonstrar a sua versatilidade. Além disso, examinamos os efeitos das variações de componentes de formulação, analisando 6 sucos diferentes, 20 aminoácidos existentes naturalmente em concentrações baixas e altas e dois diferentes co-solventes dimetil sulfóxido (DMSO) e etanol. Nossa estratégia provada para ser eficaz na otimização de componentes para uma determinada droga hidrofóbica e função terapêutica do inibidor formulado, PP2, observou-se tanto em vitro como em vivo. Este manuscrito descreve nosso método de formulação generalizada usando combinações de SAP-AA para compostos hidrofóbicos e análise de solubilidade como um primeiro passo para o potencial de uso destas formulações em estudos mais funcionais. Nós incluir resultados representativos de solubilidade para formulação da curcumina composta, hidrofóbica e discutir como nossa metodologia serve como plataforma para futuros estudos biológicos e modelos de doença.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sucos são uma classe de biomateriais que tem sido estudada extensivamente como andaimes 3D na medicina regenerativa,1,2,3,4. Mais recentemente, no entanto, eles têm sido explorados como veículos para a entrega da terapêutica devido a suas propriedades biológicas únicas5,6,7,8. RPUS naturalmente montam em nanoestruturas estável9, proporcionando assim um meio de proteção e encapsulamento de drogas. Sucos são anfifílicos, composto por um padrão específico de repetições de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, dirigindo seus auto-montagem de9,10 e permitindo-lhes servir como um meio entre hidrofóbica e hidrofílica ambientes. Consequentemente, para a entrega de clínica de fármacos hidrofóbicos – que têm extremamente baixa biodisponibilidade e absorção no corpo devido à falta de solubilidade em ambientes aquosos11,12 – sucos são promissores como uma entrega veículo. Além disso, o seu padrão de sequência também implica que sucos podem ser racionalmente concebidos e projetados para maximizar a compatibilidade com qualquer determinada droga ou composto (ou seja, com base em grupos funcionais) e ajudar ainda mais a solubilidade.

RPUS foram aplicados como veículos de entrega de droga eficaz em muitos in vitro e in vivo configurações13,14,15,16. Eles também têm demonstrado grande segurança e biocompatibilidade. No entanto, devido à baixa osmolaridade de preparações de SAP-droga, eles não podem ser usados para injeções intravenosas como em situações clínicas13. Considerando esta restrição, recentemente desenvolvemos uma estratégia que combina sucos com soluções de aminoácidos para reduzir o uso de solventes tóxicos co e aumentar a osmolaridade de formulação e, portanto, relevância clínica. Nós escolheu usar aminoácidos como eles são os blocos de construção de sucos, já são clinicamente aceitos, e em combinação com sucos, eles aumentam a solubilidade da droga hidrofóbico enquanto reduzindo a quantidade de SAP necessários17,18.

Podemos ter analisadas combinações de SAP-AA como uma plataforma generalizada de solubilidade da droga hidrofóbicas e subsequente entrega criando um pipeline de várias etapas de triagem e aplicá-lo ao inibidor Src, PP2, como um composto hidrofóbico de modelo. Neste processo, nós examinamos o efeito de alterar componentes da formulação – testes, finalmente, 6 sucos diferentes, todos os 20 aminoácidos em 2 concentrações diferentes (baixa e alta; baixo baseados em concentrações nas aplicações clínicas existentes e alta as concentrações foram 2x, 3x ou 5x a concentração clínica baseia-se a solubilidade máxima de cada aminoácido na água) e 2 diferentes co-solventes – e combinações selecionadas que solubilizado PP2 para posterior análise. Esta formulação de droga provou para ser eficaz como um veículo de entrega de drogas em cultura de células, bem como na vivo modelos usando administrações tanto intratraqueal e intravenosa. Da mesma forma, nosso trabalho focou a versatilidade de combinações de SAP-AA em múltiplas solubilizante, estruturalmente diferentes compostos hidrofóbicos em ambientes aquosos; especificamente, as drogas rottlerin e curcumina18. Este manuscrito descreve o método de formulação de SAP-AA e a análise de solubilidade de curcumina como exemplo da etapa principal no nosso pipeline de triagem. Este protocolo fornece uma maneira simples, pode ser reproduzida de tela para as combinações ideais de SAP-AA, que dissolvem qualquer determinado composto hidrofóbico.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação de soluções de aminoácidos

  1. preparar e rótulo dois centrifuga conico tubos de 50 mL para cada aminoácido (um de cada para ambos " baixa " e " alta " concentrações).
  2. Preparar um grande frasco de 2 L contendo água purificada (18,2 MΩ·cm a 25 ° C).
  3. Calcular a quantidade de cada aminoácido (em gramas) para atingir a concentração desejada e pesar a quantidade adequada de aminoácidos em seus tubos de centrífuga de 50ml respectivos usando uma espátula.
    Nota: Para a " alta " concentração dos dois aminoácidos com carga negativa, PBS é usado em vez de água. Não poderíamos aumentar suas concentrações devido a sua baixa hidrossolubilidade e usando PBS em vez de água ajuda a manter o pH baixo. Além disso, os cálculos de concentração foram obtidos utilizando um volume final de 40 mL para cada solução de aminoácido. Todas as concentrações de aminoácidos são descritas na tabela 3. Certifique-se de enxaguar a espátula entre aminoácidos para evitar contaminação. Recomendamos uma lavagem de água, seguida de limpeza com etanol a 70%.
  4. Adicionar 40 mL de água filtrada (ou PBS) em cada tubo de 50 mL com uma pipeta sorológica. Tubos e vórtice do tampão ou agitar vigorosamente até dissolver. Sonication banho de água (temperatura ambiente, 130 W, 40KHz) também pode ser usado para ajudar no processo de solubilidade.
    Nota: As seguintes soluções de aminoácidos são sensíveis à luz e deve ser cobertas com folha de alumínio: triptofano, fenilalanina e tirosina (que consistem em estruturas de anel aromáticas) e cisteína (reativa - SH agrupar).

2. Preparação das soluções SAP-AA

  1. preparar 20 mL frascos de cintilação para montagem automática de peptídeos. Para um determinado peptídeo auto-montagem, preparar um frasco por solução de aminoácido preparado (cada combinação será feita em um frasco separado).
  2. Usando uma balança analítica de alta performance (com uma legibilidade até 0,1 mg ou menos), pesa aproximadamente 1 ± 0,2 mg de peptídeo no fundo de cada frasco. Cap após a pesagem e registrar o peso exato do peptide sobre o Cap...
  3. Pipetar o volume adequado de solução de ácido aminado (preparado na secção 1) para cada frasco contendo peptídeos, para atingir a concentração desejada de auto montagem peptídeo (0,1 mg/mL para peptídeos longos com um comprimento de 16 aminoácidos, ou 0,2 mg/mL para peptídeos mais curtos com um comprimento de 8 aminoácidos).
  4. Sonicate por 10 minutos em uma água banho sonicador (130 W, 40KHz) à temperatura ambiente, garantindo as soluções dentro de frascos são completamente imerso no banho-maria a.

3. Preparação de drogas-DMSO ou droga-etanol Stock soluções

  1. Combine 1 mg da droga (no caso, a curcumina com 100% DMSO) e outra de 1 mg com 100% de etanol para criar duas soluções estoque.
    Nota: Nós adicionamos 200 µ l de DMSO e 400 µ l etanol DMSO-curcumina e etanol-curcumina existências que eram 5 mg/mL e 2,5 mg/mL, respectivamente, devido a variação de solubilidade em cada solvente; no entanto, é importante observar que a concentração de estoque deve ser ajustada dependendo da droga hidrofóbica de interesse. Fatores tais como a solubilidade da droga e eficaz concentração biológica são importantes na determinação deste valor. Também, mantenha na mente que as ações serão diluídas 100-fold e 50-fold em formulações de DMSO e etanol, respectivamente, quando combinada com soluções SAP-AA (ver secção 4). Isso pode ser preferido para preparar um maior volume de estoque, dependendo do número de formulações necessárias – neste caso, seria usado mais de 1 mg da droga. O estoque pode ser armazenado a-20 ° C; degelo no gelo e vórtice antes do uso.
  2. Vortex frascos por 15 s para dissolver completamente a drogas.

4. Preparação de formulações de drogas

  1. preparar claros, tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para cada formulação. Certifique-se de tubos de etiqueta com a pretendida auto montagem peptídeo, aminoácido (e concentração) e solvente co.
  2. Adicionar 10 µ l de estoque de drogas-DMSO ou estoque de drogas-etanol 20 µ l para tubos apropriado microcentrifuga.
  3. Adicionar 990 µ l das soluções ácidas de SAP-AA para o apropriado rotulado microcentrifuga tubos contendo ações de drogas-DMSO e 980 µ l para aqueles que contêm o estoque de drogas-etanol. Isto produz formulações de drogas de 1 mL com etanol a 1% DMSO ou 2%.
    Nota: A concentração final de todas as formulações de curcumina foi 0,5 mg/mL de acordo com o protocolo. Novamente, isto pode variar quando usando outros compostos hidrofóbicos e/ou começando com uma concentração diferente de estoque (ver passo 3.1)
  4. Vortex vigorosamente por 30 s e permitem formulações descansar por 30 min.

5. teste de solubilidade

  1. após o período de descanso, vórtice vigorosamente novamente por 30 s.
  2. Centrifugar as formulações a 14.220 x g por 1 min.
  3. Analisar o fundo do tubo para a precipitação microcentrifuga (por visualização).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para a droga hidrofóbica, curcumina, nós produzimos formulações usando todos os 20 existentes naturalmente aminoácidos em baixas concentrações, em combinação com apenas um SAP, EAK16-II, como uma prova de princípio. Nós também testamos formulações usando DMSO e etanol como co-solventes. No total, isso produziu 40 formulações de curcumina, cada um contendo diferentes componentes. É importante notar que, em nossos estudos anteriores usando o inibidor de Src, PP2, incluímos mais opções para ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O procedimento de formulação, existem várias etapas críticas e pontos a serem considerados na solução de problemas. Primeiro, como estamos trabalhando com vários componentes e concentrações, várias etapas de vórtice em todo o protocolo certifique-se de que todas as concentrações são uniforme e correto. Algumas das soluções de aminoácidos hidrofóbicos, de alta concentração podem ainda não estar completamente dissolvidas após a utilização do vortex, e neste caso, eles podem ser agitados vigorosamente à mão para ajudar no p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado por institutos canadenses de pesquisa em saúde, operando concede MOP-42546 e MOP-119514.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EAK16-ICanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: AEAKAEAKAEAKAEAK, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: AEAEAKAKAEAEAKAK, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: AEAEAEAEAKAKAK, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: FEFEFKFK, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
A6KECanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: AAAAAAKE, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
P6KECanPeptide Inc.de peptídeos personalizados: PPPPPPPKE, acetilação N-terminal e amidação C-terminal, >95% pura por HPLC
AlaninaSigma-AldrichA7469-100GL-Alanina
IsoleucinaSigma-AldrichI7403-100GL-Isoleucina
LeucinaSigma-AldrichL8912-100GL-Leucina
MetioninaSigma-AldrichM5308-100GL-Metionina
Prolina Sigma-AldrichP5607-100GL-Prolina
ValinaSigma-AldrichV0513-100GL-Valina
FenilalaninaSigma-AldrichP5482-100GL-Fenilalanina
TriptofanoSigma-AldrichT8941-100GL-Triptofano
TirosinaSigma-AldrichT8566-100GL-Tirosina
GlicinaSigma-AldrichG8790-100GL-Glicina
AsparaginaSigma-AldrichA4159-100GL-Asparagina
GlutaminaSigma-AldrichG8540-100GL-Glutamina
SerinaSigma-AldrichA7219-100GL-Serina
TreoninaSigma-AldrichT8441-100GL-Treonina
HistidinaSigma-AldrichH6034-100GL-Histidina
LisinaSigma-AldrichL5501-100GL-Lisina
ArgininaSigma-AldrichA8094-100GL-Arginina
Ácido AspárticoSigma-AldrichA7219-100GÁcido L-Aspártico
Ácido GlutâmicoSigma-AldrichG8415-100GÁcido
L-GlutâmicoCisteínaSigma-AldrichC7352-100GL-Cisteína
Dimetil SulfóxidoSigma-AldrichD4540-500ML
DMSO EtanolSigma-Aldrich277649-100MLCurcumina anidra
Sigma-Aldrich08511-10MGDroga hidrofóbica, curcumina
RottlerinEMD Millipore557370-10MGDroga hidrofóbica, rottlerin
PP2Enzo BML-EI297-0001Medicamento hidrofóbico,
frascos de cintilaçãoVWR2650-66022-081Vidro borossilicato, com tampa de rosca, 20 mL. Frascos para pesagem de peptídeos.
Tubos de centrifugação cônicos Falcon 50 mLVWR352070Polipropileno, Estéril, 50 mL. Para soluções de aminoácidos.
Sequência Sequência Sequência Sequência Sequência Sequência PP2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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